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实例图解简并引物设计（By Raindy）: 热度 1 raindyok 2013-10-29 21:34; 【絮语】　　设计一对合适的引物是PCR扩增目的基因成功的关键，但许多人往往过度依赖 Primer Premier（以下简称PP）或Oligo 等引物设计软件，有时候引物没设计成，却身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y病毒CP基因简并引物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引玉作用。受专业领域及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、童鞋批评指正。【相关工具】　　（1） MEGA5 -多重序列比对、选取基因区域、序列编辑　　（2） DNAMAN8 -检测两引物的互补性　　（3） Oligo Calc -评估引物的属性　　（4） Web Logo 3 -直观显示简并碱基 -----------------------------------------------【华丽分割线】----------------------------------------------- 【基本原则】　　设计一对好的引物，归结起来就是 5 ′端引物、3 ′端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处：　　（1）两引物的序列要与模板的序列紧密互补；　　（2）两引物不能在模板的非目的位点发生错配；　　（3）两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。【延伸原则】　　（1）引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合DNA聚合酶反应；　　（2） GC含量：一般介于40%-60%之间，且两个引物之间的GC含量相差不能过于悬殊；　　（3）碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的GC，GC富集区容易导致错误引发反应。【特别注意】　　 5 ′端引物的作用主要限定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大；引物的延伸是从 3 ′端开始的，所以 3 ′端引物是影响特异性扩增的最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3 ′端引物时，需要综合考虑以下几个内容：　　（1）不要终止于密码子的第 3 位　　（2）末位碱基避免使用碱基 A 　　（3）避免出现3个以上连续的G或C，如GCG或CCC或GGG 　　（4） ΔG的绝对值不可超过 9 　　（5）与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8个互补碱基同源　　（6）不能进行任何修饰 ----------------------------------------------------【华丽分割线】------------------------------------------------- 【设计流程】　　实例操作：　　请访问科学网论坛-《实例图解简并引物设计（By Raindy）》 http://bbs.sciencenet.cn/forum.php?mod=viewthreadtid=1280587fromuid=460481 　　如果论坛也无法下载，请移步我的网盘-生信教程目录下载： http://raindy.ys168.com/; 个人分类: 软件教程|29386 次阅读|2 个评论

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