植物组织培养试验怎么设计？ / 刘进平 一、为什么植物组织培养结果难以复制？ 在进行植物组织培养工作的时候，常听到有的学生问这样的问题，为什么我按照别人文献中提供的最适培养基怎么做不出来呢？这种问题如果不是作者有意作伪或提供假的培养基配方的话，那么问题可用下面一段话来解释。 Tissue culture techniques are often plagued by unknown variables. Consequently results obtained in one experiment are not always reproducible in subsequent ones, or results which can easily be duplicated in one laboratory, sometimes are not reproducible in another. Problems may also arise when successful routines established in small-scale initial experiments are modified to produce the same results on a larger scale, more efficiently, and at lower cost. Such new routines may mean slightly modified methods of media preparation, different types of culture vessels, larger growth cabinets, etc., with each of these steps possibly introducing unsuspected unknown changes, significantly affecting the results. （引自蒋悟生《生物专业英语》，北京：高等教育出版社， 2000 ， pp251 ）。 其大意是说，组织培养经常受很多未知因素或变量困扰，因此一次试验中获得的结果很难在下一次试验中重复，或者一个实验室做出的工作难以在另一个实验室进行复制。小规模试验中成功的方法需要加以调整才能在大规模试验中更有效更低成本地产生同样的结果。因此需要对培养基配制、不同类型培养容器的选择、不同大小培养箱的使用等方面加以调整。植物组织培养的每个步骤都可能引入不能预期的未知变化，并显著地影响培养结果。 二、植物组织培养试验要试验那些因子？ （ 1 ）不同类型的外植体： 茎尖 、 分生组织 、顶芽、 腋芽 、带芽 茎段、 节间、叶片、叶柄、根、花序、花瓣、花丝、子房壁、合子胚等。 （ 2 ）不同基因型的供体植株：同属的不同种，或同种的不同品种，或同一品种的不同无性系等。 （ 3 ）不同发育时期或生理状态的供体植株及外植体： 幼龄阶段 或成熟阶段的供体植株，不同生长环境条件下的供体植株，幼嫩或成熟的外植体类型。这对于木本植物来说特别重要，因为外植体来源有幼态和成熟态的区别。一般说来，木本植物 幼嫩 （ 非木质化 ） 组织一般比年老的木质化的组织 培养效果好。幼态或复幼的材料如根上抽出的根出条或分蘖条，生殖生长（开花）开始时或旺盛生长时主茎基部抽出嫩枝是最好的外植体来源，而成熟态材料（成年树的树冠部分）则难以 组织培养 。 （ 4 ）表面消毒及外植体处理方法：对于热带植物，试验不同类型的消毒剂、浓度组合和消毒时间克服消毒困难是最重要的工作。如果因内部污染难以克服，则需采用无菌种子播种获得无菌实生苗外植体、 大田中采集植物材料 在温室或实验室扦插成活后采集外植体，或者从大田外植体上采集的芽真接进行分生组织培养。此外，外植体的处理方法如流水冲洗也是一个方面。外植体的褐化是困扰热带植物组织培养的另一个问题。 植物种类 或 基因型、外植体 采集时间、采集 部位及生理状态、培养基成分 、培养条件、继代 培养时间 等都影响 褐变 的发生。可采用接种较大的外植体、接种前热激预处理、 幼龄材料 及分 生或幼态部位 外植体 接种 、改变接种方向如水平或倒置接种、降低培养基中 无机盐 和植物生长调节物质浓度、避免 过高的温度和 过强的 光照 、 及时转 接到新鲜的培养基（如每隔数小时就转接一次，直到不再出现褐化为止）、 外植体采集后用流水冲洗 30 分钟以上 、 接种前先将外植体在无菌水中浸泡处理 、 使用液体培养基 、在培养基中 加入 吸收性物质（如 活性炭 、 聚乙烯 吡咯烷酮）或抗氧化物质（如柠檬 酸 、 维生素 C 、 硫化硫酸纳 ）等。 （ 5 ）不同的基本培养基： 盐量高的 、 硝酸盐含量高的 、 无机盐中等含量 的和 低盐含量基本培养基 加以试验。或者从著名的基本培养基如 MS 、 WPM 或 B5 等开始试验并加以改良。 （ 6 ）培养基配方或组成：主要是对生长调节物质的种类和浓度组合进行试验，可采用单因子或多因子试验设计。也可参考文献或根据经验来设计几种培养基，这需要深入了解各种生长调节物质的特性与不同外植体的培养反应。 （ 7 ）接种方式：不同大小不同部位的外植体，竖插或横插入一定深度或平伏在培养基表面。按照器官自然生长极性或相反接入培养基。转接时间和频率也是一个重要方面。 （ 8 ）培养方式：固体培养、液体培养、半液半固培养等。 （ 9 ）培养条件：光照和温度是最主要的影响因素，光照有全光照（连续光照）、黑暗条件、散射光照、一定光照时间的光周期。培养温度比如 22-25 ℃、 25-28 ℃、 28-31 ℃不同范围，或者采用不同时间间隔的变温处理（如先低温后高温或先高温后低温）。 （ 10 ）不同的再生途径和发育路线： 器官发生和体细胞胚胎发生是植株再生的两种最基本的途径。无论器官发生还是体细胞胚胎发生又都可分为直接发生和间接发生（经愈伤组织培养阶段）。带芽茎段或芽可采用 单节培养（或微型扦插）或丛生芽方式等增殖。 需要指出的是： A 、上述影响因素中， 培养基配方或组成是最主要的影响因素，要重点试验，但前提是成功地克服污染和褐化问题之后。 B 、在每一种处理中，接种的外植体数量（样本大小）多多益善，至少不能少于 20 个，否则难以说明问题。 C 、保存原始数据，对结果进行统计学处理（如显著性分析、 t 测验等）将大大提高你的论文质量。 D 、用照片记录组织培养全过程的几个重要阶段, 这对将来发表文章至关重要。 （版权所有，转载或引用要注明科学网 - 刘进平博客，否则一经发现将追究责任并加以曝光）
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