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相关日志

简便、快捷、廉价的新冠病毒检测方法
yanjx45 2020-8-8 15:12
简便、快捷、廉价的 新冠病毒检测方法： 美国当前急需尽快推广。 截至 ８月７日 ， SARS-CoV-2 （新冠病毒）在全球 已经感染了 1 , 935 万人，并造成 7 1.7 万人死亡。 其中美国累计感染 509 万 人，死亡 16.4 万 人，是疫情最严重的国家。 快速遏制新冠病毒传播的最现实的方法是， 及时（最好是每天） 识别和隔离具有传染性的个人 。目前 这一过程因繁琐的采样和检测 程序 以及 漫长 的 结果报告 时间而导致 实际上收效甚微 。 诊断 新冠病毒 感染的 主要 检测方法 是一种 高度敏感试验 : 实时 定量逆转录 -聚合酶链反应(qRT-PCR) 。 为了进行 新冠病毒 的 qRT-PCR检测， 需要 对粘液样本进行病毒颗粒 灭活 并提取病毒 RNA。RNA 经 逆转录 步骤 被转化为 DNA，然后 经 聚合酶链反应 （ PCR ） 以 指数方式 快速扩增。 为了进行 扩增，一小段 DNA(引物)结合到 新冠病毒 DNA中的一个互补的目标序列上，而另一段DNA(探针)连接到引物结合位点下游的序列上。引物的结合启动了 目标 DNA的扩增 ：在 一种 名为 聚合酶 （ polymerase ） 的 DNA 酶 的作用下 向探针方向 拷贝 DNA。一旦聚合酶到达探针，它就会裂解探针，从而激活附着在探针上的荧光标记。使用这种荧光探针可以实时定量地监测荧光信号，而不只是检测积累的最终产品。 虽然 qRT-PCR检测非常 敏感 ，但也存在诸多 局限性 。它需要昂贵的实验室仪器和训练有素的技术人员，每次测试的 成本 估计约为 100美元 ，这意味着大多数人可能只 能 做一次测试。目前的检测能力有限，结果往往需要几天或几周才能 回复结果 ，这意味着在此期间，不知道自己已感染的人可能会传播病毒。 qRT-PCR的 高灵敏度 也可能是一个缺点而不是优势，因为该测试经常能检测到 的 RNA小片段 并非来自完整的病毒颗粒 ，因此 不代表可传播病毒 。这种 RNA片段可以在人体内存留数周或数月。 如图 1所示，感染 新冠病毒 通常会导致病毒复制的初始水平很高，在几天内达到顶峰并开始下降。症状通常在高峰出现之前不会出现，而且，由于大多数人在出现症状之前不会进行检测， 到检测时 他们很可能已经处于病毒复制的下行斜坡上， 在检测时 已 不再具有传染性 。与此同时，他们已经在不知情的情况下将病毒传染给他人好几天了。显然，这些人在高传染性期间 本来更 需要被识别和隔离。 图１ . 　新冠病毒感染时间与检测到的病毒 RNA 含量的关系 6月27日， 哈佛大学流行病学家 Michael Mina 在 预印本 杂志 《 m edRxiv 》上 发表了一 篇论文 ，评估了当前 新冠病毒 监测措施在减少传播方面的有效性，同时考虑到检测频率和结果报告的延迟。 Mina和合著者得出的结论是，使用qRT-PCR等 超敏感检测 的 次数有限的 检测常常导致对不再具有传染性的个体进行不必要的隔离 。特别 值得注意的是，它还导致处于感染初期、因此具有高度传染性的未发病或无症状个体 被遗漏 ，使他们能够照常生活并感染他人。 在预印本 出版几天后 的７月３日 ， Mina在《纽约时报》上与人合写了一篇 表达 观点 的 文章 ，题目是《 A Cheap, Simple Way to Control the Coronavirus （ 一种廉价、简单的控制冠状病毒的方法） 》 。 在文中他讨论了广泛使用 快速的家庭诊断测试 来控制 新冠病毒 大流行的可能性。通过易于使用的测试，每个人都可以每天检查自己。 这种诊断测试的一个例子是 侧流装置 （ lateral flow device ） ，它是一种类似于妊娠测试的 试 纸条 。 条带的一端有一个样本垫， 其中 含有识别 新冠病毒 抗原 的抗体。将样品垫部分的试纸浸入唾液样本中，并允许唾液 浸湿 试纸。 如唾液中存在新冠病毒 抗原 ，检测的结果 显示 除了 控制线 还会有 测试线 出现 ,而 阴性结果 只会显示 控制线 (图2)。 每次测试需时 10 - 15分钟,费用约为1 - 2美元,不需要任何额外的设备。阳性结果表明需要自我隔离并 咨询 医生确认检测结果。 图 2.　检测新冠病毒抗原的试纸条，上条结果为阳性，下条结果为阴性。 虽然 此类 快速检测的 灵敏度 只有 qRT-PCR检测的 一半 左右，但 在 实际 的 传播窗口 期 ，来自病人的唾液样品中 病毒水平非常高 ，这些灵敏度稍逊的检测方法足以 发现病毒抗原的存在。高灵敏度的 qRT-PCR检测在患者不再传播病毒数周后仍可检测 到 病毒 RNA，这与检疫/隔离 的 目的无关，也无助于遏制传播。 一种不那么敏感的、每天都 可 做并且能立即得到结果的测试将会更有价值，因为它能识别出实际上具有传染性的个体。 这也将减 少 对昂贵的接触者追踪措施的需要，因为大多数感染者将了解自己的状况，并在传播期间保持隔离。 在美国，类似的 快速 新冠病毒 诊断测试 有多种已研究成功， 希望 能得到媒体 足够的关注 。 一旦纸条的功效得到了明确的证明，它们也 将 得到了 FDA( 食品和药物管理局 ) 的批准 。 FDA、CDC和NIH将认识到这些测试的价值，并将它们广泛地提供给公众。 在美国，国会可以迅速授权生产并免费向所有美国人分发。 这可能是 近期重开 学校和工作场所以及重建经济的最终解决方案。 此类诊断检测试剂的推广也将有助于全球 迅速控制和结束这场可怕的瘟疫。 参考文献： 1.　 Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 surveillance ， medRxiv ， PostedJune 27, 2020. doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.22.20136309 　 2.　 https://www.virology.ws/2020/08/06/how-to-end-this-pandemic/
个人分类: 科学普及|5928 次阅读|0 个评论
科学随笔：核酸体外扩增及核酸检测那些事儿
热度 4 cherrylu1960 2020-6-18 13:39
在大自然这个天然实验室里，病毒无处不在，并不断进化，不知什么时候就会跳出来危害一下人类。人类对付病毒，首先要识别它，抓住它。 相比于细菌等微生物，病毒要小的多，一般只有50-100纳米，高倍的电子显微镜，也不容易看请它们的真面貌。但借助于分子生物学的检测手段，对它们进行寻踪早已不是难事。 严格来讲，病毒并不算是真正的生命，它们没有细胞结构，离开生命体不能自我复制，但具有复制生命所必须的核酸。人类不仅搞清了核酸这种特殊生命大分子的结构，及其在体内的作用方式，也掌握了在体外对核酸进行复制增殖操作的一些高超本领。 每种生命都包含不一样的遗传大分子，即核酸，或DNA, 或RNA，抓住了特异的核酸，就抓住了病毒。微量核酸抓着费劲，但借助复制它的神器，问题就容易解决了。 COVID-19疫情爆发，伴随核酸检测这个反复出现的名词和实际发生的事实，RT-PCR、qPCR这些专业术语也更多出现在公众的视野中。可能有必要稍微作些了解，消除一些误解。 学过相关专业知识的，PCR（聚合酶链式扩增反应）都不陌生，但对于普通人肯定不好理解，听名字就够难记的。其实也没有必要了解太多，记住扩增两个字就可以了，还有，这个过程需要一些特殊条件和酶的参与。 提起PCR这个技术，脑海中就会闪现“变性、退火、延伸”这些名词，以及相关画面。变性-退火-延伸也正是描述核酸体外扩增的基本过程。双链的DNA高温（93摄氏度）下变性，解链成单链，目的是让其与互补的引物DNA结合，退火（温度降到55摄氏度）后，模板DNA与引物根据碱基配对原则进行杂交。后边的延伸过程简单来说，就是在DNA聚合酶和中间反应原料（dNTP）的参与和稍高温度下，实现DNA连续的半保留复制。整个温度和酶控的过程，现在都可以由仪器自动完成，操作起来比较方便。 新冠病毒属于单链RNA病毒，不稳定，需要通过逆转录酶，以RNA为模板合成cDNA（从RNA到DNA反向转录的DNA），然后以其为模板，扩增合成目的片段，这就是人们所说的RT-PCR核酸检测技术（逆转录核酸扩增），这个技术在RNA病毒检测上应用比较广泛，扩增后结合探针（一段人工合成的碱基序列）荧光标记（qPCR）等，就可以准确识别靶标。 应该说，PCR技术已经不算什么新玩意儿，从上世纪八九十年代开始，技术已逐渐成熟，更好用的工具酶的不断发现和筛选，加上技术的不断改进，大面积应用也有几十年时间。我们熟悉的亲子鉴定，通过DNA比对锁定罪犯，还有DNA考古，等等，都离不开PCR这个超级神器。抓个病毒更不在话下了。 基于PCR的核酸检测也不是什么很新鲜的技术。但的确，只有在这次不同寻常的疫情爆发后，它才真正进入大众的视野。 涉及大量人群的病毒病源学检测，使得核酸检测这几个字不断深入人心。病毒核酸，阴性还是阳性，希望和失望，从来没有像今天这样牵动着人们的神经。记得2003年SARS时，媒体并没怎么提到需要通过核酸检测作为确诊依据，主要原因是SARS的症状比较典型，通过临床症状和影像学检查，基本就可以定性，不需要借助病源学检测这个武器。关键是，SARS没有这么多隐形感染者。 追踪病毒的还有另一种方式，即血清免疫学检查，需要采血测抗体，主要看以往感染的情况，结果的不确定性相对复杂，抗体产生的滞后，也需要发病后一段时间才能检测到。核酸检测看起来相对单纯，只要能搞到含有病毒核酸的微量样本，只要是合格的试剂，规范的操作，抓住病毒的概率就应该比较高，所以，利用RT-PCR技术进行病毒核酸检测，特异性应该没有大问题（不需要整个的核酸，只需要其中一个片段，即靶标，就可以了）。至于灵敏性保证，看具体情况。 人们普遍关心假阴性的产生，一方面与样品受限有关（没有取到有病毒或者病毒载量过低的组织样本），或者试剂不太合格，灵敏度低，如造成逆转录的起始DNA含量太低。还有人提出，如果病毒变异了，正好涉及那段靶标，也可能检测不出来，但我觉得这种可能性不大。据知情人讲，我们的检测试剂有很多种，大多数是靠得住的。不合格的试剂能随便上市应用吗？估计很快被淘汰了。 当然，通过核酸检测可以确认病毒的存在，至于它是不是活着（具有感染力），还无法判断。所以要结合临床症状和其他检查来确定。 COVID-19，较多的无症状和不典型症状人群的存在，真的让核酸检测在疫情防控和患者确诊中发挥了史无前例的作用。如果没有核酸检测这个武器，无法及时筛查到感染人群，不能采取有效干预手段，结果可想而知。 人类科技的进步，总会在对抗疾病，对抗自然界敌人入侵中发挥越来越重要的作用。相信科学，依靠科学，我们一定可以找到更多与大自然抗衡的有力武器，当然，我发自内心的想法是，最好，我们能找到更多方法，与大自然和谐相处，不要有太多的杀戮。我们能做到吗？
个人分类: 科普文章|8596 次阅读|11 个评论
PCR小传
fuleiucas 2020-5-29 13:09
对于新冠肺炎疑似患者，要想检测从患者身上提取的组织里是否含有新型冠状病毒的核酸序列，我们需要借助于核酸测序技术。除了疾病诊断之外，核酸测序还有很多用途，比如亲子鉴定、犯罪嫌疑人的身份识别等。不过，从被检测者身上获取的组织中，经过提取以后留下来的核酸数量往往很少，不敷使用。人们想，要是能不必重复从被检测者身上获取核酸、只是在实验室里就能合成其核酸拷贝就好了！上个世纪的分子生物学家们早就想到了这个问题。 20 世纪下半叶，随着脱氧核糖核酸 DNA 双螺旋结构的发现与遗传密码的破译，分子生物学的大厦逐渐建立起来，而 DNA 在生命科学研究中的作用日益凸显。如果想对 DNA 进行分析，单靠原始拷贝是不够的，量太少，一旦实验了就没有了，所以需要对 DNA 样本进行体外复制，高效、大量的复制想要研究的 DNA 成为制约 DNA 分析的瓶颈。美国生物化学家穆利斯创造性地发明了体外高效扩增 DNA 的 PCR 技术，使得只用微量 DNA 获得大量拷贝成为可能。 图 1 凯利·穆利斯（ Kary Banks Mullis ） （图片来源： https://www.latimes.com/obituaries/story/2019-08-13/kary-mullis-dna-nobel-prize ） 凯利·穆利斯（ Kary Banks Mullis ） 1944 年出生于美国北卡罗来纳州的勒诺，在南卡罗来纳州度过了童年时光。学生时代的穆利斯就对科学非常感兴趣， 1962 年进入佐治亚州理工学院学习化学，毕业后转入加州大学伯克利分校攻读生物化学博士学位，随后在堪萨斯大学医学院和加州大学旧金山分校从事博士后研究。 1979 年入职西特斯公司（ Cetus ），这是世界上最早的靠重组 DNA 技术起家的企业，是世界上最早的生物技术公司之一，正是在这家公司，穆利斯发明了 PCR 技术。 1986 年 ~1988 年，在 Xytronyx 公司短暂工作后，他从 1987 年开始成为加州 PCR 技术与核酸化学的非官方顾问，后来在加州奥克兰儿童医院工作，并担任多家公司的科学顾问。 图 2 PCR 原理示意图 （图片来源： https://toptipbio.com/polymerase-chain-reaction-pcr/ ） 在穆利斯之前，科学家已经开始研究 DNA 的体外分离技术，并且已经发现了合成 DNA 所必需的 DNA 聚合酶。不过早期的实验效率比较低，而且错误率较高。当穆利斯进入西特斯公司之后，从事合成寡聚核苷酸的工作，他也对重复而低效的工作产生了厌倦，总想着如何提高效率。新想法的产生完全是偶然的。 1983 年 4 月一个周末的晚上，他驾车与同事去往乡间别墅，他突然想到如果 DNA 片段的复制是循环往复的不就可以了吗？只要提供 DNA 复制所需要的模板、原料、酶和引物， DNA 的复制就可以是自动完成的。这就是 PCR 技术，全称是聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ）。这个想法看上去也很简单啊！后来他查阅资料，竟然发现没有人想到类似的想法，而他的同事也多少对此表示怀疑。经过几个月的思考和准备之后，穆利斯开始了实验，经过对 DNA 复制的模板、双螺旋解开后再次变成双螺旋（复性）的反应温度、 DNA 聚合酶的量等因素的多次调试，终于在 1984 年的 11 月获得了成功！他们的工作马不停蹄，第二年春天就公布了研究数据、申请了专利、发表了研究论文。 回头来看，穆利斯的发明虽然有偶然因素，但也是在相关理论与技术发展到一定阶段才能实现的。科学家已经发现了 DNA 合成所需要的聚合酶，了解了 DNA 解开螺旋（退火）、引物在链上延伸的热动力学过程，还有早期 DNA 体外复制实验的成功，等等。这些理论与技术为 PCR 技术的实现奠定了基础。 同时，我们还可以看到 PCR 技术也是需要发展和改进的。当时穆利斯使用的 DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 Klenow 片段，这种酶不耐高温，且复制的时候错配率较高； 1988 年，科学家改用了 T4 DNA 聚合酶，准确率提高了，但是需要不断加酶；直到西特斯公司从一种水生嗜热菌中分离到 Taq DNA 聚合酶，才实现了 DNA 体外扩增的高效与高特异性，这就为 PCR 技术的广泛应用扫清了障碍。后来， PCR 技术又被科学家不断改进，产生出各种变体的 PCR 技术。 最开始的 PCR 技术，是把 DNA 进行体外扩增。但是像今年的新冠病毒，就不能简单地应用这种 PCR 技术，因为这种病毒携带的核酸不是脱氧核糖核酸 DNA ，而是核糖核酸 RNA 。通常 DNA 有两条互补的链，构成 DNA 的四种碱基是 A T GC ；而新冠病毒的核酸是单链的 RNA ，构成 RNA 的四种碱基是 A U GC ，原料和最终产品都不一样，体外扩增的策略也要不一样了。针对核酸是 RNA 的生物，人类发明了 RT-PCR （ Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ）技术，或者称为逆转录 PCR 。具体原理是，以病毒的 RNA 为模板，合成出与之配对的单链 DNA ，这条单链 DNA 被称为互补 DNA （ cDNA ） , 然后再采用通常的 PCR 技术，对这段互补 DNA 进行体外扩增。不仅对于新冠病毒核酸的体外扩增要应用 RT-PCR 技术，想要在体外扩增艾滋病病毒 HIV 等逆转录病毒的核酸，也要应用 RT-PCR 技术。 图 3 RT- PCR 原理示意图 （图片来源： https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction.svg ） PCR 技术的发明具有重要意义，使得应用微量的 DNA 样品实现体外的大量高效扩增成为可能，从而在生物学、医学、法医学等领域获得广泛应用。而穆利斯也由于发明了 PCR 技术而获得 1993 年诺贝尔化学奖。 注：本文2020-5-29首发于“京师生物圈”微信公众号.
个人分类: 科学与历史|6665 次阅读|0 个评论
数字PCR简介
jhsbj 2019-6-15 12:58
1985年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法以后，PCR已经成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。PCR是用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点，是能将微量DNA大量扩增。 最传统的一代PCR采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析，操作繁琐、难于做定量分析。为使PCR技术能对基因水平进行定量分析，1992年开发了荧光实时定量PCR（二代PCR）。实时定量PCR（qPCR）通常在DNA扩增时对反应体系中的荧光信号进行实时收集，通过三个参数间（荧光信号-Cq值（罗氏公司）或Ct值（ABI公司）-靶基因的起始浓度）的关系，能以相对定量的方式确定靶基因的拷贝数或推断基因表达水平。由于荧光定量PCR的分析是相对定量的方式，这也是目前荧光定量PCR的最大技术缺点。在低拷贝靶分子、模板浓度差异的条件下，其检测灵敏度、精确度都受到了限制。 1999年霍普金斯大学的Vogelstein教授首先提出了第三代的Digital PCR（数字PCR）的概念。此后数字PCR技术得到迅速的发展。数字PCR是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR相比，数字PCR增加了一步分隔(partitioning)的操作，将几十微升的反应体系分隔成了众多微小独立反应体系。核酸模板在这种分割过程中被充分稀释，理想状态下每个微反应体系中至多含有1个分子的核酸模板。和qPCR不同，数字PCR不对扩增过程进行实时监测，而是检测end-point的荧光信号。扩增完成后所有液滴的荧光将逐个被识别并进行计数，不需要构建标准曲线，就可以得到绝对定量的结果。 目前数字PCR的主要产品有： 1. QX200 QX200目前已经是Bio-Rad的产品。Bio-Rad的技术主要来源于QuantaLife公司，QuantaLife 利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字ddPCR，这是最早出现的相对成熟的数字PCR平台，在运行成本和实验结果稳定性方面都基本达到了商品化的标准。 2011年QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100，继续在市场上销售，2013年该公司又推出了升级型号QX200。 2. Raindrop Raindrop数字PCR是美国RainDance Technologies公司于2012年推出的产品。能够提供更高的检测范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品，这个设备将其原有的二代测序文库制备平台技术也整合进入数字PCR技术平台，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成100万至1000万个P升级微滴反应乳液，这种超高的微滴数目可以为用户“提供更高的检测动态范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品。在2017年Bio-Rad完成了对RainDance公司的收购。 3. Quant Studio 3D Applied Biosystems公司2013年也推出了Quant Studio 3D数字PCR系统，是目前数字PCR市场上新型号产品之一。采用高密度流控芯片技术，使样本均匀分配至20,000个单独的反应孔中。在整个测定流程中，样本之间保持完全隔离，防止样品交叉污染。移液过程和操作步骤减少。芯片式设计避免了微滴式系统可能出现的管路堵塞问题。Applied Biosystems在OpenArray芯片平台之外推出的全新的芯片式数字PCR系统，这个全新系统在设计上综合考虑了系统稳定性与运行成本因素。 2013年Thermo Fisher公司收购了Applied Biosystems。 Quant Studio 3D 数字PCR可用于分子标准品定量；原体检测和定量测定；罕见癌症基因突变检测；拷贝数变异分析；GMO检测和污染评估；mRNA 和miRNA表达低倍变化的确定等。 4. Naica TM crystal Naica ™ crystal数字PCR系统是由法国Stilla Technologies公司推出的产品。将微滴均匀性和芯片可视化以及相同PCR反应条件创新性集成在同一系统中，使用微流体创新型Sapphire芯片，样品通过毛细通道网格以30,000个Crystal微滴的形式进入发布在2D芯片中。 这种方法在满足实验室对数据精准性、重复性要求的同时，让数字PCR分子检测变得更加简单快捷。PCR扩增过程在芯片上实现。最终对阳性微滴计数从而得到精准的核酸绝对数量。作为首款三个荧光通道检测的数字PCR平台，Naica ™ crystal数字PCR系统可在2小时内实现多达36个目标基因的检测。Naica ™ Crystal系统由Geode微滴生成；扩增仪和Prism3微滴阅读分析系统组成，仅需唯一耗材——Sapphire芯片，即可完成从加样、微滴生成和扩增，直到采集数据获得结果。　 Naica ™ crystal数字PCR可用于：基因表达差异检测；拷贝数变异(CNV)；低丰度及稀有序列的精确定量；甲基化含量鉴定；肿瘤治疗的伴随诊断；无创产前筛查；病原微生物的检测(病毒、细菌等)；二代测序辅助建库；肿瘤治疗的实时监控 (ctDNA检测)等。 ReaserchGate 论坛对digital PCR不同品牌比较的讨论： David Otaegui Biodonostia Institute 6th Jun, 2014 ：Digital PCR, Qx200 vs Quantstudio 3D; Which one you think is the best? Eric Ouellet University of British Columbia – Vancouver 7th Jul, 2014：Hi David, Our lab uses a QX100 ddPCR platform from Bio-Rad (now QX200). At the time it was the only available option. However, I can offer some advice on its usability. As you may know, bio-rad uses droplets to perform ddPCR, a process on which they are continuously improving upon. The new cartridge designs can, in our experience, reliably and reproducibly partition samples. Although the process is more labor-intensive (and to some extent, more prone to user error), we did welcome the added flexibility of using such a system. The Quantstudio 3D instrument is a bit reminiscent of the platform pioneered by Fluidigm. In these case, the partition is done geographically. In many cases, the yes/no readouts are sufficient, but in cases where samples would need to be recovered, these platforms would have great difficulty in achieving this, compared to emulsion-based systems. However, for most clinical applications, these instruments are often very useful. Raindance is also another promising company that is currently trying to enter the market of droplet-based digital PCR detection, although they currently offer fee-per-service options rather than instruments themselves. However, according to their documentation, they can achieve partition levels that dwarf the other platforms, providing there is a need for such high levels. The other aspects to consider are not only the capabilities of these various systems, but perhaps more importantly, the cost of the consumables and reagents, especially when compared to NGS platforms that are constantly becoming more affordable. Ultimately, the balance between flexibility and ease-of-use would have to be weighed for any particular application. In our case, we required the flexibility, albeit a steeper learning curve. Giovanni Lopez Universidad Peruana Cayetano Heredia 2nd Feb, 2015：Here in South America QX200 this $180456....Includes only: A reader Droplet oil (1863004), a droplet generation oil (186305)，Buffer 2X Control Kit (1863052)，ddPCR Supermix 2X (1863010). What is it that more is spent? Rupesh Deshmukh Laval University 12th Dec, 2016：Can anyone provide me cost comparison between QX200 and Quantstudio 3D.Thanks Kevin Kelly Thermo Fisher Scientific 7th Jul, 2017：Hi Rupesh, The QS3D costs around half of what the Bio-Rad system costs. If you'd like more info send me a message at kevin.f.kelly@thermofisher.com, and I'd be happy to connect you with your local sales rep for additional information. Thanks, Kevin David Dobnik Nacionalni inštitut za biologijo 9th Sept, 2017：Hi David, In our lab we have two Bio-Rad's machines (QX100 and 200) a Fluidigm Biomark HD and have also had the chance to test Quantstudio 3D and Stilla's Naica platform. Overall, regarding the usability and throughput, the Bio-Rad's system is the one I prefer. We have tested duplex assays on QX100 and QS3D side by side and separation of clusters on QS3D was rather poor. However, if you do not plan to run a lot of samples per run, even QS3D might be a good choice looking from the cost perspective. Oliver Schultz Stilla Technologies 4th Apr, 2018：Dear network, if you′re interested in an innovative new approach to digital droplet PCR, please check out the NAICA system from STILLA Technologies. It′s the fastest system on the market, including a 3-color detection and the capability of recovering the droplets after read-out for downstream applications. Learn more at www.stillatechnologies.com Best wishes, Oliver Minka Kova č Omega 8th Aug, 2018：Dear all, in our lab we have a Quantstudio3D. We know also other platforms like BioRad, Stilla, Fluidigm and QuantStudio 12 Flex with Open Array. Honestly speaking if you have a small number of samples per day, less than 96 per day the platform for you is QST3D. Price performance for small amount of samples is strongly on QST3d side (price of the instrument, price per reaction). Second majority of assay's from ABI now Thermo Fisher Scientific works well with no additional optimization, like 90 -95 %. But yes, sometimes for some assays additional optimization is a MUST. So regarding the Quality of the data from results between QST3D and BioRad (others as well) I have to say that data is dependent on the fine optimization. You can even find the scientific articles which showed that systems on the digital market are more or less comparable. The entering price of the QST3D instrument is more than half lower compared to the BioRad droplet platform. If you have more than 96 samples per day or ca 10000 samples yearly you have to think about bigger systems (Stilla, BioRad, OpenArray) Best wishes, Minka
个人分类: 生物科技|11111 次阅读|0 个评论
[转载]什么是多重PCR？复合PCR原理操作步骤注意事项详细介绍
a2381889653 2018-8-30 10:28
一、引言 多重PCR( multiplex polymerase chain reaction,MPCR)也称复合PCR,是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术,即可在一个反应体系中加入两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段,由 Chambehian'于1988年首次提出,其反应原理、反应试剂和操作过程与常规PCR相同。多重PCR既有单个PCR的特异性和敏感性,又较之快捷和经济,在引物和PCR反应条件的设计方面表现出很大的灵活性。多重PCR还能提供内部对照,指示模板的相对数量和质量 当前临床上对感染性疾病的诊断主要依靠传统的微生物学方法以及血清学方法。经典的微生物学方法不仅繁琐、费时,并受诸多因素影响,容易漏检自然变异株,并且不能检测难培养或不可培养的致病微生物。血清学方法虽然发展较快,灵敏度也较高,但只能做追溯性诊断或提供间接的诊断依据,不能进行快速鉴定,并且有些细菌之间有交叉凝集现象。因此,这些传统的方法在鉴定方面日益显现出不足。过去10年间,分子生物学的发展为微生物的基因型检测和鉴定打开了一扇大门,这些发展开始影响到患者治疗的很多方面。DNA杂交研究首先应用于确证细菌间的关系,对核酸杂交化学的认识,使发展核酸探针技术成为可能。但类似于表型指标,在某些情况下,杂交的方法也可能受到微生物能被分离和生长的限制。核酸扩增技术又为临床微生物实验室的病原体的检测和鉴定铺设了道路。体外能够生长,一般来说不再是鉴定微生物所必须满足的条件。之所以能够如此,从根本上说是由于这些技术以特异核酸序列的酶学扩增代替了生物学扩增一培养生长。虽然任何PCR依赖的技术都不能区分活的和死的细胞,但由于具有其它方法不可替代的优势,PCR还是成为分子生物学中不可缺少的技术和方法。在过去20多年间, PCR技术 和其它DNA信号与靶标扩增技术的发展已经使这些分子诊断技术成为临床上快速敏感诊断的关键性技术。一般PCR仅应用一对引物,通过PCR扩增产生一个核酸片段,主要用于单一致病因子等的鉴定。在诊断实验室中,PCR技术的应用主要受成本的限制,有时是因不能获得足够的待测样本体积。为了克服以上缺点,同时增加PCR技术的诊断能力,多重PCR的技术应运而生 自1988年 Chamberlin等首次提出这一概念起,多重PCR技术已被广泛应用于核酸诊断的许多领域,包括基因敲除分析、突变和多态性分析、定量分析1以及RNA检测等,在感染性疾病领域,多重PCR技术已经显示出它的价值,成为识别病毒、细菌、真菌和寄生虫的有效方法。利用一次多重PCR反应,可同时检测、鉴别出多种病原体,在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的实用价值 二、原理 多重PCR基本原理与常规PCR相同,区别是在同一个反应体系中加入一对以上的引物,如果存在与各对引物互补的模板,则它们分别结合在模板相对应的部位,同时在同一反应体系中扩增出一条以上的目的DNA片段。多重PCR反应体系的组成和PCR循环的条件需要经过优化以确保同时扩增几个片段。理论上只要PCR扩增的条件合适,引物对的数量可以不限,但由于各种条件的限制,实际能够扩增的引物对数量是有限的。 PR结果的分析方法有以下几种,包括:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸杂限制性酶切分析、核酸测序等,其中琼脂糖凝胶电泳是最简单、最快速的方法,但是与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比分辨率比较低。限制性酶切分析需要将PCR产物回收酶切后再次电泳,耗时费力,难以推广应用。核酸测序是鉴定PCR产物最可靠的方法,但需要专门的测序仪器,并且需要花费的时间也比较长。如果要将鉴定感染性疾病病原的多重PR方法用于临床及现场流行病学调查,琼脂糖凝胶电泳是最佳的选择 三、材料 1.常规的PCR反应体系所需试剂 高压过的超纯水(高压的目的是使其中的 DNase失活,以免降解模板DNA); PCR缓冲液(选用与所用聚合酶对应的缓冲液) 4种dNTP混合物(每种dNTP的浓度为2.5mmol/L); 引物(引物合成后,用超纯水稀释为10mmol/L); 热稳定的DNA聚合酶(不同厂家、不同批次的酶可能会有差异); DNA模板(尽量使用纯化后的核酸作为模板)。 2.实验仪器 PCR热循环仪、核酸电泳仪、凝胶成像设备、离心机等 四、方法 多重PCR实验设计远比单个PCR复杂,并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系,其反应体系的组成和反应条件需要根据实验结果反复调整,以适应同时扩增多个片段的需要。设计多重PCR反应体系时必须仔细考虑其扩增的区域、扩增片段的大小、引物的动力学及PCR循环条件的最优化等。 一）选择目标基因 由于多重PCR在同一个反应体系中需要加入多对引物,而模板直接影响扩增的结果分析,这就导致了扩增模板的选择至关重要。同时,扩增区域的选择必须符合分析的目的,如通常对于致病微生物,需要选择其保守序列,如16sRNA,或者毒力基因、毒力相关基因,以防止检测到非致病突变体而无法解释结果;对于需要分型的对象来说,需要选择它们之间有差异的保守序列进行扩增;对于高度同源的序列来说,可以用相同的引物进行扩增,但获得的阳性结果需要利用特异探针杂交或限制性酶切进行进一步确定;缺失分析选择扩增外显子;法医学鉴定个体差异选择扩增高度多态性标志;转基因检测则选择转入的动植物基因座;性别鉴定一般选择X或Y性染色体上特有的基因座 对于含有多个外显子的基因缺失分析来说,可选择缺失热点较广区域或缺失密集区域。相邻近的外显子可用跨越这两个外显子的引物进行扩增。 二)引物设计 引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸序列,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与灵敏度。要确定引物的位置,首先需要知道所选择的基因引物与模板结合部位的详细DNA序列信息。在多重PCR中,为了保证扩增效率,所有的引物对必须优化到相近的扩增条件。因此,多重PCR的引物设计除了要满足一般PCR引物设计的原则外,还要注意以下几个问题:各引物之间不能互补,尤其避免3的互补,以免形成二聚体,引物设计好以后进行PCR扩增,以检验引物之间是否配对形成二聚体;各引物与其它扩增片段和模板不能存在较大的互补性,扩增片段之间也不能有较大的同源性;对于引物的长 度、(G+C)含量、T值要求尽量一致;各引物扩增产物的片段大小要有一定的差别,以便于用电泳的方法进行区分。一般来说,产物片段越大,其长度的差别也应该越大。这就给多重PCR引物的设计带来了一定的难度 (三)核酸提取 核酸依赖的检测方法受目标核酸纯化的影响,核酸的纯化程度决定了核酸方法的应用。多重PCR的优势在于快速、系统,主要用于临床标本的检测,包括血液、组织、粪便等,同时多重PR对核酸模板的要求比较高,所以核酸的提取纯化显得尤为重要,直接与扩增结果 一般来说,通过煮沸裂解细菌制备模板可以满足普通PCR反应,但是用于多重PCR反应会存在很多问题。在条件允许的情况下,多重PCR需要以纯化的DNA为模板,可以确保多重PCR的顺利进行。 (四)单位点PCR(也叫单引物PCR) 在进行多重PCR之前,必须先对每对引物进行单位点PCR。确定每对引物进行单位点PCR时条件如表14-1所列 反应完成后比较扩增结果,确保在相同的循环条件下所有的引物都能扩增出对应的产物条带,以确保引物能够特异性扩增对应的目标序列 (五)多重PCR(引物等浓度混合) 反应体系中各对引物等浓度混合,体系中其它各成分的浓度不变,应用与单位点PCR相同的反应条件进行多位点同时扩增,根据扩增结果对多重PCR反应体系及反应条件进行调整,具体操作如下面所述 (六)优化多重PCR反应体系及反应条件 多重PCR的反应体系和反应条件基本与单位点PCR相同,但也不能一蹴而就,必须使多重PCR反应中每对引物对应的靶点都能获得足够的扩增量,并且扩增产物之间的产量应该基本影响多重PCR扩增效果的因素可以分为反应体系和反应条件两大类。其中反应体系包括引物、缓冲液、 Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2等,反应条件包括退火温度、延伸温度、延伸时间,循环数等 1.反应体系的优化 (1)引物浓度在多重PCR体系中,引物用量和扩增的目的片段长度有着正比内在关系,即扩增片段越长,所需引物就越多,片段越短所需引物相对就越少。同时,多重PCR扩增中每增加一重PCR扩增,引物间相互影响就加大,这就势必影响到扩增的效果。为了降低这种不利影响,选择适当的引物间浓度是确保多重PCR成功的一个关键因素。先对不同的引物进行单个PCR扩增,确定单个PCR各引物的最佳浓度,然后按照多重PCR的实验流程,进行两个或多个引物对的多重PCR预实验。多对引物会增加3末端引物互补的可能性,形成引物二聚体;也有可能发生一个扩增片段抑制另一个扩增片段的情况,这就导致了扩增结果并不是均一的。即使在优化了循环条件后,某些基因的扩增产物仍不明显。多重PCR反应体系优化经常可以遇到有个或两个靶位点的扩增产物很少甚至没有扩增产物,而其它引物的扩增效率都很好的情况。为解决这一问题,可以通过适当地调整引物的相对浓度加以解决,增加弱条带的引物量,减少亮条带的引物量。降低扩增效率高的引物对浓度比增加扩增效率低的引物浓度更有助于提高扩增效率低的产物的产量。多重PCR反应中各引物的浓度差异一般都凭经验获得。只有在调整引物浓度达不到要求时才考虑调整别的反应条件,例如改变反应体系中Mg2或KC的浓度等。 有些情况,例如扩增产物是序列相似但长度不同的扩增片段,最短的产物可能扩增得更好,尤其是有些扩增片段共用一个引物的时候。这种情况可以通过长扩增片段引物启动PCR几个循环后再加入扩增短片段的引物的方法避免,也可以通过降低扩增短片段的引物来解决。理论上讲,引物和基因靶序列的摩尔比至少为103:1,如此过量的引物才能确保模板DNA一且变性就与引物退火,而不是与其自身退火。一般引物量至少要10倍于模板量 (2)模板及模板浓度从血和新鲜组织中提取的DNA,浓度和质量均能满足多重PCR的要求。对于从菌体提取的DNA,为了减少样品对扩增结果的影响,裂解液中加入的菌量不能太多否则会因裂解不完全,菌体蛋白抑制DNA聚合酶的活性,造成假阴性结果 要达到稳定的结果,每个样品都应该测定浓度,实际工作中往往是抽样检测。所以,样本模板浓度往往参差不齐,导致每个样本扩增效率不完全均等,有时还会出现扩增失败的现象。此时要考虑模板的有效浓度,适当加以调整。几种不同来源的模板DNA的浓度为:哺乳动物基因组DNA100g/ml;酵母基因组DNA1g/ml;细菌基因组DNA0.1pg/ml;质粒DNA1~5ng/ml)dNTP和MgCl2的浓度dNTP和MgCl2是PCR反应体系中的重要成分,因此对dNTP和MgC1的浓度进行优化也是很必要的 PCR反应中一般用的dNTP和MgCl2的浓度分别为200m/L和1.5mmol/L。Mg2浓度在很大程度上影响扩增的特异性,Mg2+一般正比于dNTP的浓度,这个比值确定好后可以在调整其它反应条件时保持恒定。当保持dNTP的浓度不变,随着MgCl2浓度的升高,反应的特异性逐渐增强,但当增加到一定程度后,反应产物几乎为零。PCR反应中,dNTP和MgCl2的浓度应该平衡,这可能是因为dNTP能够结合镁离子,而 Taq DNA聚合酶发挥活性需要游离的镁离子。另外,dNTP母液对于反复冻融十分敏感,反复冻融3~5次后,多重PCR反应常常不能很好进行,扩增产物几乎完全不可见,但dNTP的这种低稳定性在单一基因扩增中并不明显。 (4)PCR缓冲液(KCD的浓度如果多重PCR系统性地对扩增长的PCR产物有倾向性,最佳的选择是设计一系列多重PCR实验,固定Mg浓度(1.5mmo/L),依次递增KCl的浓度(1.0~2.0倍),对每对引物进行再优化。相反,如果倾向于优先扩增较短的产物,则应在保持KCl浓度不变的情况下逐步提高Mg2浓度(直至4.5mol/L)。如果所有产物的扩增效率都很低试着提高模板和热稳定DNA聚合酶的浓度。如果没有改善,则成倍增加所有引物的浓度并采用复性和延伸温度依次降低2的降落PCR。 PCR缓冲液的浓度从1×提高到2×可以明显提高多重PCR的效率,这种调节作用比调节DMSO、甘油或BSA更重要。通常产生长片段扩增产物的引物在低盐浓度下扩增结果更好,而生短片段扩增产物的引物在高盐浓度下扩增结果更好,高盐浓度会使长片段扩增产物难于变性解链 (5) Taq dNA聚合酶随着多重PCR体系中引物对数目的增多,dNTP和聚合酶的量也要相应增加。不同厂家的酶质量也有差异,需要做浓度梯度实验,寻找最佳的用酶量。使用过多的Tag dnA聚合酶会导致不同基因扩增不平衡及背景的轻微增高,反应的特异性降低。可以在25反应体积中加入2U,然后根据扩增结果进行轻微的调整 (6)辅助剂(如DMSO、甘油、BSA)的应用在多重PCR反应体系中加入50~100ml/的DMSO或甘油能够提高多重扩增效率和敏感性,得到更多的扩增产物和减少非特异扩增。但是这些辅助剂可能会在另一方面干扰实验效果,因为它对各基因位点扩增效率的影响不同50ml/L的DMsO可能会提高某一位点的扩增效率,降低另一位点扩增产物的数量,而对某些位点则根本不产生影响;同理,DMSO可能抑制也可能是促进非特异性扩增。因而使用这些辅助剂的效果需要在每个具体的反应体系中加以验证。加入适量的BSA(如L.0g/L)能显著提高多重PCR扩增效率。有时候BSA效果要比DMSO和甘油好,但它的作用同样也需要实验的验证 有些研究人员建议使用浓度范围为5%~10%体积分数的DMSO和甘油来改善扩增的效率和特异性,但在多重反应中,DMSO的使用会出现矛盾的结果。因此,DMSO和甘油的调节对实验结果的影响要根据具体的实验来摸索。 2.反应条件的优化 由于在一个多重PCR反应体系中有多对引物,而且扩增的模板片段长度也不尽相同,所以各对引物的扩增效率和扩增速度也不相同。由于多重PCR反应总是遵循较小片段优先扩增的原则,各对引物所要求最佳PCR条件也不尽相同(设计多对引物进行多重PCR时,应使各引物所需PCR扩增条件尽可能一致),因此在选择多重PCR扩增条件(尤其是退火温度和时间)时应尽量选择有利于较大片段扩增的条件 (1)退火时间和温度在循环参数中,影响多重PCR扩增效率的主要因素是复性温度和延伸时间。复性温度的设置策略与单个PCR相似。先计算引物的熔解温度(Tm),在此基础上推算复性温度T。(T=T。-5)。然后用“逐步引人法”确定多重PCR的最佳T,即每增加一对引物,就根据扩增的结果调整复性温度,直至每一种被扩增的基因片段都获得满意的效果。延伸时间是影响扩增产量的重要因素。随着扩增的基因座数目的增加,延伸时间也应延长。在最佳的Mg2+和dNTP浓度范围内通过延长延伸时间来提高扩增产量,比单纯增加Mg2+和dNTP浓度更为有效。 退火时间对扩增效率的影响远远小于退火温度的影响,将退火温度降低4~6对于在多重PCR中扩增出同样的基因是必需的。多重反应中并发的其它基因的特异扩增会消除非特异扩增的影响,同样,扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低 (2)延伸温度高的延伸温度会减少某些基因的扩增,即使用长的退火时间和延伸时间也可能无法消除这种影响。 (3)延伸时间在多重PCR中,由于同时扩增多个基因,酶和dNTP的缺乏就成为限制因素,就需要更多的时间来完成所有产物的合成。多重PCR中增加延伸时间,可以增加较长PCR产物的量。也有实验表明,当延伸时间延长时,所有基因的PCR产物量都增加了 4)PCR循环数PCR产物量增加最明显的是在25个循环附近。通常对于一个反应,2830个循环就足够了,增加至60个循环对产物量无明显影响 总之,多重PCR反应条件的设置是一个棘手的问题,也是多重PCR成功的保证。一般策略是首先进行单个PCR反应,分别设定各引物对应的条件;然后,依次增加引物对,不断调整反应条件直至最后保证所有的引物对都能在同一条件下扩增出目的条带。 五、常见问题的解决 针对多重PCR中的常见问题,可以通过改变影响PCR扩增效果的因素来解决 1.若所有产物条带都很弱 增加延伸时间; 降低延伸温度至62~68; 逐步降低退火温度; 调整 Taq DNA聚合酶的浓度; 同时应用以上4种策略。 2.若短片段产物条带较弱 缓冲液浓度从1×增加至1.5×或2×; 降低退火或延伸温度; 增加弱条带相对应的引物量; 同时应用以上3种策略。 3.若长片段产物条带较弱 增加延伸时间; 增加退火和/或延伸温度 增加弱条带相对应的引物浓度; 降低缓冲液浓度至0.7×~0.8×,同时保持MgCl2浓度1.5~2mmol/1L不变; 同时应用以上4种策略 4.若出现非特异产物 若非特异产物是长片段,增加缓冲液浓度至1.4×~2.0×; 若是短片段,降低缓冲液浓度至0.7×~0.9×; 逐渐增加退火温度 减少模板和聚合酶的用量; 增加Mg2至3mmol/L、6mmol/L、9mmol/L、12mmol/L-,同时保持dNTP浓度恒定在200umol/L: 同时应用以上5种策略 5.若以上方法都未见效,可以进行以下尝试 加入辅助剂BSA(0.1~0.8pg/p); 加入辅助剂DMsO或甘油(5%,体积分数); 重新比对引物,确保引物之间不存在相互作用; 六、应用 (一)多重PCR在遗传病诊断方面的应用 1.DMD和BMD的检测 Duchenne型肌营养不良症( Duchenne muscular dystrophy,DMI)是一种很常见的人类遗传病,为X性染色体隐性遗传性肌肉变性疾病,50%的病例由基因缺失引起,大约每3500个男婴就有一个发病,1/3的病例由新的突变所致,肌营养不良基因长200kb,至少有70个外显子,被35个平均35kb的内含子所间隔1。目前尚无有效治疗的方法,因而高度准确的产前诊断和DMD阳性筛选是十分重要的。以往多用 Southern分析技术来诊断,但由于该基因由多达70个外显子,至少需要7~9个cDNA克隆才能诊断,费用高、费时而难以常规开展。BMD是Becker型肌营养不良症( Becker muscular dystrophy)的缩写。BMD亦为X性染色体隐形遗传性肌肉变性疾病。BMD的发病率为新生男婴的三万分之一。65%的BMD病例的原因是基因缺失。 Chamberlain等利用多重PCR技术对DMD进行了检测,设计了6对外显子引物。用1umol/L引物加10UTaq酶,延伸温度为?23min,25个循环。产物电泳后,如与正常对照的对应条带相比有缺失或移位,即为异常。随后该实验室又将引物增加至9对,使至少80%的DMD基因缺失得到确定,能直接诊断50%以上的病例。 Hentemann等2设计了2对产物分别为140bp和73bp的引物,对42例病人检测后,发现7例基因缺失并经 Southern杂交分析证实。Simard等报道用 Chamberlain的引物对DMD进行扩增,并对DNA模板处理进行了改进,用lm羊膜液离心后的细胞经非离子去垢剂和蛋白酶K的PCR缓冲液裂解后直接PCR扩增,效果令人满意。由于 DMD/BMD是等位基因,近来的文献多同时检测此两种疾病。Begs等用多重PCR同时检测肌营养不良基因的8个外显子和启动子,可使98%有基因缺失的DMD/BMD获得诊断。 Covone等人用两种方法对照研究了127例DMD/BMID2一种方法是用与 DMD CDNA相关的9种cDNA探针与Hind消化的基因族DNA杂交,另一种方法是用9对DMD外显子的引物进行多重PCR检测,结果73例(57%)存在基因缺失,两组方法结果相近。我国华西医科大学的学者亦用 Chamberlain的9对引物对17例DMD/MD病例进行了检测,结果8例(47%)发现基因缺失,证明了针对西方人的引物序列同样可以检测中国病例。 2.用于其它遗传病的检测 Pici等人鹆对囊性纤维化( cystic fibrosis,CF)基因突变进行了筛选研究,用4对外显子引物进行多重PCR扩增,然后用限制性内切酶消化PCR产物,再进行垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳,检查15例发现有3例发生了基因突变。Pior等设计了8对引物同时检测DMD/BMD和CF,通过凝胶电泳筛选 DMD/ BMD缺失突变,并用等位基因特异的寡核苷酸杂交确定CF突变是否存在。实验表明,可以通过多重PCR的方法从血斑中获得足够的DNA进行分子分析,可用于新生儿的筛选。 Pillers等人m用多重PCR和 Southern杂交方法研究了一位同时患AIED(Aland island eye disease)、甘油激酶缺乏(GKD)和DMD的病例,发现在DXS67(1 deoxy-D-xylulose5- phosphate synthase67)和DMD基因之间出现基因缺失。另外,还有用多重PCR方法筛查类固醇硫酯酶( steroid sulfatase,,srs)缺乏症和诊断β地中海贫血患者的报道。 脊髓性肌萎缩症( spinal muscular atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传神经性肌肉疾病。SMA会造成位于脑底和脊髓的下级运动神经元分裂,从而使其无法发出肌肉进行正常活动所依赖的化学及电信号。SMA主要影响患者的近端肌,即最靠近人体躯干部的肌肉。控制胃、肠和膀胱等器官运动的非随意肌不会受到影响。各型都会对控制随意肌运动的叫作运动神经元的神经细胞产生影响。最近的基因研究发现,运动神经元的死亡也许是因为缺少一种或几种蛋白,或者是它们不能完全发挥其功能而导致的。 Simard等应用多重实时反转录PCR方法(muli Xplex real-time reverse transcriptase- PCR)对存活运动神经元( survival motor neuron,SMN)的转录本进行定量,共检测了42个潜伏期SMA病人的血标本,每个病人取三个时间点,发现SMN的表达在每个病人的不同时间点上的转录是稳定的, SMN mRNA表达的实时定量检测可以作为SMA临床试验的生物标志以作为SMA临床试验的生物标志 甘露糖结合素( mannose-binding lectin,MBu)是一种血清蛋白,能够触发补体激活,因此在先天性免疫中发挥重要作用。低水平的MBL会损伤病原微生物的调理作用,进而导致儿童的反复感染、免疫受损病人的严重感染以及自身免疫疾病。MHBL的编码基因位于人类10q11.2~q21染色体,包括四个外显子,血清中MBL水平受其启动子多态性和MB2基因第一个外显子突变的影响。目前应用的MBL基因分型方法主要有以下几种:PCR限制酶切分析、序列特异寡核苷酸探针杂交( sequence-specific oligonucleotide probes,SsOP)、放大受阻突变体系( amplification refractory mutation system,ARMs)、ARMS联合SSOP、异源双链分析( heteroduplex analysis)、 实时PCR 以及应用小沟结合DNA探针的5端核酸酶分析。 Helena0等建立了种快速、高效的多重PCR方法对MBL2基因进行分型,并且将捷克人作为斯拉夫人的代表样本,应用此方法研究了MBI2的等位基因频率。共分析了359个不相关捷克人的MBL2基因,最终得出LYD单元型在斯拉夫人的祖先中比其它高加索人更常见,同时也证明了多重PCR是一种比传统PCR方法更快速、简便、省时省力的MBI2分型方法。 根据当前不育领域的研究,大约10%~15%的夫妇存在不育的问题,而在所有的不育个体中,男性不育大约占50%,其中40%~50%存在精子缺陷,如少精症和无精症。人类Y染色体的长臂对于精子的产生是必需的。在三个不同区域的缺失会导致严重的精子缺陷,包括非闭塞的无精子症和精子减少症。这些区域被称为无精子症因子( azoospermia factor,AZF),三个分离的非重叠区被定义为AzFa、AZFb、AZFc,与产生人类损伤的精子有关。近来的研究证明Yq染色体的微缺失会遗传给其儿子。Yeom等应用多重PCR扩增6个位点,包括Y染色体的性别决定区( sex-determining region on the Y chromosome,SRY)作为阳性对照,无精子症因子区域的5个序列标签位点( sequence-tagged site,Srs),其中模板是从不育男性血液中提取的基因组DNA。本研究中的引物为Cy3标记,PCR产物可以与固定的探针杂交,提供了一种敏感、高通量检测Y染色体缺失的方法,也是一种男性不育筛选的新方法。 (二)着床前胚胎遗传学诊断( preimplantation genetic diagnosis,PGD) PGD产生于10多年前,主要目的是识别基因突变或染色体错误引起的遗传性疾病。临床上最早是用来检测夫妻X隐形连锁疾病,随后应用于不同的患者来达到优生优育的目的,主要包括:单基因病携带者,无论显性或隐性、常染色体或X连锁;染色体结构异常携带者,包括易位、翻转、缺失、插入等;避免高龄产妇后代染色体异常;辅助生殖治疗反复植入失败的夫妇反复出现不明原因流产的夫妇。当前PGD已经成为产前诊断( prenatal diagnosis)的一种替代方法。 对于单基因缺陷患者,可以用多重PCR同时扩增多个位点,选择那些位于相同染色体或者临近致病基因的多态性标志位点进行扩增能够有效诊断突变位点和多态性等位基因,可以同时分析多个诊断位点,并且减少错误诊断的概率。另外,还可以扩增高变的指纹位点,指示DNA模板是否被污染 囊性纤维化病( cystic fibrosis,CF)是一种首次成功应用单细胞植入前基因诊断的单基因缺陷性疾病。CF的突变谱差别很大,因此,发展一种突变特异的PGD方法是行不通的。文献 建立了一种针对CF通用的多重PCR方法,用于胚胎的遗传学诊断。本研究应用了CF跨膜调控子( cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)两侧的4个紧密连锁高多态性重复标识:D7S523、D7S486、DS480和D7S90。共检测了100个白细胞和50个卵裂球,其中99%6获得了多重PCR结果,总体等位基因遗失( allelic drop out,ADO)频率从2%~5%不等。确认ADO以及额外等位基因存在后,95%的多重PCR结果可以用来建立基因型标记。基于父母的基因型,考虑到由于变异参数(5%、ADO(0~2%)和单重组(1.1%~3%)造成的胚胎传送丢失,大约90%的胚胎能够应用单个卵裂球进行可靠的PGD基因分型。错误诊断的概率与已知的两侧标识双重组概率相当,小于0.05%。因此,这种多态性和多等位基因标识系统是一种可靠的、可替代直接突变胚胎遗传学诊断的方法。 (三)在遗传修饰生物( genetically modified organisms,GMO)中的应用 近年来可见应用多重PCR技术在转基因成分定性和定量检测的报道。陈文炳等用多重PCR方法在反应体系中加入13对引物同时检测转基因矮牵牛与阳性对照质粒中的1~3个外源基因,包括花榔菜花叶病毒( cauliflower mosaic virus, CaMV)35S启动子、根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶(Npt)编码基因。结果表明,多重PCR不但可以提高检测效率、降低检测成本,还可以有效防止假阳性结果的出现 四)基因重排 免疫球蛋白( immunoglobulin,Ig)和T细胞受体( T cell receptor,TCR)位点包含很多不同的V、D、J基因片段,参与早期白细胞分化的重排过程。VDJ片段重排由重组酶复合体介导,其中RAG1和RAG2蛋白通过识别、切割DNA重组信号序列( recombination signal sequences,RSs)发挥重要作用,RSS位于V基因下游、D基因两端和J基因上游。不合适的RSS会降低甚至完全阻止重排。 van dongen等成功建立了一种多重PCR方法并将其标准化,能够检测同源细胞重排免疫球蛋白和T细胞受体基因、染色体畸变t(11;14)和t(14;18)。在18个多重FCR反应中,可以使用107对不同的引物进行扩增。14个Ig/TCR和4个BCL/BCL2多重反应体系证明了多重PCR反应完全适合淋巴增生缺陷的克隆研究,并且具有较高的敏感性。特别是在疑似B细胞增殖中与IGH和IGK联合应用,疑似T细胞增殖中与TCRB和TCRG联合应用具有极高的克隆检出率 (五)抗性基因检测 抗生素的广泛使用导致具有耐药性微生物的增多,比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( methi-cillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、万古霉素抗性肠球菌( vancomycin resistant enterococcl)和多重耐药结核分枝杆菌( multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis)等。这些病原的快速检测及对应的抗生素抗性快速检测对于隔离病人和阻止疾病的进一步蔓延是很重要的。多重PCR方法能够对这些抗生素抗性基因进行同时检测,节省时间,具有较高的敏感性和特异性。 Strohmenger等应用多重PCR方法同时检测金黄色葡萄球菌的9种耐药基因,包括mecA、aacA~anhD、tetK、tetM、emA、emC、wtA、wtB和wC,并且在反应中加入另外对引物,扩增金黄色葡萄球菌的16 SrRNA作为阳性对照。通过对分离的3株金黄色葡萄球菌进行检测,多重PCR结果与肉汤微量稀释实验得到的抗性表型一致,证明了多重FCR是一种识别抗生素抗性的快速、简便、精确方法,并且可以用于临床诊断、流行病学研究中用于监测抗性基因的传播还可用多重PCR方法同时检测质粒介导的喹诺酮抗性基因qmA、qrB和qnrS,并用来筛选科威特分离的64株产超广谱内酰胺酶( expanded- spectrum beta-lactamase,ESBL)的肠细菌。 相关阅读： PCR标准反应体系及反应体系优化 实时荧光定量PCR原理 16SrRNAPCR
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