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父亲尼古丁暴露导致后代多动的分子机制: 热度 3 zdqiao 2017-8-14 17:25; 父亲尼古丁暴露导致后代多动的分子机制 Paternal nicotine exposure defines different behavior in subsequent generation via hyper-methylation of mmu-miR-15b： Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7286. doi: 10.1038/s41598-017-07920-3. 吸烟有害健康，但是父亲吸烟对后代影响的研究却报道较少。大多数的研究主要关注于母亲孕期吸烟对后代精神健康的影响，只有很少的流行病学调查发现，男性吸烟可能使子代 “ 注意力缺陷过动症（ ADHD ） ” 的罹患率有所上升。其他有关父亲吸烟会影响到下一代的报道包括，如 1997 年香港社会转型时期在香港出生的婴儿为样本展开的调查，显示父亲吸烟和后代的肥胖率呈正相关；父亲吸烟可能会导致女儿的月经周期短于对照组等，但这些研究结果目前还没有得到很好的证实与重复，因为在人群中的研究很难排除吸烟者的女性伴侣被动吸烟这一干扰因素。我们实验室长期从事有关吸烟对男性生殖影响的研究，特别关注父亲吸烟通过精子影响后代的分子生物学机制研究。本利用动物吸烟模型 / 尼古丁处理，观察了雄性吸烟对后代行为学的影响及其分子机制。我们的研究结果表明：吸烟或尼古丁造成的小鼠精子发生过程的异常可能通过一些分子机制传递到下一代并影响其生长发育过程。动物行为学的研究发现：吸烟及尼古丁均可引起的父系跨世代神经精神病学效应。吸烟及尼古丁处理雄性小鼠可以自身发生抑郁，但却使其后代（ F1 ）的抑郁程度显著降低，活动性增加。这种父系尼古丁处理引发的动物行为学表型并没有随着父系链传递到 F2 代小鼠。有研究表明，小鼠脑伏核中的 Wnt4 通路与抑郁症的形成之间存在着关联。通过二代测序，我们发现在尼古丁处理小鼠的精子中 Wnt4 通路相关的关键基因表达都发生了明显变化，其中 Wnt4 mRNA 的表达水平明显上调，这提示了尼古丁可能通过影响父系 Wnt4 信号通路，进而影响到子代的精神状态。我们后续的研究还显示，小鼠吸烟 / 尼古丁处理，可引发 F1 代小鼠脑组织中 Wnt4 通路的活化，从而促进下游的关键蛋白分子 GSK-3 从非磷酸化向磷酸化状态转变。非磷酸化的 GSK-3 分子具有神经毒性，而尼古丁处理缓解了这种毒性作用，从而改变了 F1 代小鼠的行为学表型。究其原因，我们发现调控 Wnt4 表达水平的 microRNA ，在尼古丁处理的 F0 代小鼠睾丸、精子及其 F1 代小鼠脑组织中均低表达，这可能是导致 Wnt4 通路激活的原因。对 mmu-miR-15b 基因的生物信息学分析发现，其表达可能受到启动子区域之前的 CpG 岛滩（ CpG shore ）的甲基化水平调控。因而，利用表观遗传学的研究手段，现有实验结果提示尼古丁处理导致了 F0 代小鼠睾丸中 mmu-miR-15b 基因启动子 DNA 区域的高甲基化，且这种表观遗传学修饰可能传递到了下一代，并在 F1 代脑组织中造成 mmu-miR-15b 的低表达，最终产生了多动的表型。当将过表达 WNT4 或 mmu-miR-15b 的慢病毒质粒在小鼠特定脑区中注射后的动物行为学表型实验，均证明了 Wnt4 的上调确实可以诱发小鼠活动性增加，抑郁程度减轻。而在父系尼古丁处理的 F1 代小鼠丘脑中过表达 mmu-miR-15b 则能逆转其行为学表型，这显示了尼古丁引发的动物行为学表型处理确实是通过 mmu-miR-15b 实现了父系跨世代的遗传。我们利用开放场、高架十字、新事物认知、社交实验、强迫游泳及糖水偏好等多种动物行为学实验观察了吸烟小鼠（ F0-smo ）和对照组小鼠（ F0-nos ），以及吸烟小鼠后代 (F1-smo 和 F1-nos 组 ) 的行为学差异。图 1 香烟烟雾处理的 F0 及 F1 代小鼠动物行为学实验结果 a ） F0 代小鼠强迫游泳实验结果， b ） F0 代小鼠糖水偏好实验结果， c ） F0 代小鼠高架十字实验结果， d ） F0 代小鼠新事物认知实验结果， e ） F0 代小鼠社交实验结果， f-j ） F0 代小鼠开放场实验结果， k ） F1 代小鼠强迫游泳实验结果， l ） F1 代小鼠糖水偏好实验结果， m ） F1 代小鼠高架十字实验结果， n ） F1 代小鼠新事物认知实验结果， o ） F1 代小鼠社交实验结果， p-t ） F1 代小鼠开放场实验结果。图 2 尼古丁处理的 F0 及 F1 代小鼠的动物行为学实验结果 a ） F0 代小鼠强迫游泳实验结果， b ） F0 代小鼠糖水偏好实验结果， c ） F0 代小鼠高架十字实验结果， d ） F0 代小鼠新事物认知实验结果， e ） F0 代小鼠社交实验结果， f-j ） F0 代小鼠开放场实验结果， k ） F1 代小鼠强迫游泳实验结果， l ） F1 代小鼠糖水偏好实验结果， m ） F1 代小鼠高架十字实验结果， n ） F1 代小鼠新事物认知实验结果， o ） F1 代小鼠社交实验结果， p-t ） F1 代小鼠开放场实验结果。我们通过二代测序的技术获得了尼古丁处理及对照组小鼠精子中的基因转录谱信息。通过聚类分析，发现 WNT4 信号通路在小鼠精子中的 mRNA 表达上调。随后的结果显示，在 F0 代小鼠的脑组织中， WNT4 和 DVL2 的表达水平均未发生明显变化，这表明尼古丁处理并未直接激活小鼠脑组织中的 Wnt4 通路。而在 F0 代小鼠的睾丸组织中 WNT4 及 DVL2 在父系尼古丁处理组的表达水平均显著上升。这一表达量的变化和 F1 代脑组织中的趋势相吻合。图 3 尼古丁处理及对照组小鼠精子的转录谱分析 a ）尼古丁处理小鼠精子中与神经系统功能相关的差异表达基因热图， b ）经典的 Wnt 通路示意图， c ） Wnt4 通路主要基因在尼古丁处理小鼠精子中表达水平的热图， d ）父系尼古丁处理的 F1 代小鼠脑组织中各种 Wnt 家族蛋白表达水平的 Western blot 分析， e ） Wnt 家族蛋白表达水平的定量统计结果。图 4 F0 代小鼠脑组织及睾丸组织和 F1 代小鼠脑组织中 WNT4 及 DVL2 的表达水平检测 a ）尼古丁处理的 F0 及 F1 代小鼠脑组织及睾丸组织中 WNT4 及 DVL2 表达水平的 Western blot 分析， b ） WNT4 表达水平的定量统计结果， c ） DVL2 表达水平的定量统计结果。 d ）父系尼古丁处理 F1 代小鼠脑组织中 Wnt4 通路主要蛋白的 Western blot 分析， e ） Wnt4 通路主要蛋白表达水平的定量统计结果， f ）父系尼古丁处理 F1 代小鼠脑组织中 WNT4 蛋白的免疫荧光定位分析， g ）父系尼古丁处理 F1 代小鼠脑组织中 DVL2 蛋白的免疫荧光定位分析。图 5 双荧光素酶实验证明 mmu-miR-15b 调控 Wnt4 的表达 a ）小鼠 Wnt4 mRNA 的 3’-UTR 结构示意图， b ）父系尼古丁处理 F1 代小鼠脑组织中 miR-16 家族表达水平的 Realtime PCR 分析， c ）尼古丁处理小鼠精子中 mmu-miR-15b 的表达水平分析， d ）构建的双荧光素酶报告质粒图谱， e ）野生型和突变型双荧光素酶报告质粒的部分差异序列， f ）双荧光素酶报告实验结果， g ）转染 mmu-miR-15b 的 TM3 细胞中 Wnt mRNA 的表达检测， h ）转染 mmu-miR-15b 的 TM3 细胞中 WNT4 蛋白的表达检测。图 6 显示了父系尼古丁处理组及对照组的 F1 代小鼠丘脑组织中及 F0 小鼠精子 mmu-miR-15b 的 CpG 岛滩区域的 DNA 甲基化修饰图谱。这一结果显示了，尼古丁处理提升了小鼠精子中 mmu-miR-15b 的 CpG 岛滩区域的 DNA 甲基化水平，而这种表观遗传学修饰通过精子传递到下一代，并印记到 F1 代小鼠的丘脑。图 6 小鼠 mmu-miR-15b 启动子 CpG 岛滩区域 DNA 甲基化分析 a ） mmu-miR-15b 基因启动子 CpG 岛滩示意图， b ）父系尼古丁处理小鼠脑组织中 mmu-miR-15b 启动子 CpG 岛滩区域 DNA 甲基化图谱， c ）尼古丁处理小鼠精子中 mmu-miR-15b 启动子 CpG 岛滩区域 DNA 甲基化图谱， d-e ） mmu-miR-15b 启动子 CpG 岛滩区域 DNA 甲基化率统计， f-g ）体外 5’-AZA-dC 处理 TM3 细胞验证 mmu-miR-15b 基因受其启动子 CpG 岛滩 DNA 甲基化水平的调控。为了进一步确认 WNT4 及 mmu-miR-15b 对小鼠行为学表型的影响，我们分别构建了过表达 WNT4 及 mmu-miR-15b 的慢病毒质粒，利用小鼠脑定位注射技术向雄性 C57BL/6J 小鼠丘脑组织中注射慢病毒颗粒，分别过表达 WNT4 及 mmumiR-15b 。动物行为学实验结果显示，在小鼠丘脑组织中过表达 WNT4 导致了高自发运动及低抑郁程度的行为学表型，而过表达 mmu-miR-15b 的小鼠则表现出相反的效果。为了进一步验证 F1-nic 小鼠的行为学表型能否被 mmu-miR-15b 的过表达所逆转，我们在经过父系尼古丁暴露的 F1-nic 小鼠丘脑组织中注射慢病毒颗粒以过表达 mmumiR-15b 。并以空白慢病毒质粒注射 F1-nic 小鼠作为对照组（ F1-nic-vehicle ）。随后利用开放场实验及强迫游泳实验来观察 mmu-miR-15b 对 F1-nic 小鼠的行为学表型的影响。结果显示了在 F1-nic 小鼠丘脑中过表达 mmu-miR-15b 可以有效地逆转其从父系尼古丁暴露处理获得的动物行为学表型。这也进一步证明了 mmu-miR-15b 确实是尼古丁对小鼠神经系统的跨代影响效应的分子基础。图 7 脑定位注射过表达 WNT4 及 mmu-miR-15b 的小鼠的动物行为学实验结果 a ）构建的过表达 Wnt4 的慢病毒质粒图谱， b ）小鼠脑组织中过表达 Wnt4 的效率检测， c ）构建的过表达 mmu-miR-15b 的慢病毒质粒图谱， d ）小鼠脑组织中过表达 mmu-miR-15b 的效率检测， e ） TM3 细胞系中过表达 WNT4 及 mmu-miR-15b 后 WNT4 表达水平的检测， f-i ）接受脑定位注射过表达 WNT4 及 mmu-miR-15b 的小鼠的动物行为学实验结果， j-m ）接受脑定位注射过表达 mmu-miR-15b 的 F1 代小鼠的动物行为学实验结果。结论：上述研究结果显示，父亲吸烟 / 尼古丁暴露可导致本身抑郁，而后代多动。决定后代多动的原因是尼古丁增加了精子中 mmu-miR-15b 启动子区 CpG 岛摊中的甲基化，且印迹到了后代小鼠的丘脑，从而激活后代小鼠脑组织中的 Wnt4 信号通路。图 8 、父亲吸烟引发后代多动的示意图感兴趣的同行，可以通过以下链接获得全文： http://www.nature.com/articles/s41598-017-07920-3 Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7286. doi: 10.1038/s41598-017-07920-3. Paternal nicotine exposure defines different behavior in subsequent generation via hyper-methylation of mmu-miR-15b. Dai J 1, 2 , Wang Z 1 , Xu W 1 , Zhang M 1 , Zhu Z 1 , Zhao X 1 , Zhang D 1 , Nie D 1 , Wang L 3 , Qiao Z 4, 5, 6, 7, 8 .; 8607 次阅读|6 个评论

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