2017年诺贝尔化学奖：研发出冷冻电镜 将2017年诺贝尔化学奖的相关内容转载如下,仅供参考。 2017年诺贝尔化学奖揭晓，瑞士、美国和英国三位科学家Jacques Dubochet，Joachim Frank和Richard Henderson获奖，获奖理由是“研发出冷冻电镜，用于溶液中生物分子结构的高分辨率测定”。三人将均分900万瑞典克朗奖金。 Jacques Dubochet Jacques Dubochet ，1942年出生于瑞士艾格勒。1973年从瑞士日内瓦大学和瑞士巴塞尔大学获得博士学位。现为瑞士洛桑大学名誉生物物理学教授。 Joachim Frank Joachim Frank ，1940年出生于德国锡根。1970年从德国慕尼黑工业大学获得博士学位。现为美国哥伦比亚大学生物化学与分子生物物理学及生物科学教授。 Richard Henderson Richard Henderson ，1945年出生于苏格兰爱丁堡。1969年从英国剑桥大学获得博士学位。现为英国MRC分子生物学实验室项目主任。 冷却显微技术带来生物化学领域的革新 我们也许很快就能看到复杂生命系统的原子级分辨率图像了。2017年的诺贝尔化学奖被授予Jacques Dubochet, Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他们为研发冷冻电子显微技术作出的贡献，这项技术简化并改进了生物分子成像的发展，将生物化学带入一个新 时代。 图像是我们理解一切事物的关键所在。将那些人眼不可见的物体成功地可视化，通常是科研产生突破的基础。但是，生物化学领域的成像技术在过去 很长一段时间内是一片空白，原因在于，已有技术很难对生命的分子机制进行太多图像化描述。是冷冻电子显微技术改变了这一切。现在，研究人员 可以将活的生物分子进行冷冻，并将那些以前无法看见的生物变化过程实现可视化——这对我们从化学角度了解生命以及研发药物带来决定性的影响 。 长久以来，人们认为电子显微镜只能用于观察死去的生物，因为电子显微镜的电子束会杀死活体。直到1990年，Richard Henderson成功地利用一台 电子显微镜生成了一种蛋白质的3D图像，图像分辨率达到原子水平。这次突破奠定了冷冻电子显微技术发展的基础。 Joachim Frank则让该项技术获得广泛应用。在1975至1986年间，他开发出一种图像处理技术，能够分析电子显微镜生成的模糊2D图像，并将其合并，最终生成清晰的3D结构。 Jacques Dubochet则将水这种物质引入电子显微镜中。液态水在电子显微镜的真空管里蒸发，从而使得生物分子瓦解。在上世纪80年代早期，Dubochet成功实现水的玻璃化——迅速将水冷却，让其先以液体状态将生物样本包裹，之后立刻变成固体，从而使得生物分子在真空管中仍能保持其自然形态。 有了他们三人的研究成果为基础，电子显微技术全方位的发展充满了希望。2013年，电子显微镜的分辨率达到原子级别，现在，研究人员很轻松就能获得生物分子的3D结构。在过去数年里，学术论文里随处可见各种物质的高清图像，从具有抗药性的蛋白，到寨卡病毒的外观。如今，生物化学正经历爆炸性发展，准备好了迎接那激动人心的未来。 Three researchers win Nobel Prize in Chemistry for developments in electron microscopy October 4, 2017 A revolutionary technique dubbed cryo-electron microscopy, which has shed light on the Zika virus and an Alzheimer's enzyme, earned scientists Jacques Dubochet, Joachim Frank and Richard Henderson the Nobel Chemistry Prize on Wednesday Thanks to the international team's cool method, which uses electron beams to examine the tiniest structures of cells, researchers can now freeze biomolecules mid-movement and visualise processes they have never previously seen, the Nobel chemistry committee said. This has been decisive for both the basic understanding of life's chemistry and for the development of pharmaceuticals, it added. The ultra-sensitive imaging method allows molecules to be flash-frozen and studied in their natural form, without the need for dyes. It has laid bare never-before-seen details of the tiny protein machines that run all cells. When researchers began to suspect that the Zika virus was causing the epidemic of brain-damaged newborns in Brazil, they turned to cryo-EM (electron microscopy) to visualise the virus, the committee said. Frank, a 77-year-old, German-born biochemistry professor at Columbia University in New York, was woken from his sleep when the committee announced the prize in Stockholm, six hours ahead. There are so many other discoveries every day, I was in a way speechless, he said. It's wonderful news. In the first half of the 20th century, biomolecules—proteins, DNA and RNA—were terra incognita on the map of biochemistry. Because the powerful electron beam destroys biological material, electron microscopes were long thought to be useful only to study dead matter. A screen reveals the images of Jacques Dubochet - from the University of Lausanne, Switzerland, Joachim Frank from Columbia University, USA and Richard Henderson, from the MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, in England, who have been awarded the 2017 Nobel Prize in Chemistry, during a press conference, at the Royal Academy of Sciences in Stockholm, Wednesday, Oct. 4, 2017. The Nobel Prize for Chemistry rewards researchers for major advances in studying the infinitesimal bits of material that are the building blocks of life. (Claudio Bresciani/TT News Agency via AP) Tea party to celebrate But 72-year-old Henderson, from the MRC Laboratory of Molecular Biology in Cambridge, used an electron microscope in 1990 to generate a three-dimensional image of a protein at atomic resolution, a groundbreaking discovery which proved the technology's potential. Frank made it widely usable between 1975 and 1986, developing a method to transform the electron microscope's fuzzy two-dimensional images into sharp, 3-D composites. Dubochet, today an honorary professor of biophysics at the University of Lausanne, added water. Now 75, he discovered in the 1980s how to cool water so quickly that it solidifies in liquid form around a biological sample, allowing the molecules to retain their natural shape even in a vacuum. The electron microscope's every nut and bolt have been optimised since these discoveries. The required atomic resolution was reached in 2013, and researchers can now routinely produce three-dimensional structures of biomolecules, according to the Nobel committee. The trio will share the prize money of nine million Swedish kronor (around $1.1 million or 943,100 euros). Normally what I'd do if I was in Cambridge, we will have a party around tea-time in the lab but I expect we'll have it tomorrow instead, said Henderson. Joachim Frank, of Columbia University, is hugged by his wife Carol Saginaw, in their New York City apartment, Wednesday, Oct. 4, 2017. Frank shares this year's Nobel Chemistry Prize with two other researchers for developing a method to generate three-dimensional images of the molecules of life. (AP Photo/Richard Drew) 'Beautiful pictures' The prize announcement was praised by the scientific community and observers around the world. By solving more and more structures at the atomic level we can answer biological questions, such as how drugs get into cells, that were simply unanswerable a few years ago, Jim Smith, science director at the London-based biomedical research charity Wellcome, said in a statement. Daniel Davis, immunology professor at the University of Manchester, said details of crucial molecules and proteins that make the human immune system function, can now be seen like never before. It has been used in visualising the way in which antibodies can work to stop viruses being dangerous, leading to new ideas for medicines—as just one example, he said. John Hardy, neuroscience professor at University College London, said Dubochet, Frank and Henderson's technique has transformed the field of structural biology. It has been used, for example, to compile a detailed identikit of an enzyme implicated in Alzheimer's. Knowing this structure opens up the possibility of rational drug design in this area, Hardy said. And as a biologist, I can say that the pictures are beautiful.
原文链接： 冷冻电镜（cryo-EM）顶级泰斗理查德·亨德Richard Henderson | 人物 图为Richard Henderson获得科普利奖时接受采访所拍摄 人物背景： 理查德·亨德森（Richard Henderson），剑桥MRC分子生物学实验室教授，苏格兰人，生于1945年。1983年，年仅38岁的Henderson当选英国皇家学会院士。2016年，英国皇家学会决定将当年的科普利奖章（Copley Medal）颁发给Richard Henderson。 科学生涯： Richard Henderson是典型的“纯粹科学家”，科学生涯几十年，一直坚持在一线亲自做实验，大量成就均以第一作者、甚至唯一作者发表论文（注：在生物领域，对于非理论研究而言，这意味着Henderson教授本人就是科学实验或数据分析的实际执行者，通信作者一般意味着研究内容的指导和统筹规划）。1975年， Henderson与其合作者Nigel Unwin利用电子显微三维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构(Henderson and Unwin,1975)。这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋结构，也是人们首次利用该技术看清楚生物对象的二级结构。当时Henderson教授做出这项成果的时候，冷冻电镜还没有诞生，样品辐射损伤极其严重，只能依靠二维晶体中大量规则排列的分子平均效应抵消辐射损伤影响。在当时的环境能完成这样的创举，在今天看来都是一件不可思议的事情。 80年代中期，冷冻电镜技术诞生；Henderson教授也在随后解析了冷冻状态下的3.5埃分辨率的细菌视紫红质二维晶体结构(Henderson, R. et al, 1990)。稍稍有点遗憾的是，那个年代，电镜技术完全处于萌芽状态，分辨率上还无法和X-射线晶体学媲美，最早的跨膜螺旋只有7埃，对解释原子层次的机理存在一定困难，而从7埃推进到3.5埃近原子分辨率却整整花了15年时间。虽然Henderson第一个观察到跨膜螺旋，但是先于他的3.5埃分辨率结构，第一个膜蛋白3.0埃分辨率的原子模型却是德国科学家米歇尔研究组于1984年利用X-射线晶体学完成的（Deisenhofer, J. et al, 1984）。米歇尔随后获得1988年诺贝尔奖。八九十年代是Henderson重要的转型期，他并没有因为X-射线晶体学的强大技术压力而放弃冷冻电镜相关研究。相反，他深刻地洞察到冷冻电镜可能在未来会成为“极具前景的、更加强大的技术”，他的重心也在随后转向了和冷冻电镜相关的原理、理论和方法研究。 这也从一个侧面反映了Henderson教授研究风格极具前瞻性和深刻洞察力，纯粹以彻底解决科学、理论或技术问题为导向，完全不以发文章为目的，其研究论文也从不“灌一篇水”，更不随便署名一篇论文。他是极其典型的“完全不跟风型”的科学家，因为他“无风可跟”，他就是“狂风暴雨的创造者”。在近几年这场浩浩荡荡的所谓“冷冻电镜革命中”，Henderson教授没有一篇Nature，Science这些所谓的“高大上”的文章，并且曾拒绝在自己博士后的两篇关于超大膜蛋白复合物的Nature论文上署名。虽然他也对这些研究成果大加赞赏，但认为不属于自己目前的研究范畴，不应该因为作者是自己的博士后而随便署名。尽管Henderson近些年的“publication”完全算不上“耀眼”，但每一次冷冻电镜领域有重大突破或具有巨大争议性的研究结果，第一个被邀请“出山”的便是Henderson教授。 而这样一位从不贪图一篇CNS、不灌一篇水、不随便署名任何一篇所谓“高大上”、“奢侈”、“高影响因子”论文的科学家，却是目前整个领域公认的诺贝尔奖得主的最佳候选人之一（假如未来几年诺奖颁发给冷冻电镜）。事实上，Richard Henderson早在20多年就已经预见了“这场革命”。作为分子生物学家出身的Richard Henderson在上个世纪七八十年代便做出了一系列大分子结构研究的里程碑式的工作，并且深刻地洞察到冷冻电镜在未来生物大分子结构研究中的关键意义，毅然决然地于上个世纪八九十年代全面转型发展冷冻电镜相关的理论、技术和方法，并给出了一系列理论和实验上的准确预言(Henderson, 1995)。在冷冻电镜基本原理、理论和方法，图像处理算法和软件均有重要贡献，尤其是在直接电子探测器方面有着“不可替代”的关键影响力。90年代末，在一次3D电子显微镜的GRC（Gordon Research Conference）会议上，同领域一位科学家在报告中悲观提到：“冷冻电镜技术非常有限，不可能超越像X射线晶体学这样强大的技术手段”。Richard Henderson在下一场发言中开门见山，毫不客气地说他完全不同意该观点，并给出了自己的理解和一系列客观严谨的研究结论，并且十分自信地预言:“冷冻电镜会超越其它各种技术，成为蛋白结构研究的主导工具”。20多年以后，在这场冷冻电镜的“革命”中，人们用事实证明了Henderson在上个世纪90年代大量的研究和预言的准确性。当然，随着技术的进一步发展，有的结果甚至超出了Henderson当时的预言。 提携年轻学者： Henderson教授不仅在科学研究方面具有深刻的洞察力和远见卓识，对年轻一辈的学者鉴赏也颇具慧眼，并且能实质性地促进其职业发展。一个典型的例子就是Sjors Scheres 博士。当年多多少少由于publication的原因，他在西班牙那些其实并不具备国际竞争力的研究机构无法获得一份教职，却得到Henderson大力赏识，成为Henderson教授为剑桥MRC分子生物学实验室亲点的“潜力股”，并于2010年正式入职；两年后，Scheres博士拿出了冷冻电镜领域经典之作Relion程序，再两年之后，Scheres入选2014年Nature杂志评出的“十大科技人物”。 Henderson教授不仅仅鼓舞年轻人、促进其职业发展，他甚至“鼓舞”了整个领域。早期的电镜技术根本无法研究生物结构，Henderson则用事实证明了其可行性，在70年代冷冻电镜技术尚未出现以前，便获得了七次跨膜螺旋结构。80年代冷冻电镜技术诞生以后，很多传统的结构生物学家依然不看好这项技术，甚至一度嘲笑其为“blobology”（英文讽刺词语，意思是“只能看见一坨轮廓的技术”）。而Henderson就是那个“逆潮流而行的未来开创者”，直接着眼20年后，并且用事实一次又一次鼓舞整个领域保持乐观心态向前发展、着眼未来。 个人八卦： Henderson教授在同领域其他“大牛”眼中的地位到底如何呢？凯哥也八卦一下多年前参加电镜学习班时的一个插曲。那时，大家都在会后开啤酒聊天、自由讨论，有位大牛发现Henderson被围着，手头没有拿到beer，十分着急，赶紧去帮Henderson开beer，然后顺便说了一句略带玩笑的话：任何人的beer你们都可以自己去开，但Richard的beer我必须要亲自为他开”。话说这位大牛自己本身也是皇家院士... 另外再八卦一些实验室里发生的小细节。按道理，一个人38岁当选皇家院士，这种履历早就风光无限，瞬间秒杀一切同行，仅凭其学术威望就有可能轻而易举获得大量人力财力物力等等方面的支持。但是Henderson教授亲自在一线做研究、做实验的习惯一直保持到现在。Henderson教授今年已经72岁，凯哥还经常在半夜两三点看到他在电镜室做实验。这种情况必须发生在两个人同时熬夜的前提下，按道理应该是小概率事件。所以好奇之下，凯哥估算了一下自己熬夜的先验概率，以及凯哥在场情况下观测到Henderson教授熬夜的条件概率，然后计算出Henderson教授单独熬夜做实验的先验概率，着实吓了一跳！ 好了，不扯太多八卦了，已经大致介绍过了冷冻电镜领域这位泰斗。下一次，凯哥将和大家分享Richard Henderson教授有关冷冻电镜的一段十分钟的视频介绍。凯哥已经将Henderson所讲的内容，逐句对照意译为中文，希望对读者有所帮助。下回见！ 科普利奖简介: 该奖始于1731年,为科学界最古老的权威奖项，已有近300年历史。颁奖不分学科，所有学科一起参评，每年只颁发一人，爱因斯坦、达尔文、高斯、法拉第、门捷列夫、普朗克、沃森、克里克、桑格等等划时代的科学家都曾获得该奖。目前该奖通常只颁发给已经获得诺贝尔奖的科学家（也就是说一般情况下是从诺奖得主中二次筛选），Richard Henderson是极少数的例外之一，另一个例外是黑洞蒸发理论提出者史蒂芬·霍金。 参考资料： Deisenhofer, J., Epp, O., Miki,K., Huber, R., and Michel, H. (1984). X-ray structure analysis of a membraneprotein complex. Electron density map at 3 A resolution and a model of thechromophores of the photosynthetic reaction center from Rhodopseudomonasviridis. J Mol Biol 180, 385-398. Henderson, R. (1995). Thepotential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomicresolution microscopy of unstained biological molecules. Q Rev Biophys 28 , 171-193. Henderson, R., Baldwin, J.M., Ceska, T.A.,Zemlin, F., Beckmann, E., and Downing, K.H. (1990). Model for the structure ofbacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy. J Mol Biol 213 , 899-929. Henderson, R., and Unwin, P.N. (1975).Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy.Nature 257 , 28-32. Kuhlbrandt, W. (2014). Cryo-EM enters a newera. Elife 3 , e03678. https://en.wikipedia.org/wiki/Copley_Medal https://www.timeshighereducation.com/people/interview-richard-henderson-university-of-cambridge#survey-answer 致谢： BioDEM的柳正（哥伦比亚大学）、陈硕冰（北京大学）、张小康（浙江大学）、张智慧（中科大）在本文内容和校对方面给予重要帮助，特此感谢！ 更多参考： 什么是2015年最受科学界关注的新技术？ 往期文章： Bio3DEM公号和论坛介绍 如何解决取向优势？ Cryo-EM 初学者入门资料集锦（一）
【编者按】近年来冷冻电镜技术的发展非常迅猛。软件与硬件发展的完美结合，使得利用冷冻电镜进行生物大分子结构解析的分辨率和效率都大大提高，有关方法学突破和具有里程碑意义的重要结构解析结果也层出不穷。最近Nature Methods 上发表的文章 “cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination”（ 点击这里看该文的解读 ），在年轻学子中引起了又一波关于从事冷冻电镜的研究者是否很快失业的讨论。 为此，中国生物物理学会特邀请冷冻电镜方面的专家、清华大学生命学院院长、北京结构生物学高精尖创新中心副主任王宏伟教授（将担任 3D EM- Gordon Research Conference 2018年副主席，2019年主席，详情请点击左下方 阅读原文 ）撰文，回顾冷冻电镜的发展历程和目前的发展态势，并分析了冷冻电镜技术中尚未解决的重要问题，以及未来发展的趋势。期待本文能够帮助结构生物学领域的年轻学人及时调整心态和知识结构，适应甚至引领冷冻电镜领域的发展和变化。 王宏伟教授 （图片来自清华大学官网） 最近，我第 50 次收到邮件咨询应该如何建一个最新型的冷冻电镜设施。今天，如果你有机会问一个世界知名大学的校长：“您的学校生命学科发展有哪些最需要的设备？”冷冻电镜很可能是位居首位的大型设备之一，当然前提是学校有足够的经费来支付昂贵的设备采购、安装与运行费用。与此形成鲜明对比的是， 5 年前，相当多的大学还在考虑是否应该在本校设立冷冻电镜这个研究领域； 10 年前，绝大多数的学校可能还不知道居然有一种电子显微镜要用“冷冻”来做定语。 现代生命科学的发展速度飞快，某些领域的发展甚至可以用“日新月异”来形容。冷冻电镜技术在过去 3 年来的表现绝对配得上这个词。利用冷冻电镜进行生物大分子结构解析，不需要大量样品，不需要结晶。其解析结果的分辨率不断刷新世界纪录，结构解析的诸多算法层出不穷，结构解析效率也迅速提高。很多科学家苦苦钻研了十几年乃至几十年的复杂结构很快被解析出来，如 TRPV channel ， spliceosome ， calcium channel ， respirasome ， dynactin 等。现在，几乎所有的结构生物学家都在试图学习冷冻电镜技术，或者与冷冻电镜实验室开展密切的合作。 如今，全世界所有的冷冻电镜平台都人满为患。高端仪器设备的供不应求已经成为结构生物学家抱怨最多的问题之一了，甚至可能比对经费申请困难的抱怨还要多。 5 年前，我们建设清华冷冻电镜平台时曾有人担心：“这么多的高端冷冻电镜（ 3 台 300kV 电镜），未来会有足够的人使用吗？它们的运行费用将如何维持？”今天，我们遗憾的是当初没有规划更多的设备与空间，导致现在的运行机时非常紧张。虽然我们平台的运行效率已远远高于设计规划，却仍然无法满足日益增长的用户需求。目前，美国、英国、欧洲、日本都纷纷在建设或筹划建设国家级冷冻电镜中心，希望通过集中的平台资源为全世界的结构生物学家提供高效的数据采集与分析服务。能否以同步辐射光源的运行模式来实现冷冻电镜平台的运行，是当下的热点讨论话题。 2016 年是冷冻电镜技术解析出来的结构数目跳跃性增长 的一年 （数据来自 www.rcsb.org ） 冷冻电镜技术虽然在 3 年前一夜走红，却并非横空出世，在此之前，它已经发展了近半个世纪。上世纪 60 年代英国剑桥大学 MRC 分子生物学实验室的 Aaron Klug 领导的小组首次实现了从多个角度的二维电子显微图像获得三维结构，并因此获得了 1982 年的诺贝尔化学奖 。 70 年代美国加州大学伯克利分校的 Robert Glaeser 及其团队率先证明冷冻于液氮温度下的蛋白质分子可以在电子显微镜的高真空中保持在含水状态，并且可以耐受高能电子的辐照而仍然保持其精细结构 。与此同时， MRC 分子生物学实验室的 Richard Henderson 和 Nigel Unwin 应用葡萄糖包埋的技术保持蛋白质二维晶体在真空中的含水状态，并首次用电子显微镜解析了细菌紫红质蛋白的 7 埃分辨率结构 。到 80 年代初，欧洲分子生物学实验室的 Jacques Dubochet 课题组实现了将溶液状态的生物大分子速冻在玻璃态的冰中，在液氮温度下的电子显微镜观察，从而奠定了冷冻电镜制样与观察的基本技术手段 。这也标志着冷冻电镜（ Cryo-Electron Microscopy 或 Electron Cryo-Microscopy ）技术的诞生。 冷冻电镜技术多年的发展已经产生了多种解析生物分子或细胞结构的方法，现在备受瞩目的冷冻电镜结构解析则主要是指单颗粒三维重构技术。该方法通过对大量离散分布的单个分子的电子显微像进行统计分析来解析结构。这种方法最早由美国纽约州 Wadsworth 中心的 Joachim Frank 领导的课题组开发，从 70 年代开始，到 90 年代形成了比较完整的结构解析算法原理 。但是直到上个世纪末，冷冻电镜结构解析的主流方法还不是单颗粒三维重构技术，而是更为成熟的针对二维晶体和螺旋对称性结构的电子晶体学解析手段。这主要是因为单颗粒技术对电子显微镜图像的数量和计算机资源的需求都很大，当时的显微镜及计算机水平尚无法满足要求。进入 21 世纪，电子显微镜硬件的稳定性及自动化程度稳步提升，超大规模计算的能力也大幅度提高，为单颗粒三维重构技术解析生物大分子结构的有效性奠定了良好的基础，使开发新的结构解析算法成为可能。从 2000 年左右开始，多种单颗粒结构解析软件（如 SPIDER ， IMAGIC ， EMAN ， XMIPP ， Frealign 等）各以其特有的优势在领域内得到应用，并大大地推动了单颗粒三维重构技术的发展。到 2008-2009 年，具有正二十面体对称性的病毒颗粒已经可以应用单颗粒冷冻电镜技术解析到原子分辨率，标志着这一技术进入了原子分辨率时代 。冷冻电镜领域的研究团队也日渐壮大起来。在上世纪 80 年代，从事冷冻电镜相关的科研课题组全世界不超过 20 个，总人数在 100 人左右；到本世纪初，冷冻电镜的研究团队有近 50 个；到 2010 年左右，以冷冻电镜为主的研究团队已经超过 100 个。冷冻电镜吸引了越来越多数学、物理学、计算机科学、工程学背景的科学家的加入，新的概念与新的技术被引入到这个领域中来。此时，革新性的技术突破已如箭在弦上。 2013 年底，美国加州大学旧金山分校的程亦凡与 David Julies 组在 Nature 上合作发表了两篇论文，报道了 TRPV1 膜蛋白的原子分辨率冷冻电镜结构，在整个结构生物学领域一石激起千层浪 。几乎在一夜之间， X 射线晶体学界的著名科学家都将他们的目光投向了冷冻电镜技术。在铺天盖地的报道中，很多生物学家第一次听说冷冻电镜，觉得这带来了结构生物学的革命。在冷冻电镜领域的人看来，这也确实是一次革命，是单颗粒结构解析分辨率的革命，而且早在 2011-2012 年间就已经开始了。一种新的直接电子探测成像设备的发明及应用在 2011 年问世，当即在冷冻电镜领域内引起了不小的轰动 。 2013 年初，程亦凡课题组和英国 MRC 分子生物学实验室的 SjorsScheres 课题组独立地发表论文，证明应用直接电子探测成像设备并结合新的图像处理工具可以解析生物大分子的原子分辨率结构 。这种新型的成像设备大大提高了冷冻电镜照片的质量，使原来无法被观察到的结构细节变得清晰。与此同时，更为有效的图像处理与结构解析算法被开发出来。 SjorsScheres 开发的基于概率统计分析的算法 Relion 能更有效地处理低信噪比的图像，成为单颗粒结构解析的利器 。当然，这也得益于高性能计算的迅速发展。 软件与硬件发展的完美结合，促成了一次技术上的飞跃。整个冷冻电镜领域对于这次革命的到来都有些准备不足。所有安装了新硬件、使用新算法的实验室都发现图像存储资源、网络传输速度、计算资源成为新技术使用的主要瓶颈。较早用上了新硬件、新软件的幸运儿，在解析出了高分辨率的结构后，发现模型的搭建与分析是自己并不擅长的技术。与此同时，以 X 射线晶体学为主要研究手段的结构生物学实验室开始应用冷冻电镜技术，很快以他们在生物化学和高分辨率结构模型搭建中的丰富经验后来居上，超过此前一直以冷冻电镜为主要研究手段的课题组。更重要的，新的技术意味着旧有的经验与观念的失效——无论对冷冻电镜图像的评估，还是对结构解析过程的分析，都需要有新的评判标准。而整个冷冻电镜领域则必须对技术革命所带来的新的可能发展方向做更广泛的探索和深入的研讨。过去几年来的多个冷冻电镜国际会议非常激动人心，也令人心惊胆战。几乎每隔几个月，就会有人报道新的方法学突破和具有里程碑意义的重要结构解析结果。 在短短的 3 年时间里，冷冻电镜已经成为生物大分子结构解析的主要方法。冷冻电镜的用户群体正在以几何级数的规模增长。很多不同专业背景的研究人员纷纷加入冷冻电镜技术方法开发的行列中。冷冻电镜单颗粒三维重构的技术正在变得越来越成熟。包括相位板、能量过滤器、物镜球差矫正装置等一系列新硬件设备的应用开发进一步推进冷冻电镜技术的极限；新的软件算法不断涌现，处理效率越来越高，用户界面越来越友好；冷冻电镜数据采集的自动化程度越来越高，操作冷冻电镜设备的技术门槛越来越低。最新的成果包括：对 HIV 病毒衣壳前体可以通过 Tomography 与单颗粒技术的结合解析到 3.9 埃的近原子分辨率 ；应用相位板冷冻电镜单颗粒技术可以解析 60kDa 分子量的血红蛋白高分辨率结构 ；一种基于随机梯度下降算法的 cryoSPARC 程序已经可以在单机工作站上运行，初步测试结果表明效率比 Relion 高分辨率结构解析有数量级的提升，而且不需要初始模型 。在冷冻电镜单颗粒技术中，曾经是结构生物学主要限速步骤的晶体生长和筛选过程完全免除，因此大大提高了结构解析的效率。在比较快的例子里，从获得完全未知结构的蛋白分子到解析出结构只需要不到 1 个月的时间。以至于有人感慨：冷冻电镜使结构生物学越来越大众化了，从事冷冻电镜研究的人将很快失去工作，甚至结构生物学也将面临终结。这种论断却未免把冷冻电镜的潜力看得太浅了，也误解了结构生物学的真谛。 与 X 射线晶体学相比，电子显微镜作为结构生物学的手段至少晚诞生了 20 年，冷冻电镜作为较常规的高分辨率结构生物学的解析手段则晚了近 30 年。冷冻电镜今天的发展还只是刚刚开始，还有很多重要技术问题尚未解决。比如： 1 、在单颗粒分析技术中，如何将生物大分子机器的结构变化及不同构象的分布情况进行精确的描述？如何获得生化反应过程中所有步骤的生物大分子结构信息？这将会提供静态结构以外的重要信息，如分子机器的热力学或动力学的相关信息。 2 、如何进一步提高冷冻电镜结构解析的分辨率，达到 1 埃以上的超高分辨率？这将有利于对分子中的电势分布做更精细的解析，从而更好地理解生物大分子机器的化学本质乃至量子本质。 3 、如何获得更接近生理状态的生物大分子结构，如何在细胞乃至组织的原位获得高精度的结构信息？这将实现结构生物学与细胞生物学的融合，甚至可能发展出新的医学检测手段。 4 、如何将冷冻电镜技术与其它技术手段如质谱技术、测序技术、超高分辨率光学成像技术、单分子操控技术等整合起来，开拓新的方法学领域？在广义的生命科学研究中，未来的电子显微镜技术方法还可能用来分析生物样品，获得更多复杂的生物学信息，届时结构生物学家要面对的挑战是如何更有效地整合、挖掘、展示海量的结构信息，全方位地了解我们面对的研究对象。 未来几年里，冷冻电镜单颗粒技术的发展将日臻成熟，建立国家级的冷冻电镜中心，集中高效地提供高质量的冷冻电镜数据收集与分析的服务，将成为可能，也是必然的发展趋势。但以科研课题组为依托，开展新技术开发与应用的研究，将继续作为冷冻电镜领域的主流。新的硬件设备、软件算法会不断被开发出来，帮助生物学家看到更多以前无法想象的结构信息。这将始终是冷冻电镜领域的主旋律。随着技术的进步，结构生物学也将遵循半个多世纪以来的发展轨迹，在结构解析的质量与效率、在研究对象的复杂程度、在探讨生物学问题的深度和广度等方面，提出更高的要求。结构作为功能的基础和生命现象的载体，揭示生命体中原子、分子、细胞、组织、器官等各层级的空间组织方式、变化规律及其与功能的关系，这些始终是结构生物学所关注的根本问题。新的技术进步势必为我们解析多种层级的结构信息提供更为有效的工具，把我们从繁杂的技术细节中解放出来，从而深入地思考生命现象的本质。结构生物学家应该及时调整自己的心态、知识结构、问题导向、研究方法，来适应甚至引领新的变化，正如在过去 3 年里很多结构生物学大师所做的那样。 致谢：感谢程亦凡、范潇、刘文楠、颜宁、张佩君对本文撰写提供的建议与补充。 参考文献： 1 . De Rosier D J, Klug A. Reconstruction of threedimensional structures from electron micrographs. Nature, 1968, 217: 130-134. 2. Taylor K A, Glaeser R M. Electron diffraction of frozen, hydrated protein crystals.Science, 1974, 186: 1036–1037. 3. HendersonR, Unwin P N. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy. Nature, 1975, 257: 28-32. 4 . DubochetJ, Lepault J, Freeman R, et al. Electron microscopy of frozen water and aqueous solutions. Journal of Microscopy, 1982, 128(3): 219-237. 5 . Frank,J. Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. AcademicPress, San Diego, 1996. 6 . Zhang X, Settembre E, Xu C, et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105(6): 1867-1872. 7. YuX, Jin L, Zhou Z H. 3.88 structure of cytoplasmic polyhedrosis virus bycryo-electron microscopy. Nature, 2008, 453(7193): 415-419. 8 . LiaoM, Cao E, Julius D, et al. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature, 2013, 504(7478): 107-112. 9. CaoE, Liao M, Cheng Y, et al. TRPV1 structures in distinct conformations revealactivation mechanisms. Nature, 2013, 504(7478): 113-118. 10. Milazzo A C, Cheng A, Moeller A, et al. Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy. Journal of structural biology, 2011, 176(3): 404-408. 11. LiX, Mooney P, Zheng S, et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature methods, 2013, 10(6): 584-590. 12. Bai X, Fernandez I S, McMullan G, et al. Ribosome structures to near-atomicresolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife, 2013, 2: e00461. 13. ScheresS H W. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. Journal of molecular biology, 2012, 415(2): 406-418. 14. Scheres S H W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of structural biology, 2012, 180(3): 519-530. 15. Schur F K M, Obr M, Hagen W J H, et al. An atomic model of HIV-1 capsid-SP1 reveals structures regulating assembly and maturation. Science, 2016, 353(6298): 506-508. 16 . Khoshouei M, Radjainia M, Baumeister W, et al. Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 Adetermined with the Volta phase plate. bioRxiv, 2016: 087841. 17 . Punjani A, Rubinstein J L, Fleet D J, et al. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods, 2017. 其他相关阅读： 程亦凡专访 〡 记郭可信暑期学校暨国际研讨会 〡 2016年郭可信冷冻电镜三维分子成像国际研讨会 注: 原文发表于中 国生物物理学会微信公号 (ID: BPSC1979)
标签: 冷冻电镜
