Development and characterization of an enterovirus 71 (EV71) virus-like particles (VLPs) vaccine produced in Pichia pastoris • https://doi.org/10.1080/21645515.2019.1649554 • Abstract • Enterovirus 71 (EV71) is one of the major causative agents for hand, foot and mouth disease (HFMD) in children. Although there are three inactivated virus-based HFMD vaccines licensed in China, alternative approaches have been taken to produce an effective and safer vaccine that is easier to manufacture in large scale. Among these, a virus-like particles (VLPs) based EV71 vaccine is under active development. For this purpose, an efficient methodology for the production of EV71-VLPs by recombinant technology is needed. We here report the construction and expression of the P1 and 3C genes of EV71 in Pichia pastoris for producing VLP-based EV71 vaccine antigen with a high yield and simple manufacturing process. Based on codon-optimized P1 and 3C genes, EV71-VLPs were efficiently expressed in Pichia pastoris system, and the expression level reached 270 mg/L. Biochemical and biophysical analyses showed that the produced EV71-VLPs consisted of processed VP0, VP1, and VP3 present as ~35nm spherical particles. The immune response as a function of EV71-VLPs and adjuvant dose ratio was investigated for vaccine development. Immunization with EV71-VLPs of 1-5 μg/dose and adjuvant of 225 μg/dose induced robust neutralizing antibody responses in mice and provided effective protection against lethal challenge in both maternally transferred antibody and passive transfer protection mouse models. Therefore, the yeast produced EV71-VLPs antigen is a promising candidate for the development of vaccine against HFMD. • Keywords: Enterovirus 71, hand foot and mouth disease, vaccine, immunogenicity, Pichia pastoris, virus-like particles E print link : https://www.tandfonline.com/eprint/HG25RAZNRRDBYFIV9JXU/full?target=10.1080/21645515.2019.1649554
【转载中国病毒学论坛微信公众号文章】 北京协和医学院崔胜研究员团队Science Advances成功解析EV71病毒2C解旋酶的高分辨率晶体结构 原创 2017-04-30 关洪鑫 中国病毒学论坛 近日，中国医学科学院 北京协和医学院 病原生物研究所崔胜研究员团队解析了2.5埃分辨率的EV71病毒2C解旋酶晶体结构（EV71 2C）。 他们发现，2C 包含了ATP酶结构域，锌指结构及C端alpha螺旋区。2C解旋酶通过C端alpha螺旋与另一个2C分子表面疏水性口袋结合，发生多聚；研究证明，2C的多聚化是其酶活性和EV71病毒复制的前提条件，阻断2C多聚化是潜在的抗病毒策略。EV71 2C的晶体结构不但是微小核糖核酸病毒科的首个2C解旋酶高分辨率结构，而且是AAA+蛋白家族首个RNA解旋酶结构。这些发现为理解2C解旋酶机制提供了三维结构信息，为抗病毒药物设计提供了新思路。 相关研究成果4月28日在线发表于Science子刊 Science Advances ，标题为“Crystal Structure of 2C Helicase from Enterovirus 71”。 图1. EV71 2C 晶体结构及其锌指结构 微小核糖核酸病毒科既包括了危害人类健康的脊髓灰质炎病毒，手足口病病毒（EV71等），鼻病毒和甲肝病毒等；又包括了危害畜牧业的口蹄疫病毒。 国家卫生计生委公布的数据显示：2015年我国手足口病新发病例已接近200万，位居丙类传染病之首。 虽然EV71疫苗已上市，但其对引起手足口病的其他病毒（如CA16等）保护作用有限。脊髓灰质炎病毒疫苗已使用了数十年，仍不能完成世卫组织发起的“脊灰根除计划”的目标。由此可见，仅依靠疫苗难以实现疾病控制的目标，抗病毒药是必要的补充。然而，迄今为止，尚无抗微小核糖核酸病毒的药物上市。 2C蛋白是微小核糖核酸病毒中最保守的复制酶之一，属于AAA+家族RNA解旋酶，参与了病毒脱衣壳、RNA合成和衣壳组装成等关键过程，因此是重要的药物靶标。 由于2C蛋白极不稳定，国际相关领域历经数十年努力仍无法解析2C的高分辨率结构，阻碍了对其功能的理解及药物研发。崔胜课题组通过系统的构建优化，成功表达了截短N端膜结合区的2C蛋白并解析了晶体结构（2.5埃）。 他们发现，2C含有一个ATP酶结构域，一个“双三棱锥”构型锌指和一个C端两亲性螺旋（图1）。ATP酶和锌指之间形成疏水口袋与另一个2C分子C端alpha螺旋结合，介导了2C自我多聚化。利用X射线小角散射等技术，他们发现2C的ATP酶活性严格依赖溶液中2C多聚体的形成，提示了多聚体是具有生物学活性得组装模式。为验证结构学的发现及推论，他们进而利用反向遗传学体系在细胞模型上逐一验证了2C的关键氨基酸突变对EV71复制的影响，他们证实C端螺旋介导的2C多聚化EV71病毒进行复制的必要条件。由于六聚体组装是AAA+蛋白家族的特征之一，研究人员利用JCV的Large T antigen 六聚体结构为模板构建了EV71 2C六聚体模型 （图2）， 图 2. EV71 2C 六聚体模型 并推测了2C-RNA相互作用模式和2C成熟化剪切的机制（图3）。 图3. EV71 2C成熟化剪切机制示意图 EV71 2C解旋酶结构的解析填补了微小核糖核酸病毒结构生物学研究领域的一个重要空白。目前，已发现数十种具有抗病毒活性的抑制剂靶向2C解旋酶。EV71 2C晶体结构的解析为揭示抑制剂作用机制、开展虚拟药物筛选和结构辅助的分子设计提供准确的三维信息；所建立的2C活性评价实验体系为抑制剂的筛选提供了关键技术平台。 中国医学科学院 北京协和医学院 病原生物学研究所关洪鑫（博士生）为本文第一作者；中国医学科学院 北京协和医学院 病原生物学研究所崔胜研究员为本文通讯作者。该项研究得到了国家自然科学基金和国家重点研究和发展计划的资助。 原文链接 http://advances.sciencemag.org/content/3/4/e1602573 Crystal structure of 2C helicase from enterovirus 71 Hongxin Guan, Juan Tian, Bo Qin, Justyna Aleksandra Wojdyla, Bei Wang, Zhendong Zhao, Meitian Wang, Sheng Cui* Enterovirus 71 (EV71) is the major pathogen responsible for outbreaks of hand, foot, and mouth disease. EV71 nonstructural protein 2C participates in many critical events throughout the virus life cycle; however, its precise role is not fully understood. Lack of a high-resolution structure made it difficult to elucidate 2C activity and prevented inhibitor development. We report the 2.5 Å–resolution crystal structure of the soluble part of EV71 2C, containing an adenosine triphosphatase (ATPase) domain, a cysteine-rich zinc finger with an unusual fold and a carboxyl-terminal helical domain. Unlike other AAA+ ATPases, EV71 2C undergoes a carboxyl terminus–mediated self-oligomerization, which is dependent on a specific interaction between the carboxyl-terminal helix of one monomer and a deep pocket formed between the ATPase and the zinc finger domains of the neighboring monomer. The carboxyl terminus–mediated self-oligomerization is fundamental to 2C ATPase activity and EV71 replication. Our findings suggest a strategy for inhibition of enterovirus replication by disruption of the self-oligomerization interface of 2C. 本文作者：关洪鑫；
抗肠道病毒药物设计和前景展望 --“第一部分：背景回顾” 二十一世纪以来，由EV71，柯萨奇A16等肠道病毒引起的手足口病疫情爆发波及全球，在亚洲地区尤为严重。以我国为例，手足口病由明显的季节性流行逐渐转变为全年均可发病。2010年以来，年均手足口病新发病例数量超过百万，发病率位居我国丙类传染病之首（依据国家CDC法定传染病报告）。手足口病的首要受害者是免疫系统尚未发育完善的幼儿和儿童（6岁以下），成为威胁这一群体健康不可忽视的因素之一。手足口病病毒可通过粪口途径迅速传播，除了典型的皮肤红疹伴随持续高热等症状以外，有一定比例的患者可发展成重症，引起无菌性中枢神经系统感染并导致死亡。因此，手足口病的流行在一定程度上可引发恐慌等社会不稳定现象。 肠道病毒属于微小病毒科，包括至少285个成员，分成29个种，13个属。其中有6个病毒属为人类或动物的病原体。除手足口病毒以外，为人们熟知的微小病毒科病原体还包括了脊髓灰质炎病毒（PV），甲型肝炎病毒（HAV），口蹄疫病毒（FMDV）以及可引起心肌炎的柯萨奇病毒B3型（CVB3）等病毒。这些病毒无疑是人口健康和社会经济发展的重大威胁 （ 1） 。 时至今日，有效的肠道病毒防控手段依旧有限。成功的疫苗仅包括脊髓灰质炎疫苗，甲型肝炎疫苗和口蹄疫疫苗等寥寥几种。最近，正在中国研发的两种 EV71疫苗取得重大进展。分别由中国医学科学院医学生物学研究所和中国食品药品检定研究院研发的EV71灭活疫苗通过三期临床研究证明，这两种疫苗（100U和400U抗原）均表现出超过94%的有效性 （ 2,3） 。然而，接下来的问题是，仅仅依靠疫苗是否可以实现手足口病的控制。以脊髓灰质炎的防控历史为例， GlobalPolio Eradication Initiative 即GPEI组织于1988年成立，旨在通过全球范围的大规模疫苗接种于2000年之前根除脊髓灰质炎病毒 （ 3） 。然而现实的情况表明，在距离2000年十五年之后的今天，脊髓灰质炎仍然在多个国家和地区流行。因此，领域内的专家普遍认为，实现肠道病毒的控制不仅需要有效的疫苗，而且需要抗病毒药物的辅助。 肠道病毒药物设计策略可依据潜在的药物靶标可分为靶向病毒衣壳的药物设计，靶向病毒编码的非结构蛋白的药物设计，靶向非编码 RNA的药物设计和靶向参与病毒入侵、感染的宿主蛋白的药物设计等几类。肠道病毒生命周期中许多关键步骤往往为药物设计提供了重要线索。例如，病毒的入侵和脱壳过程，病毒前体蛋白的合成和成熟化剪切，病毒基因组合成，免疫逃逸和病毒颗粒组装/形态形成。显而易见，在分子水平上揭示这些关键步骤的机制是药物设计的关键。结构生物学的进展可以为理性抑制剂设计提供精确的三维结构信息。例如在上世纪八十年代，鼻病毒颗粒晶体结构的解析 （ 4） 导致了一系列衣壳结合抑制剂的诞生。上世纪九十年代，鼻病毒3C蛋白酶晶体结构的解析支撑了芦平曲韦(Rupintrivir) （5） 等蛋白酶抑制剂的设计和合成。然而，经过近三十年的努力，目前尚未有任何一种抗肠道病毒药物获批上市。 参考文献 1. Tuthill, T.J., et al., Picornaviruses. Curr TopMicrobiol Immunol, 2010. 343: p. 43-89. 2. Liang, Z. and J. Wang, EV71 vaccine, an invaluable giftfor children. Clin Transl Immunology, 2014. 3(10): p. e28. 3. Griffiths, E., D. Wood, and L. Barreto, Polio vaccine:the first 50 years and beyond. Biologicals, 2006. 34(2): p. 73-4. 4. Rossmann, M.G., et al., Structure of a human common coldvirus and functional relationship to other picornaviruses. Nature, 1985.317(6033): p. 145-53. 5. Patick, A.K., et al., In vitro antiviral activity ofAG7088, a potent inhibitor of human rhinovirus 3C protease. Antimicrob AgentsChemother, 1999. 43(10): p. 2444-50.
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