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漫话基因剪刀和基因编辑（一）：细菌是功臣: 热度 8 cherrylu1960 2017-9-12 22:16; 基因编辑近来很火。基因编辑所用的工具叫基因剪刀。可随便问一个不懂生物技术的人，啥叫基因剪刀，话少的人可能会说“不知道”，话多的人可能会回答，“那还用说，基因剪刀就是用来剪基因的呗，就像裁缝手里的剪刀是用来剪布料的。”哈哈，这看似也没错，不过，这字面解释好像说了跟没说差不多。基因剪刀与普通剪刀的区别除了是分子构成、小得看不见，摸不着，最得重要的是它们是长眼睛、智能化的，能识别剪哪里不剪哪里，不会乱来，所以，也可以称它们是长眼睛的“分子手术刀”。生命科学发展迅速，新名词层出不穷，比如，基因编辑最近就火的不行，仿佛人的基因也快可以随便编辑修修改改、定制人类了。其实还远着呢，因为人类虽然完成了一些生物（包括自身）的 DNA 测序，但对很多能称之为基因的 DNA 片段管啥的还说不清楚。就好比一本书，每个字我们都认识，但字连起来的句子我们并不知道是啥意思，所以在很大程度上， DNA 碱基排列构成的基因序列，还像本天书。基因剪刀的重要作用之一，是可以帮助人类搞清这本天书的意思，接下来动手脚就好办多了。当下时髦的基因编辑工具（俺还是习惯称它们为基因剪刀），比如那个 CRISPR/Cas9 ，其实与上世纪在细菌体内发现的一类核酸内切酶——限制性内切酶异曲同工。由于限制性内切酶的发现，才开启了基因工程的新篇章。事情大致是这样的：上世纪 50 年代， DNA 双螺旋结构被发现， 60 年代，揭示了遗传密码的秘密，然后，人类就生出了很多对基因进行“施工”，从而揭示其秘密，进而改造生命的梦想。既然 DNA 在染色体上呈线性排列，基因就存在于 DNA 的碱基序列之中。那么，科学家们就可以切开一段基因，把它同另外一段基因联结到一起，制成重组 DNA ，从而改变生物体的性状。于是是重组 DNA 技术 ——伟大的基因工程就要拉开序幕啦。要进行上述操作，基因剪切工具十分重要。 DNA 可不是想剪哪里都能如愿以偿的。 DNA 既看不见也摸不着，科学家们的手再灵巧，也无法直接切割基因。需要寻找专用的基因剪刀。幸运的是，大自然赋予了科学家们神奇的施工工具。科学家们在大肠杆菌等菌类中发现了一些小巧灵活、有很强特异性的物质，它们能够识别 DNA 大分子链上特定的核苷酸顺序，并能在一特定部位将 DNA 断裂。这种物质被称作限制性内切酶（一种蛋白质）。这类酶脾气很怪，见到外来 DNA 就剪切，切得它们不能表达相应的蛋白质，从而起到限制外来 DNA 进入，成功抵御外来入侵的作用，因而得名。原来是细菌的免疫防御系统中得到的启示啊。别小看细菌等微生物，它们可研究利用的地方多着呢。目前发现的限制性内切酶有好多种，每一种（2型）都有极强的特异性，可以准确无误地进行核苷酸的识别，不会错切一刀。可以说，限制性酶切酶是世界上最小、最灵巧的分子剪刀。借助于基因 “剪刀”的帮助，科学家们可以从提取出的 DNA 片断中得到想要的一段。也可以有目的地从 DNA 长链中针对某些基因进行敲除或促其突变，从而通过观察基因缺失引起的表型变化，推测该基因的生物学功能，为人类完全读懂基因天书、改造生命奠定基础。目前基因编辑技术中最常提到的应用比较成功的基因敲除（剪切）工具当属 CRISPR/Cas9 ，这把刀很厉害，就是名字太长，也不那么好记，算了，还是不提了。免得一大串艰涩的名词出来看着眼晕。 CRISPR/Cas9 的出身同样离不开细菌。在生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生了强大的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌则为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出 CRISPR 系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。大自然的鬼斧神工啊，真的难以想象这些人类看不起的微生物是如何做到的！生命科学的进展离不开从自然界生命中获得资源和灵感。 CRISPR 其实在绝大多数细菌和古细菌中都普遍存在，直到 2005 年，这一机制才逐渐被科学家们认识到。天赐良缘。科学家们经过优化，利用细菌的这套防御系统，制造出了 CRISPR/Cas9 基因编辑超级剪刀。 2013 年，这把厉害的基因剪刀得到广泛应用。 CRISPR/Cas9 工作原理简单说，就是利用具有引导作用的单链 gRNA(Guide RNA) 引导核酸酶 Cas 蛋白（限制性内切酶）在与 gRNA 配对的靶位点处剪切双链 DNA ，引起 DNA 双链断裂（ DSB ）。既然基因被剪切断了，生物体就要想办法修复，这一修复，八成得乱套，基因不是移码突变，就是被替换或删除，致使基因功能丧失。基因功能丧失，当然也就不能指导相应的蛋白质合成，从而对生物系统产生影响（要是能阻止肿瘤细胞蛋白质合成，岂不是天大的好事）。哎，这样讲还是显得有些复杂，没办法，再简单真说不容易清楚了。基因编辑有点高深，一般人也不需要了解那么多吧。 CRISPR/Cas9 这把基因剪刀最大的好处就是证明可以有效剪切哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、鱼类、微生物等多种生物 DNA 。因此，基于 CRISPR/Cas9 基因编辑已具体应用于这些生物领域，有望针对他们展开低成本快速基因编辑，创造更多基因工程的奇迹，被认为前景广泛。具体详情，下篇再试述。总之，基因编辑不但需要长眼睛的智能剪刀，也需要浆糊，需要搬运工具、载体，等等。其中，细菌等微生物功不可没，咱其实是个微生物的崇拜者呢（才一口吞下 2.4 亿个细菌）。; 个人分类: 科普文章|9134 次阅读|19 个评论

[转载]DNA甲基化与限制性内切酶: nobodykonws 2016-7-18 19:35; Souce: 纽普生物 2016-07-15 你有没有用过 XbaI 或者 ClaI 酶？有没有遇到过比较奇葩的现象？你是否了解 DpnI 能消化模板 DNA 而不能消化掉新合成的 DNA 的原理？——以上都是因为相同的原因： DNA 的甲基化。为什么是甲基化？限制性内切酶在实验室中随处可见，人们很容易忘记这些细菌来源的酶的真正功能。原核细胞为了保护自己，选择性地降解外源 DNA ，可保护个体免于外来 DNA （如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。限制内切酶负责降解进入原核细胞的外源 DNA ，甲基化酶则对细胞自身的 DNA 进行甲基化，从而保护细胞的 DNA ，使其不被自己细胞内的限制性核酸内切酶降解。除了上述限制性修饰系统， DNA 甲基化在调节基因组复制，错配修复和促进 / 抑制蛋白表达过程中发挥作用。参与这些过程的甲基化酶（如 Dam 和 Dcm 甲基化酶）与限制性修饰系统是独立的，但仍然可以影响某些限制性内切酶是否能有效地切开 DNA 。常见的实验室 K12 的大肠杆菌菌株如 DH5alpha 包含 3 种甲基化酶识别不同的 DNA 甲序列： Dam 甲基化酶在 DNA 的 GATC moti 的 A 上添加一个甲基。 Dcm 甲基化酶在 DNA 的 CCWGG 的第二个 C 上添加一个甲基。 EcoKI 甲基化酶在 DNA 的 AACNNNNNNGTGC 或者 GCACNNNNNNGTT motif 的 A 上添加甲基。甲基化酶对克隆和酶切的影响尽管不是所有的原核 DNA 有着相同的甲基化水平，但是在酶切消化的时候还是要考虑甲基化的影响。尽管有些甲基化酶不属于限制性修饰系统，但是他们识别的序列和有些内切酶的识别位点重合，从而抑制了这些酶的酶切功能。比如 XbaI 的识别序列是 TCTAGA ，如果在该序列前面有 GA 紧邻或者该序列后面有 TC 接着，那么 Dam 的甲基化作用会使得 XbaI 切不开该位点。相反地， DpnI 酶切要发挥活性则需要 DNA 发生甲基化。 DpnI 酶在定点突变中是一个很常用的酶，它一般用于老的 DNA 模板的去除。而这些老的 DNA 模板需要从 dam+ 的大肠杆菌中提取才行，这样提取的 DNA 质粒上的 GATC 序列会带上甲基化修饰，刚好可以被 DpnI 酶给消化掉。而通过 PCR 扩增出来的新的 DNA 模板则会被保留。如何知道某种内切酶会被甲基化修饰影响？下面列出了被甲基化修饰抑制的常见 10 种限制性内切酶酶 Dam 甲基化 Dcm 甲基化 EcoKI 甲基化 ApaI 无影响有影响无影响 BsaI 无影响有影响无影响 ClaI 有影响无影响无影响 DraI 无影响无影响有影响 HpaI 无影响无影响有影响 MboI 有影响无影响无影响 MscI 无影响有影响无影响 PmeI 无影响无影响有影响 XbaI 有影响无影响无影响 DpnI 甲基化存在的时候有活性无影响无影响可以通过 REBASE database 查询更多的限制性内切酶的相关信息。如何控制甲基化？如果不想 DNA 质粒被甲基化，那么可以通过更换菌种来达到目的。如果你使用的限制性内切酶会被 Dam 或者 Dcm 甲基化酶的甲基化所 block ，那么可以将质粒转化到 dam– / dcm– 菌株，比如说 JM110 ，然后重新制备质粒。值得注意的是， dam– / dcm– 菌株由于缺少 Dam 的错配修复功能，所以 DNA 突变几率大增，所以该菌种不适合长期保存质粒。; 7751 次阅读|0 个评论

限制性内切酶的命名: firepear 2009-2-15 23:09; 基于分离出此酶的微生物学名，前三个为斜体字母，即属名的第一个字母的大写加上种名前两个字母的小写，有变种或不同品系则后跟小写的品系名首字母，而最后以罗马数字表示在该品系细胞中发现的限制性内切酶的次序。如： Escherichia coli R 株分离出的第一种限制性内切酶命名为 Eco R I E Escherichia (genus) co coli (species) R RY13 (strain) I First identified (order of identification in the bacterium) H.O.Smith和D.Natnans提出(文章PubMed ID: 4588280); 个人分类: 命名系列|6554 次阅读|0 个评论

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