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[转载]Protocols——Bacterial Transformation: wayneqi 2019-10-16 22:53; https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/; 个人分类: Q技能修炼|1534 次阅读|0 个评论

漫话基因剪刀和基因编辑（二）：好用的剪刀和得力的搬运工: 热度 4 cherrylu1960 2017-9-30 23:00; 比较喜欢用基因修饰（ genetic modification ）这个名词，它准确描述了人类要做的事情——了解了生命遗传基因的秘密后，就要想办法根据我们自身的需要，对其进行修修改改，这既是科学探索的重大诱惑，也应该是造福人类的重要手段。人类以微生物为对象的基因操作已经取得了相当大的成功，不仅可以利用基因修饰过（也可以说是脱胎换骨的改造）的微生物作为活的工厂，为人类生产药物等，还发现了微生物的许多遗传秘密，为人类向高等生物的基因修饰进军铺平道路。细菌中发现的 CRISPR 系统为人类进行高等哺乳动物和植物的遗传修饰提供了强大的工具，让我们看到了人类改造生命的光辉前景。抛开通过遗传修饰治疗人类疾病不说，新型基因剪刀将大大加快我们动植物的遗传育种的速度。植物的分子育种，或者说基因工程已有二三十年的历史，但自从有了“转基因”这个词，让这项技术蒙上了阴影。我想多数人还是赞成通过基因修饰的方法使农业发展走上捷径，人类健康看到新的希望。这个时代，传统遗传育种必然插上分子手段的翅膀。奔波于田间地头、搞传统育种、选种的科学工作者和在实验室里摆弄各种仪器、瓶瓶罐罐的分子生物学家，都值得尊重。传统品种选育和看似更先进的分子育种，都是农业科研的重要手段，可以相互促进，相互补充。袁隆平的水稻除镉技术，用到了基因敲除，属于基因修饰的一种方法，是分子育种的手段。上文谈到基因剪刀可以用来进行基因敲除，当然，这个过程并不是剪一剪子两剪子这么简单，敲除也不一定是真的把承载基因的那段 DNA 弄掉，比如，使密码移位，失去表达意义，效果也是一样的。基因敲除是遗传修饰的重要手段。其实不管是添加一个或几个有利基因到生物体内，还是去除几个不利基因，性质是差不多的，都是从分子水平改变生物性状，大大加快生物进化进程。基因编辑将大显身手，因为我们有了 CＲISPＲ/Cas9 这个宝贝，重要的是，它在高等动物、高等植物、乃至人类细胞的基因修饰上都有效。所以，人类从分子水平上改造生命的步伐又向前迈进了一大步。不知道即将浮出水面的 2017 诺贝尔生理学或医学奖会不会与基因编辑扯上关系。但要进行基因编辑，基因从哪里来？如何把基因运进车间？编辑完了又如何送回目标植物细胞？如何才晓得编辑成功？本文想说一说完成基因编辑这个复杂工程，非常有用的工具，它们专门用来运载基因，就是质粒和噬菌体。当然，它们的应用同样也离不开基因剪刀。质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，植物的叶绿体和线粒体等胞器中也发现它们的身影。大部分的质粒为环状构型，但也存在线形质粒。这家伙游离于细胞 DNA 之外，看起来像吃闲饭的，生物学家让它们派上了大用途：充当基因“搬运工”。质粒不仅可以在细胞体内独立复制并遗传下去，还有一个最大的特点就是具有浸染功能，它可以从一个细菌浸染另一个细菌，并且赋与它一些新的特性。科学家们利用基因剪刀把质粒 DNA 的环切开，将选中的目的基因接上，再使它去浸染大肠杆菌等微生物。这样，搭质粒这个运输车辆，外源基因就顺利进入生物细胞，进行繁殖扩增。借助于质粒这个运载体，科学家们可以很方便地得到基因编辑需要的素材。但质粒只能容纳小的基因片段，应用比较受限制。除了质粒之外，噬菌体也可以充当很好的搬运工，还常用来建立基因文库，也就是基因图书馆。噬菌体这种专吃细菌的病毒，结构简单，比较好欺骗，科学家们采取“偷梁换柱”法，把噬菌体 DNA 中不重要的序列去掉，换上外源基因，这些傻傻的家伙往往发现不了，稀里糊涂就当成了自己的家庭成员，带着这些外来户继续侵染其它细菌，这样，就会产生更多包含外源基因的噬菌体，供人们使用。利用噬菌体运载储存外源基因，最大的好处是比质粒携带的多得多，可以携带长碱基序列。不过，在转基因植物培育过程中，常利用的土壤农杆菌及其 Ti 质粒，名气还是很大的。培育转基因植物，大多离不开它们牵线搭桥。这里不细说了。在转基因科普中，很少谈到技术细节，可能因为实在不容易讲清楚或者还有其他原因吧。依靠细菌质粒或噬菌体为运载体，可建立起以细菌或噬菌体形式保存的基因库，什么时候想用某一个基因了，先对它们进行筛选，其后用挂着特定鱼饵的钓鱼杆，将上钩的基因钓出来，就可以进行编辑了。库存的基因品种不能太多，否则选择起来太麻烦，为了使基因库里的货物种类有所集中，人们用另外一种方法建库，就是在某一种蛋白质（比如 A 蛋白）表达的鼎盛期取来生物样品，分离出蛋白质的模板－－ mRNA, 然后以 mRNA 为模板，合成 DNA 。这个过程和生物体内信息流的方向是相反的，因此称为反转录。由反转录产生的 DNA ，叫 cDNA 。这时候再按照上面建 DNA 库的方法建立基因库，就得到 cDNA 库，在这样的库里， A 蛋白的基因肯定多，因此想找到 A 蛋白的基因，就容易多了。袁隆平院士成功找到了水稻中专门喜欢镉的捣蛋基因，并依靠一系列基因工程的操作手段把它们敲掉，但愿这种被敲掉捣蛋基因的稻子尽快造福我们。当然，实验成功只是走出了第一步，新的种类走入千家万户，还需要反复的筛选，大田实验、安全性分析，等等，有很长的路要走。但有了基因编辑新手段，会大大加快农业育种的速度，造福人类，难道这不是好事吗？ CＲISPＲ/Cas9系统, 更先进的剪刀工具，在基因搬运工等等的帮助下，将带给我们更优良的作物，据报道， 2020 年，将有一种基因编辑修饰的新的玉米品种上市，实际就是常见的粘玉米，被敲掉了产直链淀粉酶的编码基因而已，分子育种的产物，与转基因育种一样，都是动了植物基因组这个大盘子，看起来不自然了。但在自然界中，这样的改动一直在发生，只不过基因编辑，分子育种，使这个进程大大加快了。; 个人分类: 科普文章|7397 次阅读|8 个评论

质粒DNA的转化操作详细步骤: liyoulei 2014-12-16 22:41; 【原理】转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶(R-，M-)。将对数生长期的细菌(受体细胞)经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的细胞)。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药(Ampr)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。本实验是将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌用于质粒 DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA。【试剂与器材】 1.LB液体培养基 10g 胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。 2.LB固体培养基 LB液体培养基中加1.5%琼脂粉（15g/L），高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。 3.0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。 4.氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。 5.人Bcl-2重组质粒它是EcoR Ⅰ单酶切的pBluescriptⅡ KS(-)载体与EcoR Ⅰ单酶切的人Bcl-2 cDNA重组而成的，大小为4 861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2 961bp的质粒载体。因此用EcoRⅠ酶切则应到空载pBluescriptⅡKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2 cDNA片段(1.9kb)。配制成2g/1μl。 6.大肠杆菌DH5α 此为DNA扩增菌 7.恒温水浴箱 8.超净工作台 9.高速冷冻离心机 10.恒温摇床 11.恒温箱 12.消毒离心管 13.消毒tips 14.玻璃培养皿直径90mm 15.玻璃涂布器 16.95%乙醇 17.标记笔; 4593 次阅读|0 个评论

[转载]质粒抽提的那些事: 热度 2 chengjiny 2011-5-28 10:42; 所有的质粒抽提方法首先都要考虑如下几点：如何去除 RNA ，如何将质粒与细菌基因组 DNA 分开，如何去除蛋白质及其它杂质。去除 RNA 相对比较简单，首先是使用 RNase 消化 ( 抽提中或者抽提后 ) 。经过 RNase 消化后， RNA 变得比较小了，其残留对酶切反应几乎没有影响。如果要彻底去除残留得 RNA ，则需要更烦琐的操作。将质粒与细菌基因组 DNA 分开，基本上是采用两种办法：一是利用酶 / 弱去污剂部分裂解细菌，在抽提时只让质粒从细菌中释放出来，而不让基因组 DNA 从细菌中出来，从而将质粒和基因组 DNA 分开；二是利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来，再利用质粒和基因组 DNA 在变性 / 复性过程中的不同表现，将质粒与基因组 DNA 分开。去除蛋白质及其它杂质，基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是，依据不同的细菌，不同的培养条件，以及操作时的精细程度等，杂质的残留量会不同。所以，通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。经过上面的处理，沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了。如果要用于更高级的实验，如转染，则需要做进一步的纯化，如 CsCl 超离心。实验前方法 / 试剂的选择　首选方法是碱裂解法。如果有问题，或者是大质粒 (15 kb) ，则用温和的方法 SDS 裂解法。详细情况见 “ 分子克隆 ” 。试剂盒几乎都使用碱裂解法，所以都有一个通病，抽提大质粒时效果不好。关于碱裂解法质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性；不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了 ( 电泳时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是此变性的质粒。 ) 。所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。（似乎可以做这么一个推理：在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长，直到完全分开。理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可能是 100% 的，而没有完全分开的两条链却完全可能 100% 配对复性）碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。现在得问题是，大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中，超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。质粒抽提的 8 大窍门 1 ：摇菌时间。过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。如果出现了问题，调整培养时间会有帮助： Nick 多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。 2 ：起始菌体量。大家习惯说 “ 从多少 ml 菌液中抽提质粒 ” ，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。 3 ：菌体的彻底悬浮。如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。 4 ：使用相对过量的试剂。这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。如果认为这样不经济，就少用一点菌体。 5 ：裂解时间。加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。 6 ：中和的操作。在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。 7 ：中和后的离心去蛋白。一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。　降低 RNA 残留的方法 RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml) ，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA 残留，但都不能彻底去除。幸运的是， RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。如果想彻底去除 RNA 残留，可以用试剂盒，或者使用对 4 个碱基都作用的 RNase 。　降低 gDNA 残留的方法 gDNA 的残留问题，必须在抽提过程中解决，否则，就只能用胶回收方法处理了。 gDNA 越大，越难于复性，也就越容易被去除；所以，一定要尽可能不打断 gDNA 。裂解体系越粘稠， gDNA 越容易被扯断；操作手法越重， gDNA 也越容易被打断。温和操作，使用相对过剩的试剂，是降低 gDNA 残留的最好方法。　降低蛋白质残留的方法蛋白质的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS- 蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于 4 ℃一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。只要加入溶液 I 后的悬浮，加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的，蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够，甚至过剩，才能确保裂解和中和是彻底的。当然，试剂盒及苯酚的使用，是可以更进一步降低蛋白质的残留的。　降低质粒 Nick 的方法细菌收获时间，菌株的选择，抽提操作的剧烈程度是影响 Nick 的三个主要因素。细菌收获过早，质粒还在复制过程中， Nick 的比例较高；过晚，细菌开始死亡，杂质会比较多。如果使用胞内酶含量很高的宿主菌，会出现较高比例的 Nick 。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混匀操作，也可以导致一些 Nick ，但影响不会比前两者大。　降低变性超螺旋的方法理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家没有非常在意，一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响，二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液，在加入溶液 II 后，体系能在 1 分钟内变澄清，再快速加入溶液 III ，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。 ( 变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。 ) 　关于质粒多聚体 QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察：从有些宿主菌中抽提质粒 (pTZ19) ，电泳能发现很多条带；但使用单酶切后，仍然变成一条带，大小正好是线性单质粒的大小。根据这一观察，可以推理如下：那些大的条带 ( 质粒多聚体 ) 是由完整的单质粒 “ 粘 ” 在一起形成的，而不是我的一条链与你的一条链复性在一起；第二，这种 “ 粘 ” 只是部分的，否则酶切会有问题；第三，这种 “ 粘 ” 是脆弱的，线性后的刚性足以打破它。如果是这样，质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关，可以不管它 ( 也管不了 ) ，因为它不影响酶切，或者说，即使质粒多聚体切不动，也不会影响太大。总之，碰到这种情况，不要简单地认为有问题，而是应该一步一步往下做，但一定要做完一步，检测一次，看一看结果与预期的吻合程度。　提高得率的方法利用氯霉素抑制染色体的复制，而不抑制质粒的复制这一特点，在低拷贝质粒的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。　为什么酶切后质粒总是降解？酶切后质粒降解的原因很多，但如果用实验方法排除了质粒的质量及酶的质量因素后 ( 用 A 酶能成功，用 B 酶失败，但 B 酶能成功用于其它质粒。 ) ，仍然不能解决此问题，就只能从质粒的构造上去找原因了。　为什么质粒抽提得率低？伴随有 RNA 污染：菌体过量、 RNase A 失效。起始菌体过量是导致抽提失败的最主要素。菌体过量将导致的问题有：得率低 (RNA 与质粒 DNA 竞争吸附 ) ， RNA 污染 (RNase A 相对量不足，不能在规定时间内降解所有的 RNA) ，超螺旋比例低 ( 菌体过量使溶液非常粘稠，为混匀溶液所需要的外力很容易破坏超螺旋 ) 。确保成功的关键是：如果从 1.5 ml 菌液中抽提出来的质粒足够实验所需，绝对不要使用 3.0 ml 起始菌液。在实验操作过程中，下列现象提示菌体过量：加入 P2 混匀，静置 2 分钟后，如果溶液没有变成透明，或者溶液看起来虽然已经变成透明，但转动离心管时发现溶液太粘稠或者不均匀。加入 P3 后，不能完全混匀，有大块物形成。离心时很难使之离至管底。没有 RNA 污染：将上清移入吸附柱时，吸入了絮状蛋白质。如果在步骤 4 “将上清移入吸附柱”操作中，吸入了絮状蛋白质，那么，离心时絮状蛋白质将覆盖在吸附膜的表面，离心时难将液体离下。在加入 T1 洗脱时，将发现 T1 不能很快渗入吸附膜中，而是一直处在吸附膜表面。此时用一个干净的吸嘴轻轻在吸附膜的表面来回划几次可以使 T1 进入吸附膜中，这时可能出现两种情况：最终获得 DNA ，但伴随蛋白质的污染；仍然没有多少 DNA 。蛋白质污染的可能后果是酶切时 DNA 出现非特异降解。质量低基因组 DNA 污染：可能的原因有三：加入 P2 后室温放置时间超过 4 分钟、加入 P2 和 P3 后混匀动作不温和，菌体过量。 RNA 污染：菌体过量、 RNase A 失效。超螺旋比例太低：加入 P2 后室温放置时间超过 5 分钟、加入 P2 和 P3 后混匀动作不温和，宿主菌含内源核酶，菌体过量。酶切产物弥散：抽提所得的质粒被蛋白质污染，内切酶被污染。样品上柱后离心不下去样品中有大量蛋白质污染。; 8990 次阅读|2 个评论

质粒的命名: 热度 1 firepear 2009-2-15 23:57; 现在查到一个常用质粒的全序列轻而易举，可是了解谁帮它起的名字却没那么轻松.. 有查阅到对质粒命名的一些建议性质的文章，但是普遍接受的做法现在还没有，所以质粒的命名相对宽松但也有据可循，第一个小写字母p即plasmid首字母，后两个多为发现单位或个人；至于数字没弄清代表什么，pBR322是第一个人工质粒，可是322与其长度也搭不上，但是肯定有缘由，以后接触到新质粒的时候试图去了解一下它的故事也挺有意思的吧:-) 列举一些查到的例子： pBR: BRBolivar and Rodriguez pJR: JRJohn Pemberton pUC: UCUniversity of California pCR : clever name for a vector used to clone PCR products ...; 个人分类: 命名系列|15818 次阅读|1 个评论

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