蚯蚓生活在泥土里，在地下觅食。在蚯蚓的消化道内合成与分泌一组蚓激酶同工酶(Lumbrokinase isozymes, LKI)。为了适应环境，同时也为了减轻遗传上的压力，LKI的底物选择性相对较宽。这是由于，蚯蚓在地下爬行觅食的时候，随时随地可以遇到不同的细菌、大分子、化合物等等。小小的他，需要应付各种各样的情况。另一方面，蚯蚓这样小的环节动物，不可能在遗传上，储存过量的信息。因此，面对复杂变化的环境，这就需要蚯蚓体内合成的蚓激酶同工酶能够有更宽的底物选择性，以适应各种不同的环境状态。 但是，从酶学的基本规律来看，高度的底物选择性是对酶促反应的需要，否则，就会发生副反应，出现副产物，以至于发生机体物质代谢的失调。我们研究发现，虽然LKI能够与多种底物发生反应，但是，一旦LKI与其中一种底物发生了相互作用，则接下来LKI就倾向于只识别第一个接触的底物（He R. 2015）。这样既解决了LKI 宽泛的 底物选择性问题，也解决了底物特异性的酶促反应。 图1、蚓激酶同工酶（Lumbrokinase isozyme, LKI, Zhou et al. 2018）的底物选择性较宽，能够识别多种底物并发生酶促反应。图中的小蚯蚓代表LKI，女孩代表LKI的底物，而且她们都是天然LKI的反应底物。也就是说，小蚯蚓 LKI可以同其中任何一位女孩相遇而成为舞伴。当然， 这是一场舞会，与谁成为舞伴，就靠随机相遇了。 图2、在舞会上，小蚯蚓(LKI)随机遇到其中一位女孩。在结成了舞伴的那一刻，他就一见钟情了。每一位女孩都有同样的机会，关键是要做小蚯蚓第一个见面的她。 图3、一曲终了，小蚯蚓（LKI）需要选择新的舞伴。然而，他却记住了第一位舞伴。于是，他又选择了第一个她。 图4、小蚯蚓（LKI）记住了第一个她，始终跟她跳舞。虽然其他姑娘也是小蚯蚓选择的舞伴，但此时此刻，他已经把几位女孩忘得一干二净了。蚓激酶同工酶的这种类似“记忆”的能力，保证了LKI对其底物的选择性（Wang et al. 2019）。 蚓激酶同工酶LKI是一个典型的“花花公子”，善于跟多个女孩结为舞伴。然而，LKI一旦跟某一位女孩认识结为舞伴，则LKI就跟她死活到底了。LKI的这种性质，是否是蛋白质特有的“记忆”能力，需要进一步证实。 1. R. He, Enzyme with a memory for its substrate? Sci. China Life Sci. 58 (2015)403–404, https://doi.org/10.1007/s11427-015-4832-5 . 2. Xiu-Mei Wang, Shi-Chao Fan, Yao Chen, Xiao-Feng Ma, Rong-Qiao He (2019). Earthworm protease in anti-thrombosis and anti-fibrosis. BBA - General Subjects 1863:379–383. 3. Yuan Zhou , Xiumei Wang , Shichao Fan , Rongqiao He . (2018) A lumbrokinase isozyme targets hepatitis B e-antigen . Sci China Life Sci 61, https://doi.org/10.1007/s11427-018-9441-9 感谢国自然基金的资助(31470036) 【注释】 1、小蚯蚓代表的是蚓激酶同工酶（LKI），而不是蚯蚓。 2、不同女孩，代表蚓激酶同工酶的不同反应底物。
新的想法，特别是在一个新的领域里的新想法，未必有人引用。倒是在成熟领域的改进可能当时影响的人更多。开博后写了这些篇博文，唯一的精选博文竟是非常技术的一篇。而且不知道为什么好像点击比其他更有创意，影响更大的博文还高，到现在居然有四千多。真的是博文领域比较大的原因还是因为博文精选导致的误打误撞比较多，也看不清楚。倒是让我觉得科学网不只是玩标题党，也有些关心技术的人。哪怕只有点击数的1%的人真正在用这个方法，也有四十多个实验室了。既然是个不错的宣传方法，就继续宣传。还是应该给博主一个自己把博文排序的功能。 今天再说说我们做的找泛素连接酶底物的两个方法吧。 总结以前的方法太费时间了，也有综述，估计看了这个题目还准备点开看正文的人也都知道了。还是直入正题吧。 第一个方法是把活的表达了蛋白在表面的噬菌体文库直接扔到泛素化反应的体系中去。这时泛素化体系中的连接酶特异性地泛素化了文库中的几个噬菌体表面的蛋白。然后我们再把表面有泛素化蛋白的噬菌体富集起来，感染细菌，制备噬菌体，把噬菌体所带的插入基因测序就知道被这个连接酶泛素化的蛋白是什么了。这个实验还是需要一点前提条件的。就是这个连接酶除了表面表达的蛋白外不能泛素化噬菌体的其他蛋白。这个可以在放入噬菌体文库的实验前，先放入没有表面呈现蛋白的空噬菌体试一试。背景足够低就可以了。还有一个条件是噬菌体能够在泛素化的反应体系中保持活力和繁殖力。泛素化的体系不是特别难适应，噬菌体看样子没有问题能熬过那一段37度的时光，估计绝大部分噬菌体在表面蛋白又加上泛素后都还保持着繁殖力。整个策略如果加上一步负选择可以提前去掉文库中能够产生假阳性的克隆，后续验证效率更高。这个方法优点是比较简单快速高通量。整个过程见示意图。文章的链接在这里： http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0076622#pone-0076622-g004 Screening E3 substrates using a live phage display library.pdf 第二个方法是如果连接酶有其他的蛋白结合结构域，可以先通过这结构域找连接酶的结合蛋白，然后再试试这个结合蛋白是不是底物。当然如果只结合而不是底物，那可能就是一个站着茅坑不拉屎的泛素化调解物，它拦住了其他底物被泛素的路。泛素化的调解物用其他的方法好像还很难找到。我没印象哪个方法可以高通量筛选泛素化的调节蛋白，如果查证真没有，其实以后可以专门开发一个。我们试的是一个有PDZ结构域的连接酶。先通过PDZ的结合特性找到可能结合的蛋白，然后表达出来试试是不是底物。因为丰度不高的底物不是和其他丰度高的底物在一起筛，这个方法可以找到量比较少的底物。验证起来一个一个克隆表达比较麻烦。我们就做了一个统一的可泛素化的Degron连上我们筛出来的识别位点做底物，初步做体外验证。这样效率高一些。进一步的验证实验再用整蛋白做，那时是底物的可能性已经增大了，复杂的实验可能也值得做了。 http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/pr300674c A Proteomics Strategy to Identify Substrates of LNX, a PDZ Domain-Containing E3 .pdf 欢迎大家批评指正多提宝贵意见！ 2014-5-4应读者要求贴上原文。
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