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一篇有关个体生命起始的论文的诞生：由假想到实验历经20年: 热度 22 fuxy 2013-6-27 12:24; 一篇有关个体生命起始的论文的诞生：由假想到实验历经 20年傅新元科学工作者的人生，往往有着某种悲剧性或喜剧性：他／她可以由于实验的失败极度失望，也可以因为一个长久追寻的“假说”得到证明而欢喜若狂。由于失败总是远远多于成功，因此，要做真正的原创性科学研究，不仅需要智力和体力，更需要坚强的意志和百折不饶的信心。以承担科学工作做为谋生手段，大概是不可靠的。追寻科学发现的人生，从来不会是世俗人士的选择。真正科学“家”的生涯，是 passion－driven 的遥远的理想之途：只有开始和进取，却没有终结。不论有多少挫折和诅丧，你必须 “ eat it”。或许，你有时可以喘口气，那是当你的假说获得初步的证明，苛刻的科学同仁的对你有所认可。这时，你属于幸运的极少数。所谓的 All's well that ends well. 然而，对于科学家，这里的“end”，仍是“another beginning“。“幸运”就是意味着更多的新问题在等待着你。在此时此刻，我大概属于此类短暂的幸运之人士。我的幸运，都归功于数年来勤奋工作的，聪明能干的 , 了不起的年轻学子。这幸运的最初征兆，发生在两年多前的一个阳光明媚的日子：光明不是来自外面的烈日，而是出于一个优异的越南学生，DangVinh Do，展现给我的实验结果：STAT3（我们研究经年的，重要的调控基因表达的蛋白）在受精卵两次分裂后，于四个细胞的小鼠胚胎时期，奇迹般地从细胞质进入细胞核：STAT3 被激活了 (Activated)。这令人惊讶的现象，在我的眼中，如同神迹的出现。为什么我会如此激动？在个体生命起始时期，STAT3的激活又有何意义呢？插图： Expression of STAT3 during preimplantation mouse development. (A) Immunodetectionwith pan-STAT3 antibody indicates nuclear localization of STAT3 starting fromthe 4-cell stage. (B) Immunodetection with antibody specific to phosphorylatedtyrosine (pY705)-STAT3 and to OCT4 show nuclear STAT3 is tyrosinephosphorylated and correlates with re-expression of OCT4 in the 4-cell embryos.(Scale bar: 20 µm). From 1 GENES DEVELOPMENT 27:1378 – 1390 ， June 15th ， 2013 （ http://genesdev.cshlp.org/content/27/12/1378?top=1 ）故事的源头要进一步追溯到二十年前。那是1993 年的一个晚间，纽约西奈山医学院生化系的实验室。我在分析一位学生刚刚获得的 DNA序列的信息：从非洲蟾蜍（ Xenopus laevis ）卵母细胞的 cDNA 里，我们发现了一个新的 STAT （ S ignal T ransducer A ctivator of T ranscription) 2 基因。稍后我们发现此卵母细胞里表达的 STAT基因和我的同事Zhong Zhong 克隆的哺乳动物的STAT3同源 3 。当时 STAT1 和 STAT2 的基因已被克隆 4 。 JAK-STAT 介导的分子信号通路刚被发现 5 , 6 。这些成果来自对干扰素（高等生物产生的抗病毒的细胞因子）的信号通路的综合的研究 2 。在随后的许多年里，领域内的科学家大都认为 JAK－STAT 的主要功能是调控细胞因子（cytokines）引发的基因表达，特别是在免疫及炎症系统里起关键作用。过去二十年里的大量的实验已证明 JAK-STAT 参与了免疫系统的演化和各个层次的免疫反应的调控 7 。为什么早在1993年，我们却异乎寻常的选择了卵母细胞来研究 STAT？这是基于对生命起始过程的一个近乎疯狂的猜想。按现在流行的说法，一个重大科学问题开启了一个科学工作者的梦想。当时我初出茅庐，建立自己实验室不久，生气勃勃，信心满满，希望向生命科学里最重大问题发起冲击。生命科学的一个引人入胜的基本问题是受精后，融合的受精卵（ Zygote）如何启动最早的胚胎形成（embryogenesis），即所谓的个体生命如何起始和发育的问题。可以预期，在卵母细胞表达，已存于卵子里的（maternallyexpressed）某些活性分子，特别是基因转录因子（transcription factor）在受精后，胚胎形成中应该有重要的功能。可以推论，从受精卵发育成胚胎，必须遵循一个系统的，规则的，严格控制的基因表达程序（program）。由推论到证明，需要切实的实验。遗憾的是，在当时以至现在，有关这一关键步骤的调控的分子机制仍不清楚。最早引起我注意的一个有趣的现象是在受精的瞬间，酪氨酸激酶（ protein tyrosine kinase，PTK）的活化。我们较早的研究已证明 STAT 蛋白最显著的特异性表现在已预存于细胞质，受酪氨酸激酶专一性修饰后，转变为具有活性的基因转录因子，进入细胞核，调控特定的基因表达 6 。我常常把这讯号通路称之为 PTK－STAT Pathway。我由此设想，受精后的酪氨酸激酶 PTK 是否会引起 Maternal STAT活化，然后活化的STAT 进而成为引导最初胚胎形成的关键的基因转录因子？当时我的小小的实验室，以极为有限的研究经费，破例购入一百多只非洲蟾蜍，和我当时在西奈山医学院的一位同事合作，希望解析这 Maternal STAT 在胚胎发育中的功能。实验才开始，我的人生轨迹就发生了一个变化。 1994年，耶鲁大学向我发出工作邀请。我在西奈山医学院的实验室当时才建立不到三年，搬家将影响到正在进行的项目。我迟疑了一段时间，最终决定去耶鲁建立一个新的实验室。当时耶鲁没有专长 Xenopus 的胚胎发育研究的实验室，我无法发现合作者，也没有有关设施。我所属的系科是病理和免疫，和胚胎发育大都无关。这些不利的条件迫使我中断 Maternal STAT 及胚胎发育的项目。一百多只非洲蟾蜍转送给了我在西奈山医学院的同事。此项目可谓先兴师动众，然而立即出师不利。在 1996-1997期间, 我的实验室先后获得NIH 三个 RO1 研究基金支持，于是再次决定要系统的建立研究STAT的 in vivo 动物体系，改变我已适应和精通的，限于生化和细胞水平上的研究方向。我预期到，作为一位生化研究者，转向我生疏的方向去建立STAT突变体的动物模型可能会遇到的困境。开始的办法很简单：鼓动一个来自日本的博士后， Yoshiki Iwamoto，一个极为优秀的生化专家（毕业于PKC 发现者 Y. Nishizuka实验室），到耶鲁同事 Richard Flavell 的实验室去学习如何做小鼠的 STAT3 基因敲除（knockout， KO）。我们要开始做 mouse genetics ! 最初的进展和实验室的转型是缓慢的，有时是痛苦的和令人失望的。在我们刚刚起步，日本大阪大学的 Shizuo Akira （他是STAT3的发现者之一，现在主要研究 innate immunity）实验室，就发表了STAT3整体敲除的论文 8 。值得侃调的是，他的论文证实了我猜测到的, 试图我们自己来证明的一个现象：STAT3在胚胎发育中是必需的。没有STAT3，小鼠胚胎早期死亡。但是 Akira研究组并没有继续探讨由于 STAT3 缺失导致死亡的分子和遗传机制。 Akira 实验的结果，促使我们从头开始，建立由Cre-LoxP驱使的，有条件的，不同组织的 STAT3 专向敲除，而不是 Akira 已做的整体敲除。幸运地是，在Dr Iwamoto 就要离开我的实验室，去建立他自己独立的实验室之前，在我的朋友，当时在哈佛大学的李恩的大力帮助下，在1999-2000年，我们成功的获得了 Floxed STAT3 小鼠品系，从而可以进一步产生组织特异的STAT3被敲除的小鼠。数年后，我的实验室利用 STAT3 组织特异敲除小鼠作为研究体系，发表了一系列论文，阐述了 STAT3 在炎症，心脏衰死，到肥胖症等病理发展中的关键功能。但是，有关 STAT3在发育，特别是在胚胎早期发育里的功能的研究项目，仍遇到不断的挫折。实验室的谢兵同学，在博士毕业后，仍用一年多的时间试图建立一个 Inducible STAT3 KO 胚胎干细胞体系。他观察到一个颇为有趣的现象：敲除STAT3后的胚胎干细胞似乎自动的（by default）变成类似神经细胞样的分化细胞，显示了STAT3 或许控制，或抑制胚胎干细胞的分化。在我们试图进一步分析其中的分子机理时，英国的 Austin Smith 实验室已捷足先登，利用一快速和简单的生化方法，即通过对 STAT3 显性抑制（dominant negative ）突变蛋白作用的分析，首先提出STAT3在体外的胚胎干细胞里，维持着干细胞多功能性（pluripotency）的论点。感谢 Smith 的先走一步，谢兵的这部分工作和发现，只能保留在我的抽屉里了。在 2001-2002年，在耶鲁实验室里两位足智多谋，干劲十足的博士后，高谦和Michael Wolfgang，开始建立卵母细胞 STAT3 的敲除系统。大约一年后，他们失望的发现，已获得的卵母细胞 STAT3敲除的小鼠，并没有表现出可见的异常。他们渐渐失去了对此课题的兴趣。稍后继续他们有关STAT3和肥胖症的课题。在经历了一系列的挫折后，我在耶鲁的实验室几乎放弃了有关 STAT3在胚胎发育里的作用的课题。在我们搁置此项目的同时，从分子水平上分析具有多功能的胚胎干细胞的形成, 逐渐成为现代生物学的一个研究热点。 2003年，重要的Nanog基因被发现。 Oct4-Nanog Circuitry 是维持胚胎干细胞的关键因子。在石破天惊的Yamanaka 2006年的 iPS cell 实验 9 ，就是利用Oct4 在内的四个基因转录因子（transcription factor）在体外将体细胞转化为类似胚胎干细胞的细胞。他的实验，使人进一步认识到，具有远见的 John Gurdon 四十多年前的发现的现代意义。John Gurdon利用核转移这一技术，将蛙的体细胞核移植到无核的卵子里 10 ，促使向胚胎干细胞的转变，最终成功实现“克隆”动物。这两例实验用“非自然（artificial）”的方法取得了不可思议的成功，证明了分化细胞是可逆性的原理，这是现代生命科学认识和技术上的重大进步。问题是，什么是“自然”的，真正在发育中的内在的关键机制？什么内在（ intrinsic ）信号导致生成胚胎干细胞的？在JohnGurdon 实验里，起决定性作用的因子，四十年后仍是一个迷。可以推测，卵子的细胞质里，必有重要的 Gene Programming 因子，可以推动 “自然”的机制起功用，实现向多功能胚胎干细胞的转变，进而导致克隆的实现。同此，Yamanaka 的实验之所以成功，也正是因 Oct4，Nanog circuitry 是“自然”的，内在作用于胚胎干细胞发育的关键因子。因此，最关键的问题是揭示内在的分子机制。我们应该设计实验，发现在正常的胚胎干细胞发育中，必需什么分子信号和调节原理，从而导致哺乳动物胚胎发育阶段的 Oct4-Nanog Circuitry 产生。但是，若要在 in vivo （活体）研究哺乳类早期胚胎发育的分子机理，由于细胞数量极少，分离困难，技术难度很大，长期以来阻碍了精细的，分子机制上的研究。思考着这些基本问题，从 2009年起，我重新鼓起了在新加坡进行胚胎发育和干细胞机制研究的梦想。幸运地是，我在新加坡遇上了Barbara Knowles 和 Davor Solter 科学家夫妇， Huck Hui Ng和其他在胚胎发育和干细胞研究专家。Barbara Knowles 和 Davor Solter 低调实干，是在胚胎发育研究领域里作出了卓越贡献的科学家。值得一提的是， Davor 被公认为 genome imprinting 的最早发现者之一。当我的学生Vinh 表示要学习早期胚胎操作技巧，Davor手把手的亲自示范。并和我们共同开组会，帮助我们设计和解析实验结果。我的实验室当时几乎没有任何有关胚胎干细胞研究的分子试剂。Huck打开他的冰箱，说：只要我有的，你尽可拿去。我们先后从他的实验室获得近百种基因表达质粒，学会如何高效做iPScell的方法，等等，大大省略了我们准备实验的时间。我们可爱的弹唱歌手，小郭同学，帮助我们进行微量细胞的分子表达分析。可贵的科学朋友和同事的支持，历来是我们能够跨领域进行研究的关键。我们的工作就是试图解答“在正常的胚胎干细胞发育中，需要什么内在的，自然的，正常发育中的分子信号和调节机制，来引导胚胎干细胞的形成 ” 。我相信, 只有切实了解胚胎发育中的分子过程，我们才能真正理解Yamanaka和 Gurdon实验里隐藏的分子机制。在过去的数年里，Vinh 同学大约分析了成百上千的，不同阶段的小鼠胚胎。这些实验使用了五种不同的小鼠基因敲除（mouse knockout）的品系，最终用遗传学和分子生物学的方法，清晰的证明了STAT3决定性的调控 Oct4-Nanog Circuitry，从而控制胚胎干细胞的生成。有关论文已于最近发表 1 。 (see： http://genesdev.cshlp.org/content/27/12/1378?top=1）。这次是值得庆幸的。我和朋友之间的通信里说到，这篇论文含有深深的“personal feeling”。用个人的二十年的跨度来证明一个科学的假想，这不是很有意义和值得记忆的么？这不是体现了做科学的无比乐趣么？如前所述，科学无止境。我们当前新的迫切问题是： STAT 讯号是如何控制胚胎发育中的表观遗传的机理。在新的实验里，不知幸运之神是否会再次降临。不论如何，我是有信心的：这次绝不会再需20年。文献： 1 Do, D. V. et al. Agenetic and developmentalpathway from STAT3 to the OCT4-NANOG circuit is essential for maintenance ofICM lineages in vivo. Genes development27,1378-1390,doi:10.1101/gad.221176.113 (2013). 2 Darnell, J.E., Jr.,Kerr, I. M. Stark, G. R. Jak-STAT pathways and transcriptional activationin response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science264,1415-1421 (1994). 3 Zhong, Z.,Wen, Z. Darnell, J. E., Jr. Stat3: a STAT family member activated by tyrosine-phosphorylation in response to epidermal growth factor andinterleukin-6.Science264, 95-98 (1994). 4 Fu, X. Y.,Schindler,C., Improta, T., Aebersold, R. Darnell, J. E., Jr. Theproteins of ISGF-3,the interferon alpha－induced transcriptional activator,define a gene familyinvolved in signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A89,7840-7843 (1992). 5 Velazquez, L.,Fellous,M., Stark, G. R. Pellegrini, S. A protein tyrosine kinase intheinterferon α/β signaling pathway. Cell70, 313-322 (1992). 6 Fu, X. Y.Atranscription factor with SH2 and SH3 domains is directly activated byaninterferon alpha-induced cytoplasmic protein tyrosine kinase(s). Cell70,323-335 (1992). 7 O'Shea, J. J.,Gadina,M. Schreiber, R. D. Cytokine signaling in 2002: new surprises intheJak/Stat pathway. Cell109, S121-131 (2002). 8 Takeda, K. et al.Targeted disruption of the mouseStat3 gene leads to early embryonic lethality.Proc Natl Acad Sci U S A94,3801-3804 (1997). 9 Takahashi, K.Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic andadultfibroblast cultures by defined factors. Cell126,663-676,doi:10.1016/j.cell.2006.07.024 (2006). 10 Gurdon, J. B.Uehlinger, V. Fertile intestine nuclei. Nature210, 1240-1241(1966).; 14983 次阅读|24 个评论

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