科学网—标签

相关帖子	版块	作者	回复/查看	最后发表

pujvzi 2018-9-10 20:40

卵母细胞和早期胚胎 S 期及 DNA 复制之检测实验目的：对卵母细胞的 DNA 复制和早期胚胎的 S 期的鉴定。试剂耗材：（1）固定液：4% 多聚甲醛；（2）PBS，4 度保存，备用。（3）PBS+3%BSA，是为洗液。（4）PBS+0.3%Triton，是为透膜液。（5）BeyoClick™ EdU-488 细胞增殖检测试剂盒。（6）封闭液：PBS+0.1% 吐温 +1%BSA，过滤，四度保存。（7）洗液：PBS+0.1% 吐温，过滤，4 度或室温保存。透膜液（PBS+0.1% 吐温 +0.1% 曲拉通）。（8）封片剂。（9）抗体：略。（10）DNA 染料：Hoechst33342，Hoechst33258，PI，DAPI。（11）羊毛脂：不可用指甲油。（16）载玻片 / 盖玻片。（17）湿盒：暗盒加水。（12）培养皿 / 口吸管 / 台式显微镜等实验样品：小鼠 / 人的裸卵或早期胚胎等（以裸卵为例）。实验步骤：（1）将 EdU 用培养液稀释为 10μM，分装，-20 度保存。（2）将卵母细胞实验组，对照组在 EdU 培养液中处理 2h-3h。（3）固定：4% 多聚甲醛室温固定裸卵 15 分钟。（4）透膜，室温 15 分钟。（5）PBS+3%BSA 洗液，清洗 3 次，每次 5 分钟。（6）在步骤（5）时，配制反应缓冲液。按碧云天试剂说明书配制，其中某些试剂可以分装。每次只需配制 200 微升，或者更少体积。（7）将（5）之裸卵放入（6）之反应液中，室温 1 小时。（8）洗液洗三次，染核。（如果想标记抗体，则在清洗三次后，封闭，孵育一抗，略）（9）封片。问题分析：（1）此方法是检验细胞所处细胞周期阶段的快捷办法？（2）卵母细胞中的 DNA 复制？（3）卵丘细胞中的 DNA 复制？

个人分类: 实验技术|2322 次阅读|0 个评论

[转载]人类首次拍摄DNA复制

热度 3 fqng1008 2017-6-21 09:41

近日，来自美国加利福尼大学的科学家Stephen博士在顶级杂志《Cell》上发表成果称，所在团队创奇迹般的摄录了单个DNA分子复制的近距离高清无码影像。事实证明人类半个多世纪以来“臆想”的模型是何其错误百出，此发现彻底改写我们高中所学的生物知识，颠覆了整个科学界！传统观念中，DNA双螺旋结构由4类不同碱基相互交织成链。在遵循碱基互补配对原则、半保留复制与半不连续复制等规则的条件下，解旋酶、DNA聚合酶与连接酶等物质分别作用于链状结构，使得新产生的遗传物质与母体完全匹配。其中最为特征的现象是位于前导链与滞后链上的DNA聚合酶在某种程度上彼此协调，以避免在解旋时引发突变。团队的科研人员从大肠杆菌中提取出单个DNA分子并施加着色剂，令科学家震惊的是，实时镜头显示出真实的DNA在复制过程中，连接酶并不相互协调，而是每条单链高度独立复制，充满随机性，最后却能够完美与母链相匹配！在镜头中，时而滞后链停止运行，但前导链继续增长，时而其中一条链突然以10倍正常速度开始复制，毫无规律可寻！此外，由于缺乏协调性，DNA甚至可以一脚踢开解旋酶来暂停复制，以使DNA聚合酶赶上进度。结晶的DNA 这一事实足以引发科学界对生物遗传稳定性的重新思考！如果这两条链独立运作，那么解旋的DNA如何知道做到确保复制过程有条不紊的进行？又如何在特定的时间点控制复制速度来避免遗传突变？生命真的太过玄妙，或许人类离真相还有很长一段路要走。

个人分类: 临床研习|2372 次阅读|3 个评论

我也谈进化论的误区--进化就在我们身边

smallland 2011-1-2 00:13

贝格尔号的远航成就了达尔文的进化论，其理论主要是在化石和大尺度的比较研究基础上诞生的。这给非专业者造成了一个普遍的误解，认为不研究化石，不研究物种形成和物种灭绝，没有长期的研究积累，没有长途跋涉，就不可能研究进化问题。一位生态学教授就曾表示，我们凭什么研究进化问题？我们有足够的时间？我们有足够的材料？类似的疑问，还是因为对进化论，对什么是进化的理解偏差。达尔文的研究也不只是大尺度的，他对相邻岛屿的物种比较，对家养动物变异观察，对动物表情的描述，都是很细腻的，具有生物学基本素养者都能做到。生物进化时时刻刻都在进行着，只要生物不灭亡，它就总在进化之中。因为，生物的DNA复制不像电脑程序复制那样准确，总是要出错误的（电脑复制也会出错，只是概率低），而错误就是进化的基础，或者说，进化就是对复制错误的选择过程。DNA复制的错误没有好坏，这和人范犯错误差不多，要看环境，有的错误中文革期间就有好处，在太平盛世就有坏处。同样的错误，在美国吃不开，在中国可能就是值得赞美的。时势造英雄，其实不是造，而是选择，并且，常常选择了一些心狠手辣家伙。同样是简单的细菌，现在的细菌和几亿年前的细菌肯定是不同的，如果几亿年前的一个菌落被原封不动地保存在现在，它可能也无法存活了，它会感叹这是什么世道啊，人的大肠怎么像个制药厂，到处是药味！超级细菌的产生就是生物进化过程。它没有变得更复杂，也没有变得更高级，但是它的确进化了，在短短的几年或几十年内变得更适应这个全新的环境了。这个变，不是魔术，而是通过分裂繁殖实现的。这就是进化。生物进化无处不在，无时不在。在我们讨论这个问题的时刻，说不定某种细菌又获得了不被发现的新能力。

个人分类: 未分类|3578 次阅读|0 个评论

没老死就学死：再答/问meta

Eucommia 2010-12-23 06:34

我在《活到老，学到老- 答meta 》一文中回答了meta先生对刘实 DNA 半保留复制的细胞生物学意义的疑问，并向全科学网的网友发出了今后会著名的崔克明之问：DNA半保留复制是什么意思，它在细胞生物学的意义究竟是什么？如何回答这个问题？ meta 先生/女士采取了教条主义的方法和理论不联系实际的做法，因为他（她）只相信书本上说的，可见其受应试教育的毒之深。我对我的学生一直说，老师说什么就干什么的学生不是好学生，仅靠课本说话的就更不是好学生。他/她/它（中性人）在我《活到老，学到老- 答meta 》一文下首先答道或批到：教科书关于半保留复制的过程：半保留复制产生的子代DNA中，一条链来自于亲本链、另一条链是新合成的，DNA复制产生两条一样的DNA分子，然后分别进入到各自的细胞，所以在细胞分裂时，不管是母细胞，还是子细胞，其中的基因组DNA一条链是老的，一条链是新链。教科书关于半保留复制的意义： DNA 半保留复制的意义就在于可以保证遗传物质的稳定性。 meta 先生（女士）所抄袭的这些教科书经典论述我老朽还是知道的，不然怎能在还算是或者说按我们新院长来后外国排名已示的世界一流大学的生科院当教授到光荣退休？那岂不是误人子弟？可 meta 先生的疑问我过去是想都没想过的：怎么会有母细胞保留老DNA模板链，子细胞得到新DNA模板链的说法。直到有一天，我突然发现这世界上还有一个（自称）超一流的生命科学家名叫刘实，才知道那教科书上传承了几百年的观点可能是错的。我说可能是错的是因为我拿不准这刘实是传说中的高人呢（见方舟子《新语丝》的说了白说）还是《Nature》都认可的疯人（见Nature关于Madman评论，吃了刘实的官司后被藏起来了）。所以，我厚着脸皮向刘实求教，要他给我他发表的有关论文看看。本来是想找个大假打打，然后也像方舟子那样出个大名。可一看刘文还中了刘毒。我倒被他的细胞生殖说给忽悠住了，一时间也想从细胞分裂的主流流出，还发表了一些吹刘的博文。幸亏有人及时拉我一把，让我远离牛屎。所以我又立场坚定地回到领导的身边，并借有人给JBC写信告方舟子论文造假而我们的院长都说JBC给他去信说方舟子没造假之机把造假诬告的屎猜到了刘头上（见《我知道谁造假- 答饶毅《猜猜谁造假》》）。而那篇文章竟也成了我老朽在科学网开博以来荣誉最高的一篇，不仅被编辑部精选，还登了榜首，有一阵点击数还高过了科学网的贵博、我们的院长的同期博文。当时我还真兴奋，并借机随风而飘，发表了刘实是否是大科学骗子一文（见《刘实是大科学骗子吗？》），旨在邀请更多的人（当然最好是方舟子）出来批驳刘实的细胞生殖说、保卫传统的细胞分裂论。可让我不解的是，不仅主流的大腕科学家在这大是大非的问题上不言语，就连把刘实看作眼中钉肉中刺的方舟子也不参战。一个打假皇帝敢摘王储的博士帽（真的）却不敢打他专业领域（DNA应是生化的吧）的世界级大假（《中国科学》发表的但却是在世界主流索引有记录的）。这就让我老朽纳闷了。难道这刘实还真是一个实实在在的高人、一个真的超了一流一大截的生命科学家？所以，我退而不休地把更多的刘文给通读了一遍，这下就到中了刘毒而不能自拔的程度。并趁着《Science》杂志提年度突破的机会，把刘实给提了进去，并得到一些实迷不悟的跟进（见《 SCIENCE 的 10 天民主》）。虽然《Science》杂志最后选的年度突破与生命无关，当然也就不会与刘实关于生命本质的最基本发现有关，但《Science》杂志编辑还是感谢我提了很好的意见。因此，当看到科学网征求 2010 年中国科学年度人物提名，我就把刘实也提了上去。科学网编辑部一开始不批，但后来还是批了。这说明刘实还应当是过硬的。而最让我佩服的是最近刘实把砷基生命给治死了。这砷基生命可是被媒体（包括科学网的一些博文）描绘成生命科学的伟大发现并要改写教科书的，而且论文是经过最严格的同行评审发表在最顶尖的《Science》杂志上，可刘实一读该论文后就立马发表评论这是 NASA 又在忽悠。还给《Science》杂志发正式的技术评论批驳，而《Science》杂志还一本正经地要审议刘实等的批评后再让砷基生命创造者答复。被刘实等这样一胡闹，本来应被《Science》杂志选为年度突破的砷基生命竟上不了榜。这下还真让我看到了刘实确是一个超一流的生命科学家的厉害。写跑题了，本应是再答/问 meta 。却吹了一大篇的刘。还是言归正传。开头是答了meta，现在再问meta：你读了刘实的论文吗？如果没读的话，那就好好地读一下。读完后再来发评好吗？其实，读不读得懂刘实的发现是个水平的问题，但读不读刘实的发现就是一个态度的问题。如果不读人家的论文就要怀疑人家的发现，那更是一个学风不正的问题。而这一点不正是中国科学界受西方污染所发生的现代病吗？而刘实对中国乃至世界科学的伟大贡献不仅是他有了众多的世界第一、国际仍领先的超一流发现，更是他以一个科学出版革命先行者的胆识发动和实际领导了一场全球性的科学反腐斗争。他是通过纠正世界高端学腐启迪中国科学发展。附：发表在我〈活到老，学到老 - 答 meta 〉一文下的评论：标题：发表评论人：实在是不值得说 ip:113.57.129.* 上次热议的时候就有很多人指出崔老教师的学识实在是给北大丢脸，无奈老教师还一点听不进去，而且和那无人理睬的高人搞到一起，也不想想世界上多少万科学家都是傻瓜？标题：发表评论人： meta ip:210.36.17.* 可能说重了，但基于你的新博文及你一贯支持徐荣祥的克隆学说，只能说明你对其他研究方向的基本辨别能力还有所欠缺，对您老自己的研究方向我就不知道了。标题：发表评论人： meta ip:210.36.17.* 我不知道为什么崔老先生您不去查一查教科书关于半保留复制的过程及意义，而要发这么一篇没有什么意义的文章。只说一点半保留复制产生的子代 DNA 中，一条链来自于亲本链、另一条链是新合成的， DNA 复制产生两条一样的 DNA 分子，然后分别进入到各自的细胞，所以在细胞分裂时，不管是母细胞，还是子细胞，其中的基因组 DNA 一条链是老的，一条链是新链，怎么会有母细胞保留老 DNA 模板链，子细胞得到新 DNA 模板链的说法。 DNA 半保留复制的意义就在于可以保证遗传物质的稳定性。如果你要力挺刘实的话，就有必要说说两条母链怎么会进入到一个细胞的，如果不能说明，那还是歇歇菜吧。从你的很多博文可以看出，如果你的课题组不被和谐的话，那就太对不起北大了。

个人分类: 未分类|6831 次阅读|0 个评论

双父单母——嵌合体基因分段链接、组合和遗传的猜想

zpf220 2010-7-26 13:28

露希（仪分）雨点（IT) 有关 DNA 半保留复制研究发现， DNA 双链解开之后，复制是分段进行的、不连续的，通过 DNA 连接酶把这些小片段连接成长链。目的：一种自然选择和实验结果推测：基因遗传可能存在双源父本的 DNA 片段同母本的 DNA 片段重组的三联体链接的合成嵌合体机制。方法：人类的自然选择，双源父本产生的二种遗传基因有竞争地配对卵子。实验：女、母和父 1 DNA15 个点位的检测。结果： 10 个完全相符， 2 个完全不相符， 3 个部分质疑。讨论：三种可能性 1. 父 2 具有完全配对的结果 2. 子代超常基因突变 3. 双源父本和母本形成的三联体基因形成分段链接成嵌合体。前言及背景 DNA 分子的复制很有点像一个拉链拉开之后，每半个拉链可再配上半个拉链，这样一个拉链就变成了二个拉链。这种拉链式的复制，其机制主要在于 DNA 分子中碱基配对原则。有关 DNA 半保留复制的进一步研究发现， DNA 双链解开之后，复制是分段进行的、不连续的，在二条链中都按同一方向进行合成，先合成出一些小片断，然后通过 DNA 连接酶把这些小片断连接成长链。孟德尔定律的第 2 法则：等位基因自由组合。但没有考虑连锁的发生，连锁指 2 个基因的等位基因由于在同一个染色体上，可以一起遗传。颗粒式遗传已被认同，并已建立三个概念，基因是重组的单位，是突变的单位，是功能的单位（即决定形状的单位）。这些概念的建立引发出更多的问题，如：基因怎样变异？变异的方式、原因、机制如何？是否还存在人类还未弄清的遗传表达方式？如同人类对血液的认识从一种到 3 种到更多种。在梅塞尔森和斯塔尔研究 DNA 半保留复制之前，美国的另一位分子生物学家科恩伯格（ A.Kornberg ）便已从事 DNA 人工合成的研究。 1956 年他在研究辅酶合成时，发现了一种酶，它能催化由三磷酸核苷生成多核苷酸。他将这种酶命名为“ DNA 聚合酶。在试管中只要加进合适的三磷酸核苷底物（如 A 、 T 、 G 、 C 等四种三磷酸核苷）和少量 DNA 模板，在这种酶的作用下即能合成出 DNA 分子。穆利斯 Kary Mullis 的构想已经实现它能让二种不同的寡核苷酸有选择的结合在大 DNA 上，其中一个锁住一条链，另一个寡核苷酸锁住另一条链。“通过寡核苷酸对每条样本 DNA 链的指导，我就能得到二条 DNA 间的互补信息，” -------- 通过小心控制寡核苷酸引物附着在 DNA 上的方式，并且当互补链沿初始 DNA 延伸时，不断的停止其增长，接着再次使它们分开，就能得到无数所需要的 DNA 序列。就本文出现的实验结果，再研究上述引文的工作提出：在自然状态下出现类似第三者来源的核苷酸的引物的可能性。即，在精子的竞争中是否有二种精子的基因分别进行颗粒式分段式与同一个母卵细胞中的基因拼接形成新的子代。自然选择 20 年前一对配偶决定要个孩子。父本患一种传染性疾病，被认为是一种基因疾病，具 1/4 遗传可能性。健康、聪明和漂亮的子代是母本的排序和选择。母本对将来基因技术的发展缺乏想象力，无经验判断用基因技术将可以去鉴别二个外貌相似的人的不同基因。于是选择在排卵期以父 1 、父 2 、父 1 的排序（父 2 知情），当月受孕。第二年一个女孩诞生了。实验与结果时间： 2004. 11 地点：中华人民共和国司法部司法鉴定中心法医物证学鉴定室采样：父 1 、母、女各自指血实验：中华人民共和国司法部司法鉴定中心法医物证学鉴定室进行检材处理和检验方法：检材的 DNA 提取和基因型检测按中华人民共和国公共安全行业标准 GA/T382-2002H 和 GA/T383-2002 进行实验报告：中华人民共和国司法部司法鉴定中心法医物证学鉴定室给出位点分析数据见下表：基因位点母亲女儿父亲（父 1 ）孩子生父基因 D8S1179 12 ， 16 12 ， 16 10 ， 11 12/16 D21S11 30 ， 31.2 30 ， 30 30 ， 31 30 D7S820 9 ， 11 11 ， 11 9 ， 11 11 CSF1PO 10 ， 12 10 ， 10 10 ， 12 10 D3S1358 15 ， 16 16 ， 16 16 ， 16 16 THO1 7 ， 9 9 ， 9 7 ， 9 9 D13S317 ８， 12 10 ， 12 8 ， 8 10 D16S539 9 ， 9 9 ， 12 9 ， 12 12 D2S1138 23 ， 23 19 ， 23 19 ， 23 19 D19S433 11. ２， 14 11.2 ， 15.2 13 ， 15 15.2 vWA 17 ， 20 14 ， 20 14 ， 16 14 TPOX 8 ， 9 9 ， 9 8 ， 9 9 D18S51 12 ， 13 12 ， 18 15 ， 16 18 D5S818 11 ， 12 12 ， 13 13 ， 13 13 FGA 23 ， 24 21 ， 23 23 ， 23 21 表中 15 个位点中位点 D8S1179 全部同母本，与父亲不符； D13S317 和 D18S51 位点女儿与父亲完全不匹配，位点 D19S433 女儿 15.2 父亲 15 相差 0.2 ， FGA 位点母亲 23 ， 24 女 21 ， 23 父 23 ， 23 不符。其他 10 个点位完全匹配。讨论有报道，三联体基因型组合可归纳为三条原则：（ 1 ）当假设父为纯合子时， X=1 ；假设父为杂合子时， X=1/2 ，但杂合子假设父的 2 个基因均可能是生父基因时， X=1 。（ 2 ）只涉及 1 个生父基因时， Y 值等于生父基因的频率。（ 3 ）若涉及 2 个生父基因时， Y 值为 2 个生父基因频率之和。目前对第（ 3 ）条原则的理解还缺少实例，但涉及 2 个生父基因。根据孟德尔遗传定律，子代的基因必须分别来源于其父母双方。一般有二个点位不符可考虑认为是变异已在亲自鉴定行业间得到认可。经典的遗传分析表明，基因是高度稳定的遗传单位，自发突变率很低。但是在自然界也存在某些高突变率的现象，说明也存在高度不稳定的基因。本文所述的子代个体中是否存在高的变异？是否有二种精子的 DNA 基因与同一个母卵细胞核中的 DNA 基因分别进行分段的、不连续的合成，先合成出一些小片断，然后通过 DNA 连接酶把这些小片断连接成子代的具备二种副本特征的 DNA 长链可能？在“精子的竞争”一书中看到了人类性活动中有二种精子的竞争存在。已有很多报道人工对 DNA 片断进行切除、剪接和 DNA 的突变等生命的多样性研究。事实上这不是普遍现象是极个别的现象，假设存在也难捕捉，在此提出给有条件的实验室和感兴趣的研究者做青蛙实验。既使是个负结果也是一种实验经验和结果的积累。也是本文的目的所在，避免本文的实验局限。弄清作者的特例产生的特殊视角。对上述问题在本实验中确认的最好办法是父 2 来检测，可是父 2 不能配合。此外，从三人的外貌特征上看，子代的眼睛、鼻子明显像父 1 ，后脑勺高发根的特征也像父 1 。有研究报告指出：假设父亲与小孩之间共有一种很罕见的特征，例如多指症，那么两人的亲子关系几率就很高。人类遗传学家人类基因组组织的前任主席沃尔特，博德默尔爵士曾指出：超前于时代的想法必须等待技术的发展及其他科学家观念的更新，这可能是遗传学发展的主旋律。致谢感谢 Dr. Robin Baker （精子战争作者）对本文作者所做工作的鼓励和建议。感谢基因探奥秘主编李绍武教授、基因组 T.A. 布朗教授、人之书沃尔特，博德默尔爵士 (Bodmer,W.) 在他们的工作的基础上我们才能对碰到的疑惑，未无奈而过，撰成此文，以期共同探讨。参考文献：略

个人分类: 生活点滴|2809 次阅读|1 个评论

帐号		自动登录	找回密码
密码			注册

关闭安全验证

标签: DNA复制

相关帖子

相关日志

关闭 安全验证

标签: DNA复制

相关帖子

相关日志

关闭安全验证