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潘卓华：“被遗忘”的光遗传学先驱: 热度 17 dgjguoxue 2016-9-2 22:32; BioArt按： 9月1日，STAT新闻独家报道了一则关于“谁最先发明光遗传学”的新闻，由于故事主人翁是华人科学家潘卓华教授，所以引起了我们更多的关注。细读之下，发现有关“光遗传学”到底是谁最先发明的问题很有科学价值和意义，而且按照某些人的说法，该技术未来铁定获得诺贝尔奖。有鉴于此，BioArt根据这篇题为《 He may have invented one of neuroscience’s biggest advances. But you’ve never heard of him 》的文章做了一些编译奉献给读者朋友。疏漏讹误之出敬请读者朋友批评指正！以下是根据原文编译的文章：文 Anna Vlasts 编译 BioArt “光遗传学”技术给神经生物学或者更大范围来说是给医学领域带来了一场革命。简单地讲“光遗传学”（Optogenetics）是指利用遗传工程结合光来操控神经细胞活动的方法。这项技术是非侵入性，而且能够精确控制标靶，该技术还曾被《Nature methods》杂志评价为年度技术，也是近几十年来神经生物学领域最大的突破技术之一。这项技术在生物医学上有很大的应用前景，比如治疗失明、帕金森症和缓解慢性疼痛等。此外，该技术目前正广泛应用于世界上各大实验室，用于探究动物的大脑是如何工作的，这会让科学们更好的理解类似于睡眠、成瘾和知觉等行为方式。事实上并没有什么惊讶的，两位美国科学家Karl Deisseroth（斯坦福大学教授）和Edward Boyden（现在在MIT做Associate professor，2005年与 Karl Deisseroth合作在Nature neuroscience上发表了那篇划时代的文章， Edward Boyden是文章的第一作者，Karl Deisseroth是通讯作者，值得一提的是CRISPR男神张峰是文章第二作者，他当时还是一个化学专业的一年级研究生，参与一些重要工作。很有意思的是， Karl Deisseroth 和Edward Boyden都是斯坦福大学Richard Tsien（钱永佑，前不久刚去世的诺奖得主钱永健Roger Tsien 的亲哥哥）的博士。2005年初，Karl刚结束他的博后生涯留在斯坦福做了助理教授，这个时候Boyden在钱永佑实验室还是一名博士生，同年Boyden获得博士学位。事实上， Boyden和Karl算不上是博后和老板的关系，他们是最初一起有好的想法交流合作从而一步步完成这项工作的。注：有关光遗传学史，详见 Boyden写的《The Birth of Optogenetics》一文。）因“光遗传学”技术成为世界级的科学新星， Karl Deisseroth 还被誉为“光遗传学之父”。因为“光遗传学”技术的发明， Karl Deisseroth和Edward Boyden拿各种奖项和基金拿到手软，最著名的要数他俩获得有“ 豪华版诺贝尔奖 ”之称的2015“ 生命科学突破奖 ”（Breakthrough Prize）。他们的实验室目前拥有全世界最好的实验设备和最聪明的学生，也频频见光于世界上各大媒体。几乎圈内大多数人都会觉得他们将来一定能获得“诺贝尔奖”。然而，大家可能忽略故事中的的一个事实，因为潘卓华有可能才是“光遗传学”技术的第一发明人。（注：潘卓华，1977年从浙江金华一中毕业进入中科大近代物理系学习。1984年获得中国科学院生物物理所硕士；1990年获纽约州立大学布法罗分校博士学位。现为美国韦恩州立大学医学院解刨学和细胞生物学系和RetroSense Therapeutics教授。 2016年，就职于美国韦恩州立大学和RetroSense Therapeutics的中国科学家潘卓华教授，以及其研究团队终于将这一革命性的技术带到了临床。在RetroSense Therapeutics 潘卓华教授的主导下，2016年2月底，一名因视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）丧失视力的Texas女性，已经接受光遗传学治疗，成为光遗传学治疗的全球第一人。 ——引用自“中国科大新创校友基金会”微信公众号）也许即便是很多神经生物学家从来都没有听过潘卓华的名字。潘现年60岁，自上世纪80年代来到美国攻读博士学位后就再也没有离开过了，目前就职于美国韦恩州立大学。他宽阔的鼻梁上总是戴着一副金丝眼镜，脸颊上时常还露出一丝微笑。他的同事评价他是一位纯粹的科学家：谦和、专注、细心。潘做后来的这些工作是受到希望治愈失明患者这一想法的驱使。早在2000年后的那几年，他想象能有一个对光敏感的蛋白植入失明患者体内——通过使其它细胞对光敏感来弥补视杆细胞和视锥细胞的死亡从而让患者恢复光明。光遗传学的想法，即希望通过将外界光转化为神经元的电活动。这样，科学家就可以通过给予激光，远程刺激神经元，以便他们操控大脑环路。之前有人曾尝试使神经元感光，但是由于缺乏正确的感光蛋白。随着ChR2蛋白在2003年被发现，这一切都改变了。Channelrhodopsin，这个绿藻中发现的蛋白质，可以对光有反应，并且使离子进入细胞，这有助于藻类寻找阳光。 “ 这是我生命中最激动人心的事情之一，”潘说。“我想，哇！这是我们正在寻找的分子。这是我们要找的光传感器。” 2004年2月，他试图将Channelrhodopsin表达在培养皿中的视网膜的神经节细胞内，成功使得使它们对光有了电活动反应。潘非常激动，向美国国立卫生研究院的资助申请了一个资助。美国国立卫生研究院授予他30万美元，并评论说他的研究是“ 相当超前和高度创新的，探索近乎未知 ”。但是，潘不知道当时他是争分夺秒地在与美国和世界各地的研究小组竞争，也是将Channelrhodopsin导入到神经元内。当时的Deisseroth和Boyden在斯坦福大学工作， Deisseroth刚完成博士后，和当时正在读研的Boyden共同完成。除此之外，其他研究小组还包括凯斯西储大学的Stefan Herlitze和Lynn Landmesser、日本东北大学的Hiromu Yawo组。当然，他们并不是唯一的科学家尝试用光来控制神经元的方法。2004，Gero Miesenbock和Richard Kramer已经发表的文章，用其他更复杂的分子来达到目的。但是Channelrhodopsin是工具，要彻底颠覆整个领域。斯坦福的研究小组有用光操控神经元的想法到实施有相当长的一段时间。他们也注意到关于2003年PNAS上Channelrhodopsin2的文章发表。Deisseroth跟本文的作者，Georg Nagel进行邮件通讯，询问是否可以合作，共享Channelrhodopsin DNA，因此Boyden可以在神经元进行试验。2004年八月，Boyden在培养皿的神经元给予了一束激光，令人高兴的是，在神经元上记录到了光照诱发的电反应活动。潘已经在六个月前在视网膜神经元中做了同样的事情，后来他说： “我们感觉不太幸运”。 Boyden ，现在是MIT的教授，被STAT告知潘当时在他们之前完成了这项实验， Boyden 感到非常惊讶。“哇！有意思，我以前并不知道，”博伊登说道。 “思考新事物或者新发现被证明时，关于科学的问题是一件很有意思的事情，”他补充说，并指出科学是建立在科学家们彼此工作的基础之上的，他们有时一起合作，而其他时候可能同时在各自开展研究工作，工作中难免发生争抢的情况。“当然，其中也有有意和无意的团队合作，”他说道。斯坦福新闻办公室称Deisseroth无法提供回答。针对STAT提供的问题，发言人Bruce Goldman答复说，“潘的工作离光遗传学相去甚远…而 Deisseroth他们的工作为精细神经科学开辟了一个新天地。正是 Deisseroth博士发表于2005，目前被广泛引用的那篇文章才揭示了这种潜力。” 潘说他可能在几年前向Boyden提到过他的实验，但是，潘说，“我不想花太多的时间来谈这个是因为人们会感觉到不适。” 似乎这种态度与潘的个性相符合——勤奋、内敛、保持在聚光灯以外。韦恩州立大学是一所不以科学研究而出名的小型大学。潘是去了一所州立学校攻读博士学位，然后低调的做了几十年的研究。这些情况可能有助于解释接下去发生的事情，当他试图把他的发明展示给世界的时候：它并没有被看作是大的进步。 2004年的夏天，潘一直在寻找将Channelrhodopsin蛋白表达在活体眼球的方法，最后他决定采用病毒感染的方法将Channelrhodopsin的 DNA导入眼球的细胞内。他的另外一个同事，Salus University的Alexander Dizhoor 教授帮助他改造了Channelrhodopsin的 DNA，通过偶联一个绿色荧光蛋白基因的方式，能够方便地跟踪channelrhodopsin 的表达。 2004年七月，潘给第一只大鼠的视网膜注射了光敏感通道病毒。大约五个星期后，他观察到一大片的神经节细胞的细胞膜上表达了绿色荧光蛋白偶联 Channelrhodopsin的蛋白。当他打开灯照射时，他成功的用电极在细胞里记录到了一连串的电活动。这说明Channelrhodopsin工作了。虽然这只是第一步，但却是革命性的一步——这表明，潘的方法可能能够恢复盲人的视力。 “一切都很漂亮”，潘说道。于是潘和Dizhoor在2004年11月25日，将他们的工作提交给《Nature》杂志社，对方回信建议潘，将工作投给更专业的期刊《Nature Neuroscience》，但是《Nature Neuroscience》拒绝发表。第二年年初，潘把论文投给《Journal of Neuroscience》杂志上，在那里进行了同行评阅，但随后还是又被拒绝了。心灰意冷，潘着手修改自己的论文，并在2005五月前往罗德岱尔堡参加视觉会议，在那里他讲述他的工作——在神经元中使用Channelrhodopsin，来激活视网膜细胞。这一个简单的演讲，持续了短短的15分钟，或许将成为他在发明的时间表上最清晰的赌注。几个月后，《Nature Neuroscience》上发表了一篇关于使用Channelrhodopsin使神经元对光敏感的论文，本文的作者是斯坦福 Edward Boyden和Karl Deisseroth。潘听到消息从同事发电子邮件给他了。“我感觉很糟糕。我感觉糟透了，”潘说， “我们感觉不太幸运。” Met with a shrug Deisseroth和Boyden的论文与潘的文章有些不同。他们简要的描述了在培养皿中能用 Channelrhodopsin作为控制神经元的工具。而潘要等到这个工具在活体动物中有效果再去发表。而且， Deisseroth和Boyden向同行们展示了不可思议的精准时间控制，这个过程只需要1个毫秒。然而他们技术创举是一样的：他们都成功的使用 Channelrhodopsin使得神经元在培养皿里对光有反应。斯坦福的论文一出来就已经起飞了，这使得 Deisseroth和Boyden的科研生涯中获得快速的崛起，随之而来的就是大把的经费和最聪明的学生们的加入。2007年，《纽约时报》开始关注Deisseroth的在光遗传学上的突破，随之他们的论文的引用次数也在迅速膨胀中。 2006年4月，潘的论文最终发表在《Neuron》上。加州大学伯克利分校研究视觉的专家Richard Kramer评论道， “这看上去并没有什么创新性，似乎就是说，看吧，既然能把 Channelrhodopsin用于大脑神经元，那么当然也能用到视网膜上。这引人注目吗？答案当时是，no ”。短短数月，事情已经发生了翻天覆地的变化。 Deisseroth和Boyden的论文内容相对比较简单。他们只是证明了他们可以使用Channelrhodopsin在体外控制神经元活性；潘的工作则是在活体的情况下验证。在论文里，Deisseroth和Boyden表现出令人难以置信的精确时间控制。但是他们的技术和潘在本质上是一样的：潘也曾在一盘感染Channelrhodopsin的神经元中，用光成功进行激活。为什么潘的论文没能最先发表？他可能永远也不会知道答案。在Boyden的文章出来后，潘给《 Nature Neuroscience 》杂志的编辑写信质问为什么他们的文章被拒绝发表，但是却发表了Boyden他们的文章。杂志编辑回复说，这两篇论文有相似之处，Boyden他们文章呈现出的是一项新的技术而不是科学发现，而潘的文章看上去太狭隘，仅仅关注在使用 Channelrhodopsin蛋白修复视觉上，另外Boyden的文章提出了一个很好地观点，就是将 Channelrhodopsin改造成一个广泛运用于神经科学领域的工具。当其他研究者向《 Journal of Neuroscience 》投稿过程中，关于人们如何看待潘的论文过程中出现了一些端倪。其中一个评审喜欢潘的这篇文章，只有一个小小的修改建议。其他评审则认为，“野心太大”、“非常初级”并认为“不太会吸引更多的神经生物学家”。事后，潘论文的共同作者Dizhoor读到此处的时候不禁失笑。文章2006年小修之后在Cell子刊《Neuron》正式发表。但是这并没有使得潘晋升于“光遗传学”名流之列。从论文发表的角度讲，他晚了一大步，因为在他之前有三个不同的课题组（ BioArt注：斯坦福大学Karl Deisseroth实验室、凯西西储大学Lynn T. Landmesser 和 Stefan Herlitze实验室、日本的Hiromu Yawo实验室，详见下图）发表了关于 Channelrhodopsin的文章。他也并没有分享到 Deisseroth与Boyden在2013年拿到的神经科学领域最高奖“The Brain Prize”（6位光遗传学的发明人分享了100万欧元）和2015年的生命科学突破奖（每人300万美金奖励）。从2005年开始，Deisseroth已经从NIH拿到了超过1800万美金的资助，Boyden也拿到了超过1000万美金的资助，他们二人每年还能从其它渠道拿到一些资助。Boyden是一位高产的讲演者，TED上就有他的很多演讲。而 Deisseroth则是2015年《纽约客》杂志上深入剖析专访的当事人。而在过去十年中，潘仅仅只拿到大约300万美金的NIH基金资助，这也算是一个研究人员能承受的最低限度资助了。对于这样研究来讲，很多奖励都只是来自他所在的学校——韦恩州立大学。根据他个人的网页来看，他被邀请做了一些报告，但是大多数是出现在俄罗斯的一些技术show上。发明游戏的规则这整个故事引出了一个问题，那就是对于科学中的发明意味着什么。这也是近年来困扰一些科学家的问题，包括最著名的CRISPR专利案。对于这个问题，显然还得根据具体背景来解答。学术界往往更多考虑到第一个发表学术论文的科学家。但是这个标准也存在问题，潘的遭遇就是一个例子。在近一期eLife杂志上一篇短文中，两名生物学家Ronald Vale和 Anthony Hyman摆出了这个问题。他们指出，“从一篇论文提交到发表过程中持续的时间可以是几周到超过两年，在知识是如何从科学家手中传递到世界范围的过程中，这种延迟创造了很多不公平 ”。论文评审人员在一些熟悉的人名或者知名研究机构面前是有一定倾向性的。而盲审——论文作者姓名隐去，被认为能最大限度的降低这种倾向性，但是许多科学家对这种做法表示疑虑，因为研究经常是会提前在一些会议上进行讨论。但是，是否意味着他将会出现在未来诺贝尔奖的名单上，这点并不清楚。Karmer认为，即使潘把论文提前放到预印本网站bioRxiv上，这也可能不会得到认可，因为论文没有得到同行评阅。也是他未来能够借“光遗传学”获得诺贝尔奖的关键所在。然而，在法律体系里却并不会理会上述学术规则。根据美国律师协会代表的专利法，为了证明一项专利的优先权，大多数时间里你需要显示“什么时候某人实际上已经构思了这项发明，什么时候这项发现正在实现——意味着你的想法得到了证实”。基于这样的判定标准，一项新发现被世人认可的时间应该是其在实验室得以确认的时间，甚至是早于这一发现在互联网上传播之前。但是随之而来的是来自大众的评判。科学家们同时也是公众人物，他们也玩Twitter，出现在各种各样的夜间脱口秀的节目上。来自哈佛医学院的名誉教授Richard Masland拥有多项运用基因治疗技术治疗失明的专利，他认为, 与之前相比，进入大众视野的关于科研质量的评判越来越受到非科学因素的影响。由于在韦恩州立大学，潘并没有很好地资源使得他的论文在高水平期刊上发表。这就是高水平研究所需要的代价，此外，顶级大学里面通常是资深研究员带领着一些资历较浅的研究人员，阅读评审他们的工作并帮助这些年轻人提升水平。潘承认的这个事实可能使他在和极富名望的斯坦福和MIT科学家的比较中处于不利的境地。“当然，我并没有证据证明”，潘说道。潘的谦和内敛和非母语语言能力可能使得他和 Deisseroth与Boyden的差距变得更大。加州大学伯克利分校的Kramer教授说道，“ 潘并不像其他人那样在很多公开场合演讲，而这个游戏中一个重要的组成部分就是要多出去走动，宣传自己 ”。这种宣传可以强化自我，“我认为有一种趋势就是谁先发现谁拥有更大的知名度”，凯西西储大学教授Landmesser说道。一个大学的公开视频也能产生全国性的新闻，这会使得有人在考虑提名某项奖的时候想到你的名字，这也会导致一些电视的出镜。最终，潘和 Deisseroth与Boyden团队都赢得了基于各自发现的专利。潘于2005年5月份的讲座事实上威胁到了 Deisseroth与Boyden的专利，由于潘的摘要出版比他们早了一年多，所以 Deisseroth与Boyden的几次申请都被美国专利局拒绝。最终， Deisseroth与Boyden签署了一份文件，声称他们在潘的会议摘要出版之前已经用 Channelrhodopsin正在发明他们现在的方法。最终，2016年3月份，相关专利才被授权下来，此时离他们发表文章已经过去十年。如今，Deisseroth是Circuit Therapeutics公司的联合创始人和科学顾问，这家公司基于“光遗传学”开发了很多治疗手段。（ Circuit Therapeutics拒绝评论有关知识产权的问题。）潘拿到了一项运用光敏感通道蛋白恢复视力的专利。这项专利获得了RetroSense的许可，2015年还获得过美国天使资本协会（Angel Capital Association）的一个奖项。 RetroSense在今年已经开始了一些列关于基因治疗失明患者的临床试验，他们的 CEO还顺便告诉STAT有关潘在“光遗传学”发明过程中所扮演的角色。这是第一次将一个非人员的蛋白通过“光遗传学”手段应用于人类基因治疗。现在，走在德克萨斯州的盲人们满眼都是这种藻类的DNA。潘说道，“一件我仍然十分高兴的事情就是，即便是现在，我们的临床试验还是走在别人的前头”。由于目前在美国，还没有基因治疗被批准在临床上使用，所以“光遗传学”技术在人身上的应用还有很长一段路要走。丹阳，加州大学伯克利分校的一名神经生物学教授正在运用“光遗传学”研究睡眠，她表示“光遗传学”短时间内应用于治疗不现实，未来需要很长很长的时间去保证这项技术的安全性。因为对于发明本身，一些科学家认为潘可能并不具备Deisseroth和Boyden获得大奖的条件。Stefan Herlitze，一位曾经一篇关于光敏感通道蛋白文章被抢先发表的科学家说道，“当然，我不得不说， Deisseroth和Boyden确实发展并推动了这个领域 ”。 Boyden也赞同这一说法。Boyden说道，“ Karl 和我都非常着迷于这个general的问题——如何在大脑里控制细胞，并且我们一道努力突破这些分子逻辑的极限（ push these molecules to their logical limits ） ”。也许谁最先发明“光遗传学”技术并不重要，更重要的是谁把科学推向最远最宽广的地方。在被问到他的工作是否被Boyden和Deisseroth所承认和认可的时候，潘没有回答这个问题。随后，潘告诉STAT称Deisseroth毫无疑问做了非常漂亮的工作，也很幸运，因为如果潘的文章提前发表出来，或许就不是现在的结局了，故事就要被改写了，并且潘他们会得到更多的Credit。这是一个更多的用潘愿意讲述的方式的故事，如今潘仍然在底特律生活。接下来，他实验室正在运用一种新的光敏感通道蛋白来治疗失明，他也说道他的实验室非常小，主要的研究兴趣还是在修复失明上做一些努力。说明：中文翻译有些地方可能说的不太清楚，建议读者们有时间阅读英文版原文，详细请点击https://www.statnews.com/2016/09/01/optogenetics/。全文顺利的编译得到了很多朋友的的支持，特别值得一提的是浙江大学博士生沈晨杰同学提供了部分翻译，澳大利亚昆士兰大学博士生夏迪同学提供了很好的建议和修改，瑞典Karolinska学院刘老师也参与部分翻译工作，还有几位好朋友也在百忙之中参与文章标题的改定和文字修订，一并致谢！备注：原文最先发布于微信公众号BioArt（微信号：biogossip），扫下方二维码可以关注。; 18709 次阅读|24 个评论

光遗传学: 热度 21 小水獭 2016-5-7 10:25; 人们常把人脑与电脑相比，两者都是由大量相似的基本元件构成：计算机里面有数亿个晶体管，大脑里有数百亿个神经细胞（图 1 ）。在计算机和大脑中，基本元件之间都互相连线构成巨大的网络，在网络中利用电信号快速传递着海量信息。神经科学家怎样通过测量大脑中的信息流来了解大脑的功能呢？传统的方法是用用电极测量神经细胞上的电信号，像电话窃听器一样来了解他们是怎样工作的。这个办法也叫“电生理”，虽然已经在历史上延用百年，但缺点是很明显的：在一个含有数亿个神经细胞互动的过程中只测量其中几个神经细胞活动，就好像试图通过电视屏幕上几个像素的闪烁来猜测一个电视剧的内容。早在 1960 年代，耶鲁大学年轻的科恩教授（ Lawrence B. Cohen) 就开始想办法引进一个光的元素，把神经电信号变成光，让神经科学家看到大脑活动的“电视剧”。他的想法是利用一种化学染料把神经细胞染色。染料的分子并不进入神经细胞，而只附着在细胞膜上。这样当神经细胞产生电信号时，染料的分子结构受到电场影响而改变颜色。这样就可以通过测量染料的荧光来对神经组织进行成像。这种“电压敏感染料成像”方法转眼做得风声水起，在顶级杂志上文章一篇接一篇；他的学生找工作时只要放一小段震撼人心的“脑电影”就能轻易俘获满堂听众的芳心，顺利地得到工作。但是这种方法也有个明显的缺点，就是对神经细胞没有选择性，不同神经细胞对光信号贡献没法分开。我们知道大脑中有兴奋和抑制两种神经细胞，就像汽车的油门和刹车，兴奋的负责“嗨”，抑制的负责瞌睡。如果有一种方法能分清楚这两种不同细胞的信号，那研究工作就更上了一层楼。可是化学染料对神经细胞的选择性是很差的，远远做不到分辨不同来自细胞的信号。这个问题整整为难了一代神经科学家。科恩小组的工作主要是利用大学长长的暑假，把实验室搬到在麻省海边，位于鳕鱼角的伍滋霍尔海洋生物站（ WoodsHole Marine biological station) 。那几十年是美国科研的黄金时代，在伍滋霍尔聚集了一大批心怀各种梦想的神经科学家。他们白天躲在各自的实验室里工作，晚上则聚在海滩或镇上的小酒吧里高谈阔论。谁有个新发现身边马上聚满粉丝，新闻转瞬传遍世界，根本等不到文章发表。科恩的学生乘着电压敏感染料的东风发明了另一种染料，它可以进入细胞并随着细胞内钙离子浓度的变化发光。钙离子在一切细胞中都有非常重要的作用，能做“钙成像”的消息一下引爆伍滋霍尔，他火得连在上厕所的时候，站在旁边尿尿的人都会突然提个问题。在这群伍滋霍尔科学家中有个谦和的日本科学家 OsamuShimomura （下村修），成天拿着捞网在海边收集水母。伍滋霍尔海水温暖，夏天傍晚阵阵清风掀起涟绮，海面成千上万的水母会竞相发出绿色荧光，美如梦幻。下村多年来一直着迷于这种发光的现象，并于 1960 年代在普林斯顿大学纯化了这种的绿色荧光蛋白。年复一年，伍滋霍尔夏末的学术讨论会上，他在做报告时让把灯全关掉，在黑暗中他从口袋里拿出两只试管，当溶液混合时会产生幽幽的鬼火似的蓝光。报告厅里科恩照例坐在角落里，瞪着一双牛眼不知道在想什么。下村的荧光蛋白与科恩的光学成像多次在报告厅里相遇，但从来没擦出火花。因为分子遗传学的大潮还没有涌现，光学遗传学的弄潮儿还站在海滩上呢。 1990 年代，下村的水母荧光蛋白迅速成为光学遗传学领域中的第一个明星。首先，它的基因被克隆，并可以在其他物种中表达。由此只要把它的基因转移到某些细胞中，这些细胞就可以在组织中发亮，给科学家指引目标。 1995 年，加州大学圣地亚哥分校的钱永健发现改变蛋白分子上一个氨基酸可以时其发光大大加强而且更稳定。那几年有个“荧光蛋白热”，几个小组使用各种方法改变绿色荧光蛋白，不但使其更亮更稳定，而且也产生出红，蓝，黄，青等不同颜色的蛋白。这项工作终于在 2008 年与下村修和 Martin Chalfie 一起获得了诺贝尔化学奖。如果用转基因的方法让脑细胞随机地表达几种不同颜色的荧光蛋白，在紫外光下每个脑细胞就会出五彩斑斓的荧光，把每个细胞看得清清楚楚（图一）。这项技术也叫“脑彩虹”（ Brainbow ）。图 1.Brainbow（脑彩虹）项目获得的荧光标记海马皮层细胞图和荧光标记视网膜方向选择性神经元图。左图展示的是使用脑彩虹技术将不同的海马皮层细胞用不同颜色区分开来。图中彩色大斑块就是细胞胞体，纤细的须状物就是神经树突。左图作者：Tamily Weissman, Harvard University右图是视网膜中参与方向信息识别的神经节细胞。树丛一样的是神经节细胞的树突，一根根长长的线是轴突，轴突都汇集到眼球的视盘（右图下部）然后到达大脑的视觉中枢。右图作者：JoshR. Sanes, Harvard University。图片来源：http://www.cell.com/pictureshow/brainbow 有了可以通过遗传学手段标记细胞的荧光蛋白，光学遗传学下一步的目标就是怎样利用荧光蛋白显示神经细胞的活动，以及怎样利用光来指挥和控制神经细胞的活动。光学遗传学方法测量神经细胞的电活动一个神经细胞的活动有两个重要的指标：第一个是细胞膜电位的变化，第二个是细胞内钙离子浓度变化。下面分别描述测量这两个指标的方法。神经细胞的膜电位变化是神经细胞的活动最基本的信号，当膜电位变化时，细胞膜上镶嵌的许多蛋白质分子都会改变形状，因此，改变膜电位是一个细胞指挥自己身上亿万个蛋白分子统一行动的信号。这类随膜电位改变形状的蛋白分子也叫电压敏感蛋白。如果用基因工程的办法，把电压敏感蛋白和荧光蛋白连接起来，当膜电位改变时，电压敏感蛋白的改变就会影响荧光蛋白的结构，从而改变了后者的发光特性。这样就可以利用荧光来看神经细胞膜的膜电位变化了。图 2. 膜电位变化指示蛋白（a）ASAP1 的设计基于环段置换绿色荧光蛋白（circularly permutedgreen fluorescent protein，cpGFP）。当膜内电位由负变正去极化，插入膜中的结构域被推斥向膜外，cpGFP结构变化，被蓝光激发的绿色荧光量下降。（b）一部分神经元表达电位指示蛋白，当细胞兴奋时，荧光强度下降。（c）小鼠大脑皮层示意图（d）暴露的大脑表面照片（e）电位变化成像图，在刺激后每隔20毫秒拍一张荧光图片。（c, d, e图来源于Akemann W 的综述）图 2a 举例说明这种思路。图 2a 左面的绿色桶形是绿色荧光蛋白分子，灰色的长方块是电压敏感蛋白，它的分子在细胞膜（黄色）的内外穿插四次。当神经细胞不活动时细胞膜处于内负外正的状态，这时电压敏感蛋白整齐排列，当荧光蛋白分子受到蓝光（蓝箭头）的照射时会发出绿色的荧光（绿箭头）。当神经细胞兴奋时膜电位会改变，成为内正外负（图 2a 右）这时电压敏感蛋白分子形状发生改变，牵扯到荧光蛋白也改变形状，造成绿色荧光大大下降。如图 2b 所示，当用转基因的办法让神经细胞携带这种荧光蛋白－电压敏感蛋白复合体时，在大脑皮层不活动时可以看到较强的荧光（图 2b, 左）而当大脑皮层活动时荧光就会减弱（图 2b 右）。图 2c-e 显示这种光遗传学方法测量神经电活动的一个应用实例。小鼠的胡须是其非常重要的感受器，当一根胡须被拨动时大脑皮层感觉区（ S1) 会有很强烈的神经活动。为了显示这种当对小鼠的大脑皮层进行荧光成像时（图 2c 中的蓝方框，放大到图 2d 中），当一根胡须受到拨动时就会看到皮层不同的区域荧光顺序地减弱，表示神经活动在皮层上扩布（图 2e ）。光学遗传方法测量细胞内钙离子钙离子参与了细胞内很多生理过程，如细胞内信息传递，基因表达，神经递质释放等等。细胞内的钙离子浓度是非常低的，胞外钙浓度是胞内的十万倍以上。虽然有这个巨大的浓度梯度，但是钙离子不能透过细胞膜，必须通过特殊的钙离子通道 ( 图 3a 中绿色的蛋白分子 ) 才能进入细胞。神经细胞在静息的时候钙离子通道都是关闭的。而当膜电位变化的时候对电压敏感的钙离子通道会大批开放，让胞外的钙离子就会迅速涌进胞内，造成一个突然的钙高峰。那么如何来观察这个细胞内钙浓度的突然增加呢？生物基因工程学家的思路与设计前述的电压敏感荧光蛋白类似，将能与钙离子结合的蛋白组合 CaM （钙调蛋白）和它的亚基 M13 分别连在绿色荧光蛋白的两个位置上。当这个融合蛋白不结合钙离子的时候，绿色荧光蛋白不会发出荧光。而当 CaM 和 M13 结合了钙离子，这两个蛋白就会更加紧密的靠在一起，绿色荧光蛋白的结构完整的合起来，就发出了明亮的荧光 ( 图 3b) 。基因工程重组钙敏感荧光蛋白就是通过这个方法来构建的。图 3c-d 显示这种光遗传学方法测量神经细胞内钙浓度变化的一个应用实例。表达有钙敏感荧光蛋白的神经细胞在不兴奋的时候有比较弱的荧光，而当该神经细胞兴奋时，细胞外的钙离子进入细胞内，细胞内的钙敏感荧光蛋白结合了流入的钙离子之后，荧光强度变亮，细胞发光，观察者就知道这个细胞参与了此时此刻的神经信息处理过程。图 3. 钙浓度变化指示蛋白示意图（ a）钙离子参与细胞活动的方方面面.钙离子是细胞信号传导中的重要信使，因为一旦它们进入细胞质，钙离子会结合并激活很多酶和蛋白质。由下图所示的细胞为例，钙离子通过AMPA受体，NMDA受体等离子通道进入细胞，可引发一系列突触后膜的活动，可能引发突触结构性的变化，比如更多的AMPA受体插入膜上。在细胞胞体内流的钙离子，或者细胞内钙库释放的钙离子结合钙调蛋白，可影响基因表达。在神经细胞轴突末梢流入的钙离子，是神经递质释放的前提条件。（b）基因工程重组钙敏感荧光蛋白（genetically encoded calcium indicator由Ro bert E. Campbel设计。(c)细胞兴奋前后荧光量的变化（d）荧光强度随着细胞内钙的浓度变化而波动用光控制神经细胞的活动在经典的神经生物学实验中，激活一个神经细胞大致有两种方法，物理的和化学的。物理的方法就是电刺激，例如将金属电极放在神经细胞旁边，改变细胞外电场，从而激活细胞。化学的方法，就是施加神经递质类的小分子，或者作用于细胞受体的药物。而光遗传学提供了一个全新的方法，就是直接用光来准时刻准位点的刺激细胞。光遗传学是怎么做到的呢？大家知道人类的眼睛就是一个光信号 - 生物电的光电转换系统，那么是否可以用眼睛的方法来进行光电转换呢？让我们首先用一张图来大致了解人类眼睛的光信号转换为细胞电信号的过程。感兴趣的朋友可以仔细阅读图 4 的图解，但是我们其实只需要瞄一下这张图有个直观感受，在感光细胞中，要将光信号转换为使细胞电生理兴奋状态的改变，需要十几个蛋白协同工作；但是光遗传学中，只需要一个光敏蛋白（例如光敏通道 channelrhodopsin ， ChR2 ），就可以使细胞兴奋。这在科研应用中非常重要，因为在一个细胞中多表达几个蛋白，比只表达一个蛋白的难度系数可是成几何级数增长的。而细胞本身也无法承载那么多外源蛋白的额外负担，而且这么多外源蛋白的表达程度还必须保持相互平衡状态，这简直是不可能的任务。甚至可以说，光敏通道这一种蛋白，就几乎可以代替整个感光细胞这一精密复杂的光电转换生物系统，作为感光受体（ photoreceptor ）。图 4. 感光细胞光电信号转换过程简化说明以及光敏通道示意图：（a）光强不变的时候，感光细胞中的有高浓度的cGMP，cGMP门控阳离子通道（cGMP-gated channel）开放，细胞一直处于去极化，释放递质谷氨酸（glutamate，Glu）的状态。在光强增加的时候，光子被视紫红质（rhodopsin，Rh）吸收。视紫红质由吸收光子的小分子视黄醛（11-cis-retinal）和视蛋白（opsin）组成。视紫红质其实是一个G蛋白偶联受体，它激活了G蛋白（transducin）。transducin释放GDP，结合GTP。Transducin的 α亚基与βγ二聚体分离，α亚基结合并激活磷酸二酯酶（ phosphodiesterase，PDE ）， PDE水解cGMP成GMP，cGMP浓度下降， cGMP门控阳离子通道关闭，细胞膜电位下降超极化，电压门控钙通道关闭，递质Glu释放减少。值得一提的是，感光细胞内还有很多精细调控和反馈机制，还有很多蛋白并未在图中提到。而没有这一大群蛋白，感光细胞的功能是无法正常发挥的。（b）以光敏通道ChR2为例，光敏通道只需要一种蛋白即可，当与ChR2共价结合的all-trans-retinal吸收了光子，促使ChR2分子构象发生变化，蛋白中间出现阳离子通道，Na离子和Ca离子的内流就可使细胞内电位上升，细胞去极化兴奋，如果表达ChR2的是神经细胞，膜电位去极化可激活在轴突末端的电压门控钙通道，轴突末端的钙内流可促使神经细胞释放神经递质囊泡。 2002 年 Gero Miesenböck 实验室首先尝试了这一个大胆的设计，他把视紫红质表达在肌肉细胞上，再把果蝇砍去头，这样果蝇的扇翅膀的运动就不能被自身的运动神经所控制。然后，再把光打在果蝇身体上，没头的果蝇竟然拍翅膀了！这是实现光控细胞活动最早的一个成功的实验。因此当 2003 年左右当 PeterHegemann 实验室连续发变了两篇微生物中的单个光敏离子通道（ channelrhodopsin ） ChR1 和 ChR2 时，许多神经生物学家精神为之一振，世界各地同时有四个实验室尝试表达于哺乳动物细胞，可谓英雄所见略同。他们有美国斯坦福大学的 KarlDeisseroth 实验室，美国 Case Western Reserve University 的 Lynn T. Landmesser 和 Stefan Herlitze 实验室，日本的 Hiromu Yawo 实验室，以及美国 Wayne state University 的潘卓华实验室。 Karl Deisseroth 实验室的文章是最先发表于 2005 年 8 月 Nature Neuroscience ，但是只做了体外培养的细胞表达，值得一提的是发展了 CRSIPR/cas9 工具的张峰也参与了这篇工作，他是二作。仅仅迟了两个月的 Lynn T. Landmesser 和 Stefan Herlitze 实验室就做得全面很多，有体外培养海马皮层神经元表达，以及在体脊髓神经元表达。日本的 HiromuYawo 实验室比 Deisseroth 迟了 3 个月，但是也做了体外培养细胞系 PC12 的表达和改变细胞兴奋性的实验。但是最晚于 2006 年 4 月发表的潘卓华老师实验室的工作做的最全面，从体外细胞表达到小鼠在体神经细胞表达和电生理记录一应俱全。实际上据潘卓华老师介绍，在 2004 年底他的在小鼠视网膜体内表达的实验就已经完成，而且依次投递了 Nature 和 Science ，但是都未被接受，甚为遗憾。这部分历史在 Peter Hegemann 的综述中有客观叙述。图 5 光敏蛋白工具箱（ a）光敏阳离子通道（b）光敏阴离子通道（c）光敏氯离子泵（d）光敏氢离子泵（e）光敏代谢型受体（f）光敏腺苷酸环化酶 2006 年后，光遗传学的时代来临了，光遗传学给物理光学，光化学和生物学提供了新的结合点。结合了基因工程技术和最前沿的光学技术。这个方法有很多优点，例如在体表达的实际操作性高，准确时效性，减少创伤，无异物侵入组织等等。可以用定位的光纤来局部刺激细胞，也可以设计弥散光来大范围的刺激脑区。许多实验室开始广泛参与光遗传学的研究工作，有些实验室使用光敏通道来代替经典电极刺激，有些实验室寻找更多的光敏蛋白来丰富这一工具箱，有些实验室希望利用光敏蛋白来提供临床治疗应用。经典的基因工程研究思路中，曾经是把来源于不同物种的蛋白在动物模型上表达，或者将原始蛋白和荧光蛋白形成融合蛋白等等。但是光敏通道的发现似乎一下子开拓了科研人员的想象。从光敏蛋白 ChR2 的结构来看，完全不像是个经典的通道结构，而像一个代谢型 G 蛋白偶联受体， ChR2 是一个 7 次 alpha 螺旋跨膜结构，但是竟然在 7 个螺旋中有离子的通道。因此研究者脑洞大开，认为理论上可以通过基因工程的改造，有可能将所有原本不受光子激活的蛋白都改造为对光敏感。就像在 2002 年发现的如图 5f 的光敏腺苷酸环化酶（ Adenyl cyclases ）一样。使用这个思路， 2006 年 Ehud Y Isacoff 和 Dirk Trauner 实验室合作，成功构建了光敏谷氨酸离子通道（ LiGluR ）。 Chandra L Tucker 实验室和 Wendell A. Lim 实验室在 2009 年左右分别独立的设计了光控制的蛋白相互作用和光控制基因转录方法。在图 5 中举了几个光敏蛋白的例子。如果想要使用光来兴奋细胞，可以使用图 5a 的光敏阳离子通道，施加蓝光可以使阳离子通过该通道进入细胞，使细胞内膜电位成为内正外负，细胞就可以兴奋。如果想要使用光来抑制细胞活动，可以使用图 5b 的光敏阳离子通道、图 5c 的光敏氯离子泵和图 5d 的光敏氢离子泵。图 5b 中施加蓝光可以使阴离子通过该通道进入细胞，使细胞内膜电位成为内负外正，细胞就可以被抑制。图 5c 和 5d 中施加黄光可以使阴离子通过该离子泵进入细胞或者阳离子离开细胞，使细胞内膜电位成为内负外正，细胞就可以被抑制。图 5e 的光敏代谢型受体，不是通过直接的把阴阳离子跨膜运动来改变细胞的活动，而是较为间接的通过光控制细胞内的化学作用来达到影响细胞的目的。在特定细胞环路上表达光敏通道，再使用可拍摄深层组织的双光子显微镜系统，使在体观察动物神经系统活动成为可能。这也是最近十来年最大的突破。神经科学家对神经系统的认知早已从递质、激素和受体决定一切，转变为认为大脑是一个高效细胞环路。生物工程最前沿的目标应当是结合光遗传学、光学成像和组织细胞工程来人工构建细胞环路。临床医疗研究者也在近十年尝试利用非侵入性的光遗传学手段来治疗各种疾病，例如嗜睡症，抑郁症，恐惧，焦虑，疼痛，帕金森综合征和失明。这些尝试给 “ 光疗法 ” 赋予了全新的意义。但是将感光蛋白引入人体还是需要非常谨慎的，毕竟我们对人体还不能说是完全的了解和掌握。特别是很多精神疾病涉及的脑区很广泛，使用光遗传学治疗很难刺激如此大的范围。因此，只有帕金森症以及失明的治疗在现阶段看来比较可行，因为所涉及的组织区域已明确而且是一个限定的区域。美国药监局 FDA2015 年已经批准了光遗传学治疗失明的临床试验。光遗传学的开拓的全新领域也激发了科学家更多的想法：比如为什么光控受体一定要是蛋白质呢？是否可以有 DNA 、 RNA 的光感受器来加入光遗传学的工具箱？例如 Richard H. Kramer 实验室设计了 AAQ 和 DENAQ 感光小分子并用于尝试治疗失明。比如声遗传学，就是利用声波或者超声波来影响细胞；比如磁遗传学，就是利用外加磁场来无创控制细胞。未来是不是还有机械遗传学，用纳米颗粒甚至智能小机器人来提供局部提供机械刺激给细胞呢？在这个时代， anythingis possible 。参考文献： Livet J, Weissman TA, Kang H, et al.Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins inthe nervous system. Nature, 2007, 450(7166): 56-62 St-Pierre F,Marshall JD, Yang Y, et al. High-fidelity optical reporting of neuronalelectrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci,2014, 17(6): 884-9 Akemann W, Song C,Mutoh H, et al. Route to genetically targeted optical electrophysiology:development and applications of voltage-sensitive fluorescent proteins.Neurophotonics, 2015, 2(2): Berlin S, CarrollEC, Newman ZL, et al. Photoactivatable genetically encoded calcium indicatorsfor targeted neuronal imaging. Nat Methods, 2015, 12(9): 852-8 Zemelman BV, LeeGA, Ng M, et al. 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Neuron, 2014, 81(4):800-13; 个人分类: 活色生香de生物科学|24784 次阅读|60 个评论

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标签: 光遗传学

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