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Lokiarchaeota—弥补原核与真核生物进化上的裂隙
热度 1 BJQXKY 2015-5-9 23:48
沿北冰洋大洋中脊(ArcticMid-Ocean Ridge)的沉积物中发现了一组新的古菌(archaea),一种新的生命形式可能有助于解决困惑现代生物界最持久的一个谜团。 地球上的生物皆可以被分成原核生物和真核生物两大类,前者结构简单,后者常更加复杂。这两类生物细胞间存在差别的显著,对于如何通过进化实现两者间的跨越这一问题,生物学家一直迷惑未解。这类被命名为Lokiarchaeota的新微生物,就可能构成搭建两者间桥梁的作用。 原核生物包括所有细菌和古菌(archaea),它们都是单细胞物种,最初将古菌也归为细菌,后来将其单独分列了出来。真核生物除了一些单细胞生命形式外,更多是多细胞生物,包括动物,植物和真菌等。 原核生物和真核生物这两类生命形式间差距巨大,真核细胞拥有被脂外层包裹的细胞结构,细胞核中含细胞的遗传物质;另一个重要的结构是线粒体,多数真核细胞中都存在这种细胞器,它是细胞的电厂,负责供应能量。根据广泛接受的理论,线粒体原来是细菌,逐渐掺入真核细胞中,可能是一种互惠(mutualbenefit)共存的形式。 来自瑞典乌普萨拉大学(UppsalaUniversity)的Thijs Ettema说:古菌与真核细胞是姐妹,她们拥有共同的祖先,这已经是20年来的流行模式。一些年前,在进化树上真核生物的起源归到了古菌支上,更详细一些的话,附属于一个叫做TACK古菌的组。 Lokiarchaeota就归属于TACK组,且是与真核关系最接近的原核生物类。据Ettema的研究,在大约20亿年前,Lokiarchaeota与真核生物拥有共同的祖先。这一祖先拥有一个基因的“起始套件”(starterkit),拥有这一特性容其不断增加细胞的复杂性,进化形成今天缤纷的真核生物界。 Lokiarchaeota拥有部分编码仅在真核细胞中才出现的蛋白的基因,如支撑细胞形状和细胞运动的骨架蛋白基因。研究人员在黄石生态系统的热泉中寻找其它的Loki样(Loki-like)微生物,Lokiarchaeota中发现的这些与真核生物相同的基因并不证明它们就具有类似的功能。他们需要更多这类生物细胞,通过实验弄清楚这些基因在Lokiarchaeota中执行的功能。 “在海洋沉积物中获取这类样品并不容易,如此艰苦的环境下营养尤其匮乏,所以这些沉积物中细胞量尤其低。有些人预测在这种环境下的细胞可能要10年才分裂增殖一次,因此无法在实验室通过培养获取所需的细胞用量。” 研究人员正在其它地方寻找Loki样物种,包括在美国黄石的热泉中,和在新西兰。Ettema说他们甚至可能找到与真核生物之间拥有更近亲缘关系的Loki样物种。他们正努力重建这类物种的基因组序列,并发现复杂生命如何起源相关的其它的更多科学问题。 真核细胞进化的一个关键问题是线粒体的获取。Lokiarchaeota与其它的原核生物一样,也没有线粒体。因此,细胞何时与“能量工厂“的祖先发生了融合还是一个悬而未决的问题。 ThijsEttema说:“获得线粒体才意味者事件的起始开始,我们在Loki中发现的这些基因给提供了一些提示”,真核生物中一个十分重要的基因是肌动蛋白(actin)。 肌动蛋白具有多种功能,其中一个就是吞噬(phagocytosis),有了这种能力细胞才能吃掉其它细胞。ThijsEttema说他们在Loki中也找到了编码肌动蛋白的一些基因。虽然他们现在还不清楚它们在Loki中的功能,但是可以推断出Loki与真核生物共同的祖先也拥有这类基因。 http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14447.html Complex archaea that bridge the gap betweenprokaryotes and eukaryotes The origin of the eukaryotic cell remains oneof the most contentious puzzles in modern biology. Recent studies have providedsupport for the emergence of the eukaryotic host cell from within the archaealdomain of life, but the identity and nature of the putative archaeal ancestorremain a subject of debate. Here we describe the discovery of ‘Lokiarchaeota’,a novel candidate archaeal phylum, which forms a monophyletic group witheukaryotes in phylogenomic analyses, and whose genomes encode an expanded repertoireof eukaryotic signature proteins that are suggestive of sophisticated membraneremodelling capabilities. Our results provide strong support for hypotheses inwhich the eukaryotic host evolved from a bona fide archaeon, and demonstratethat many components that underpin eukaryote-specific features were alreadypresent in that ancestor. This provided the host with a rich genomic‘starter-kit’ to support the increase in the cellular and genomic complexitythat is characteristic of eukaryotes. 群晓科苑 Qbioscience.com
个人分类: 科苑进展|4630 次阅读|1 个评论
新闻 - 纽约大学人工合成染色体
benlion 2014-4-2 00:40
Mar 28, 2014 去年底我看到纽约大学公告, Langone 医学中心新成立系统遗传学研究所,当时写过信询问,也得到了积极回复,但忙于公司的事和一时犹豫而忘记了,今天突然想了解一下这个研究所的情况,却见到如下 3 月 28 日新闻报道: 美国纽约大学系统遗传学研究所发布, Dr Jef Boeke 领衔首次人工构建具有功能活性的酵母染色体。 经历过去 5 年的研究,科学家们构建了细菌染色体和病毒 DNA ;但是,这是首先人工合成的真核细胞染色体,这个具有功能活性的染色体命名为 synIII ,并成功整入到酵母细胞。人工构建的染色体 synIII ,包含 273,871 碱基对的 DNA ,比天然染色体小,变更了 500 多个碱基,去除了重复部分 47,841 碱基对,也移除了非编码蛋白质和随机移动的跳跃基因片段,同时加入标志 DNA 以之区别人工与天然染色体。 详细报道见: 新闻 - Researchers Create Artificial Eukaryotic Chromosome ( http://www.sci-news.com/biology/science-artificial-chromosome-01820.html 或 http://www.sci-news.com/ ) 和论文 - Total Synthesis of a Functional Designer Eukaryotic Chromosome ( http://www.sciencemag.org/content/early/2014/03/26/science.1249252 )等。 附:部分系统遗传学研究机构 German Network for Systems Genetics - http://www.helmholtz-hzi.de/de/forschung/forschungsprojekte/ansicht/projekt/projekt/genesys/ Resources for analyzing complex genetic traits - http://www.sysgen.org/ Short Course on Systems Genetics - http://cgd.jax.org/education/shortcourse.shtml 等。
个人分类: 2014y|1836 次阅读|0 个评论
[转载]真核细胞总RNA的提取与鉴定
jingjing2015 2013-6-6 15:56
【原理】 RNA的制备与分析对于了解基因表达在转录水平上的调节是必不可少的,也是最常使用的通过cDNA途径分析细胞基因表达的前提。通常一个典型的哺乳动物细胞约含10-5μg RNA,但其中大部分为rRNA及由tRNA,而mRNA仅占1%~5%。虽然mRNA大小和序列各不相同,但在多数真核细胞mRNA的3’末端都带有一段较长的多腺苷酸链。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。RNA分析其实是对组织细胞总RNA中的mRNA进行分析。最常用的方法主要有:原位杂交、RT-PCR、Northern ,另外还有: Sl 核酸酶作图分析、引物延伸法等。在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其他分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。 一、防止RNA酶污染的措施 1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。 2.塑料器皿可用01%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。 3.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室温10min,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。 4.配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经 滤膜过滤除菌。 5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。 6.设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。 二、常用的RNA酶抑制剂 1.焦磷酸二乙酯 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的眯唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。 2.异硫氰酸胍 目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。 3.氧钒核糖核昔复合物由氧化钒离子和核昔形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4.RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin) 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。 5.其他 SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 一、组织和细胞总RNA提取―异硫氰酸胍法 【操作】 1.样品处理 (1)培养细胞 收集细胞1~2×10 7 ,离心,5000g×5min。对于贴壁培养细胞,用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化后,PBS重悬细胞并转移至1Od离心管中;悬浮培养细胞可直接转移离心管;离心, 5000g×5mim PBS洗涤2次。弃上清,置冰浴。加预冷变性液2ml,充分摇动,使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。 (2) 组织 取1~2g组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置组织匀浆器中,加入预冷的变性液12ml,在冰浴中充分匀浆。 二、总RNA定量 RNA定量方法与DNA定量相似RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波长分光测定RNA浓度,OD值为1相当于大约40μg/ml 的单链RNA。如用1cm光径,用双蒸水稀释RNA样品n倍并以双蒸水为空白对照,根据此时读出的OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度: RNA (mg/ml) = 40×OD260 读数×稀释倍数(n)/1000。RNA纯品的OD260 /OD280 的比值为2.0,故根据OD260 /OD280 的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低,说明有残余蛋白质存在;比值太高,则提示RNA有降解。
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[转载]真核细胞基因组DNA的分离与纯化
jingjing2015 2013-6-6 15:49
真核细胞基因组DNA的分离与纯化 关键词: 真核 细胞 基因组 DNA 2013-03-30 11:23 来源: 丁香园 点击次数:37 DNA主要在细胞核内,核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真核细胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多,并且以 核蛋白 体形式存在于细胞中。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程,纯化则是去除体系中的其它成分,如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸(RNA)等生物大分子的过程。 一、裂解 细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切片等方法。为了获得大量完整的DNA,一般采用裂解液等温和的方法破碎细胞。 裂解液一般都含有去污剂 (如 SDS 、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris 、 EDTA 、NaCl 等)。去污剂的作用是通过使蛋白质变性,破坏膜结构及去除与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的作用,一方面提供一个合适的裂解环境 (如 Tris ),另一方面可抑制 核酸酶 在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA )、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 。裂解体系中还可以加入 蛋白酶 ;利用 蛋白酶 将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。 二、纯化 根据DNA本身的特征使用不同方法进行核酸提纯。 三、DNA提取的实验步骤 (一)材料与设备 1.试剂 消化液(100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris--HCl,pH8.0,25mmol/L EDTA,0.5% SDS ,0.1mg/ml蛋白酶K);pH8.0,25mmol/L EDTA;PBS;TES饱和酚;氯仿;异戊醇; 95%乙醇溶液;70%乙醇溶液;TE;0.1%SDS;1mu;g/ml RNA酶; 2.仪器 培养皿、 培养瓶 、微量 离心管 、滴管;刻度 吸管 ;加样器;枪头; 离心机 、液氮罐、组织匀浆器、恒温培养箱 (二)主要步骤 1.如果材料为组织块,可将组织块(约200~1000mg)剪碎后,置入液氮中。随后用冰冷的组织捣碎器捣碎,每100mg组织加入1.2ml消化液(100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris--HCl,pH8.0,25mmol/L EDTA,0.5%SDS,0.1mg/ml蛋白酶K)。 2.如果材料是悬浮细胞,收集细胞于微量 离心管 中,500g×5min离心;如果材料是贴壁细胞,弃上清后,胰酶消化收集细胞,500g×5min离心。随后用冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞,500g×5min离心,弃上清,重复一次,并用一倍体积的消化液重悬细胞。 3.组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中,50℃消化12~18h。 4.冷却至4℃,加等体积15 mo1/L TES饱和酚。 5.轻轻振摇,使水相和酚层充分混匀。 6. 4℃5000rpm~8000rpm离心15min~20min。此时DNA溶液在上层,酚位于下层,中间是变性蛋白层。 7.用 吸管 小心吸取上层粘稠溶液,移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白层。 8. DNA溶液再加等体积15 mo1/L TES饱和酚抽提一次,按6、7离心并吸至另一离心管。 9.加等体积氯仿/异戊醇按步骤(5、6)抽提,离心5min。 10.吸出DNA溶液后,再步骤(9)抽提一次。 11.用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中,冰浴至0℃。 12.加2.5倍体积95%冷乙醇震摇,可见DNA白色沉淀析出。 13.用75%冷乙醇清洗3~4次。 14.室温干燥或冷冻干燥DNA。 15.加适量TE溶液溶解DNA。 四、结果鉴定 1.紫外 分光光度计 检测:可检测DNA的纯度和含量。一般而言核酸在260nm时吸光度最大,而蛋白质在280nm时吸光度最大。取2mu;l DNA溶解液,适量稀释,紫外 分光光度计 测定260nm、280nmOD值,计算OD260/OD280比值,比值在1.7~2.0:1之间,说明DNA纯度可。在260nm处,1OD双链DNA的浓度为50mg /ml,据此可计算DNA的浓度(mg /ml)=50×(OD260) × 稀释倍数。 2.电泳检测:可检测核酸的完整性和大小。取2mu;l DNA溶解液与适量上样缓冲液混合后,经1% 琼脂 糖凝胶电泳。电泳结束后紫外光下观察,拍照;如果观察到一条清晰的电泳带,无明显的拖尾,说明DNA完整性好。
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[转载]美开发出为细胞重新编程新方法
crossludo 2012-8-8 11:30
美开发出为细胞重新编程新方法 可构建更复杂基因线路 据物理学家组织网近日报道,最近,美国波士顿大学和哈佛医学院、马萨诸塞州总医院合作,开发出一种给细胞重新编程、设计基因线路的新方法,能大大增加基因“零件”的数量,构建更大更复杂的基因网络。该方法不仅大大丰富了合成生物学家的工具箱,还能帮人们理解生物行为及其发展演变,发挥多种实际应用价值。相关论文在线发表于8月2日的《细胞》杂志上。 合成生物学的目标是通过把基因“零件”组装成“线路”, 在活细胞内部执行逻辑操作 ,造出有特殊功能的细胞,解决医药、能源和环境领域的关键问题。然而要实现这一目标,必须有更多可靠的基因零件,只靠“现成”的细菌基因是远远不够的。目前,大部分合成生物学家都是用现有 细菌的基因片段作组装零件 ,转移到其他真核细胞中来构建基因线路。 新方法提供了一种构建和分析真核细胞基因线路的新模式。研究人员用一种叫做“锌手指”的蛋白质与真核细胞本身的功能基因片段结合,“ 锌手指”蛋白经过编程后能与期望的DNA序列结合,形成的新零件具有模块化的性能, 可广泛用于多种功能设计当中。 通过模块零件来设计基因线路 ,摆脱了对现有细菌基因的依赖,能构建出更大更复杂的线路。 “我们的方法在治疗领域也有潜在应用,比如对与疾病相关的重要基因与基因网络进行动态修改和控制。” 该研究领导、波士顿大学生物医学工程师阿哈迈德·卡利尔说,其他医疗应用还包括:损伤与疾病的干细胞疗法、细胞内置工具、癌症及其他疾病早期诊断线路等。
个人分类: 医学前沿|1302 次阅读|0 个评论
与课本上不同的微生物知识,推荐Nat Rev Microiol综述一篇
热度 6 DNAgene 2011-8-22 17:03
很多人都知道,教材上的知识比较陈旧,国内中文教材的知识就更陈旧。 最近看了一篇 Nature Reviews Microbiology 的综述,感觉自己的知识太陈旧了。如果您的科研或教学与微生物分子生物学相关,看看这篇论文,考察一下自己的知识是否需要更新吧。 这里,我大概介绍此文的一些内容,但愿没出错。 1、一个操纵子包含的几个基因一起转录,各个基因之间的表达水平应该差不多。 错误。最近研究显示,操纵子内基因的表达水平像是下楼梯,从5'到3'一个比一个低。详细内容见这篇综述及其参考文献,下同。 2、真核生物mRNA转录后末端加上polyA,原核生物的mRNA没有这些加工。 错误。细菌细胞中,现在发现了很大比例的mRNA转录后加polyA尾巴。但是polyA尾巴的作用却是与在真核细胞中相反,是降低mRNA的稳定性。 3、细菌蛋白质翻译过程中,核糖体30S亚基先结合到mRNA的Shine-Dalgarno序列上,而后。。。 部分错误。对数生长期的细菌蛋白质翻译过程是这样的。但生长停滞的细菌,是完整的核糖体(大小亚基在一起)直接结合到起始密码子上,开始蛋白质翻译。 4、细菌基因的甲基化等修饰是为了区分自身的DNA和外来的DNA,为限制性内切酶提供识别信号。 不完全对。细菌基因的甲基化等修饰也有调节基因表达的作用。 5、真核生物染色质折叠紧密程度可以调节基因表达。原核生物DNA折叠疏松,似乎与基因表达调节无关。 错误。大量基因表达的快速生长期DNA折叠紧密一些。 6、细菌也有很大比例的基因存在反义链转录,并有证据显示细菌中存在类似于真核生物小RNA的基因表达调节方式。 7、细菌mRNA也不是随机分布在细胞中的。 如果无法下载全文,可 向作者索取 或者 发邮件找我帮助 。
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