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斑马鱼-基因型-鉴定：基因组粗提-PCR-电泳（-测序）: HantsingWang 2018-6-9 18:04; Last Updated 20/03/2018 by Hantsing Wang 器材：纸杯，剪刀，烧杯一、麻醉剪鱼尾鳍：从系统中取出需要鉴定的鱼，烧杯中加入 Tricaine （ Tricaine 麻醉剂用量， 5g/L 存储 , 约 1:20 稀释， 200-300mg/L 麻醉用。），将鱼置于烧杯中至昏迷，纸杯中加系统水，减去 2/3 尾鳍，剪一次洗一次酒精擦一下，尾鳍置于已经编号的 tube （ 1.5ml 管）中，鱼放入对应编号的纸杯。二、 DNA 提取： ① tube 中加入 150ul ， 50mM NaOH 溶液（要测 pH 看是否为碱性，用 2MNaOH 配制），离心使鱼尾在管底，在 95 ℃金属浴中加热 40-60min 左右（至组织完全消解，溶液呈黄色），每 20-30min 震荡一次； ②将 tube 置于 4 ℃冰箱冷却 1-2min ，在加入（ 1/10 体积） 15ul 的 1M Tris-HCl ， pH7.5 中和； ③在 4 ℃， 12000rpm 离心 15min ，将上清液移到另一管中，做好标记（若不进行鉴定，可在 -20 ℃贮存）；三、 PCR 扩增：（ 25ul 体系）（加液从大到小） Taq DNA polymerase ：（溶解在甘油里，每管分开了加，效果好） ① rTaq 0.2ul(buffer 含 Mg2+ ，若无，需要加 Mg2+ ， 2ul)(5U/ul) ② EX-Taq 0.2ul 酶活力大小有 2 个单位， kat 和 U 。 1min 内能转化 1 umol 底物的酶量称为 1 酶单位（ U ）， 1s 内能转化 1mol 底物的酶量为 1 katal （简称 kat ）。它们的换算如下： 1 kat=6*10^7 U ， 1U=16.67n kat 。 PCR 反应： ①充分变性（ 93 ℃ -95 ℃， 4min ） ②循环条件：（ 30-40 cycles ）变性（ 93 ℃ -95 ℃， 30s ）退火（ 55℃-65℃ ， 30s ，温度根据引物设计调整）延伸（ 72 ℃，根据引物设计产物长度） ③充分延伸（ 72 ℃， 15min ） ④ 4 ℃保存转基因鱼， GFP 的编码序列是 700 多 bp ，编码一个 238 个氨基酸的蛋白。蛋白质分子量 26.9KDa ，（ 1kDa=1000 摩尔质量）。 GFP 之所以能产生绿色荧光是由于其蛋白分子多肽链内含有特殊的生色团结构 , 即第 65-67 位氨基酸 Ser- Tyr- Gly 链内环化加氧形成对羟苯甲基咪唑环酮 , 和周围其它三个氨基酸形成六肽生色团。四、琼脂糖（ agarose ）凝胶电泳琼脂糖具有亲水性，不带电， DNA 在碱性环境下带负电， EB 可镶入 DNA 分碱基中形成荧光络合物， DNA 分子片段长度，构型不同，泳动速率不同，紫外光照射下形成不同区带。 ①闭环（超螺旋）②开环③线形的螺旋率依次降低。在琼脂糖电泳的前后顺序是： ①闭环（超螺旋） ③线形 ②开环。开环质粒是指双链环状的质粒 DNA 有部分解链，因此电泳速度最慢。判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。溴化乙锭（ EB ）（冷却至 60 ℃左右），终浓度为 0.5ug/ml （ EB 储液， 4 ℃保存，一般是配成浓度为 10mg/ml ） 10 3 ul=1ml ， 1g=10 3 mg=10 6 ug=10 9 ng=10 12 pg 小胶： 0.3g 琼脂糖 + 30ml TAE + 1.5ul EB 大胶： 0.5g 琼脂糖 + 50ml TAE + 2.5ul EB （琼脂糖： TAE ： EB = 1g ： 100ml ： 5ul ）室温下 30~45 分钟后凝胶完全凝结，小心拔梳子。小孔胶 5ul Marker ，大胶大孔加 10ul Marker ，易扩散，最后加 Marker 0.1ul Loading Buffer （载样缓冲液） + 1ul DNA 样品，混匀后 1.1ul DNA 样品： Loading Buffer=10ul:1ul 混匀，小孔最多 10ul ；中孔 25ul ；大孔 50ul 。跑胶使用 std 模式，电压恒定在 100V 左右，样品跑过 1/2 ，不超过 2/3 停止。研究院在四楼成像。电泳： 1% 琼脂糖凝胶，一般 90-110V 电压，电泳 20 ～ 40min 即可。备注：一、配制缓冲液 1.Tris- 硼酸（ TBE ） (Tris-Borate-EDTA) 使用液浓度： 0.5 ×： 0.0 25mol/L Tris- 硼酸 0.001mol/L EDTA 储存液配制： 5 ×：① 54g Tris 碱 ② 27.5g 硼酸 ③ 20ml 0.5mol/L EDTA （ pH=8.0 ， 4 .65g Na 4 EDTA ，分子式： C10H12N2O8Na4 ），采用 ddH2O 溶解混匀， pH 是 8.3 ，不需要调整，溶液体积 1L 。 2.Tris- 乙酸（ TAE ） (Tris-Acetate-EDTA) 【由三羟甲基氨基甲烷 (Tris base) 、乙酸 (acetic acid) 、乙二胺四乙酸 (EDTA) 组成缓冲液】使用液浓度： 1 ×： 0.04mol/L Tris- 乙酸 0.001mol/L EDTA 储存液配制： 50 ×：① 242g Tris 碱 ② 57.1ml 冰乙酸 ③ 100ml 0.5mol/L EDTA （ pH=8.0 ），采用 ddH2O 溶解混匀， NaOH 调 pH 至 8. 5 ，溶液体积 1L 。二、使用方法：如果要将 50 ×母液稀释成 2000ml 工作液，需要取 40ml 母液，加入 1960ml 水混匀即可， 2000ml 终体积除以 40ml 体积母液就是 50 倍。 Tris- 磷酸（ TPE ）：浓贮存液（每升）： 10 ×：① 108g Tris 碱 ② 15.5ml 85 ％磷酸（ 1.679g /ml ） ③ 40ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) 使用时再稀释 10 倍。 TAE 与 TBE 緩冲溶液的成份： 50xTAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA) 242 g ----------- Tris base 57.1 ml ----------- Acetic acid 100ml ------------ 0.5M EDTA Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5. 10xTBEBuffer (Tris-Borate-EDTA) 108 g--------------- Tris base 55 g --------------- Boric acid 9.3 g --------------- Na4EDTA Add ddH2O to 1 liter. The pH is 8.3 and requires no adjustment. 它们的区別有下列几点： 1. TBE 不能太浓 ( 它只可有 10 times （倍） ) ，因為 borate 会很容易沉淀，但一般有少许沉淀是不会有太大问題。 2. TBE 的缓冲能力 ( buffering capacity ) 比 TAE 高，用 TBE 来跑出來的胶 ( gel ) ，分辨率 (resolution) 会比較高。 3. 因为 TBE 有 borate 离子 (ion) ，它会影响酶 (enzyme) 的工作。因此，若要为分离出的 DNA 进行下一步酶处理，如克隆、限制性酶切 ( cloning / restriction cut ) 的话，就要切记不要让 DNA 碰上 borate ion 。 4. TAB 的缓冲能力 ( buffer capacity ) 比较差， gel 一般比較模糊，但它不会对影响酶的工作。 TE 溶液中含有 Tris 碱（ base ）、 EDTA 。 TE 溶液加入硼酸（ borate ）成为 TBE ，加入乙酸（ acetate ）成为 TAE Tris 全名是 Tris Base, tris(hydroxymethyl)amino - methane 三羟甲基氨基甲烷； 2- 氨基 -2- （羟甲基） -1,3- 丙二醇; 个人分类: 斑马鱼|10203 次阅读|0 个评论

phenotype vs genotype: jjb8104149 2010-12-13 18:01; PhenotypingGenotyping PhenotypeGenotype Phenomics Genomics Phenotypic variationGenomic variation What is phenomics? What 's genomics? How to phenotype and how to genotype? So complex, so fine!; 个人分类: 未分类|3708 次阅读|0 个评论

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