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《Nature》: CRISPR技术将与免疫治疗擦出怎样的火花?
SciLondon 2017-2-28 12:23
近日,美国Memorial Sloan Kettering Cancer Center的研究人员利用CRISPR/Cas9技术定点构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor CAR)T细胞(CAR-T细胞),从而增强小鼠体内的肿瘤抑制效应。这一发现揭示了CART免疫疗法中调控CAR表达的重要性,展示了利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术推动肿瘤免疫疗法的潜力。 在急性粒性白血病小鼠模型NALM-6中,研究人员构建了靶向TRAC基因第一外显子的guide RNA (gRNA)和包含CD19-1928z CAR的AAV载体 (Fig 1),与Cas9 mRNA共同导入T细胞后,成功构建了TRAC-CART。 这项新策略的要点为2-in-1,即同时进行T-cell receptor (TCR) 敲除和CART敲入(Fig 2)。这也是 首个定点于TRAC、利用TRAC自身启动子进行转录的CAR-T,在小鼠整体实验中表现了出乎意料的抗肿瘤特性,显著延长了小鼠的生存期 (Fig 3) 。 Fig1 基于CRISPR/Cas9技术,将AAV中包含的目的序列整合入TRAC基因组中,受TRAC内源启动子调控,并阻断TRAC转录翻译成TCR蛋白。 Fig2 在CAR表达的T细胞中,TCR水平被降低。 Fig3 TRAC-CART在小鼠整体实验中表现了出乎意料的抗肿瘤特性,显著延长了小鼠的生存期。肿瘤细胞为GFP+CD19+细胞。 进一步研究表明,与逆转录病毒过表达CAR的T细胞(RV-CART)相比,TRAC-CART能够持续更长的时间地杀死肿瘤细胞,这是因为它们延迟分化,也更不容易耗竭 。 一旦接触抗原,RV-CART会在5天内激活和分化(Fig4),CD3ζ ITAM被大量磷酸化,下游信号转导系统持续激活(Fig5);与之不同的是,TRAC-CART仍保持未转化状态,CAR的表达维持在基础水平,表现出极强的肿瘤抗性(Fig6)。 并且,传统的CART在构建17天后,超过50%的T细胞会大量表达PD-A,LAG3和TIM3,对T细胞的肿瘤免疫进行“调停”,而只有少于2%的TRAC-CART表现出这一性状 (Fig7)。 Fig4 RV-CART在接触抗原后快速分化,形成效应T细胞,而RTAC-CART更接近与未分化状态。其中CD25和CD69表达水平代表了T细胞的激活,CD62L代表T细胞分化为记忆T细胞。PD-A,LAG3和TIM3表达水平与T细胞杀伤肿瘤能力呈负相关。 Fig5 RV-CART中CART高表达,CD3ζ ITAM大量磷酸化,而RTAC-CART维持CART表达在基础水平,且对CD3ζ ITAM磷酸化没有影响,不增强下游信号转导途径。 Fig6 反复接触抗原后,RV-CART分化和激活明显加快,转录因子T-bet,EOMES和GATA-3的表达水平显著升高,细胞因子IFNg,TNFα和IL2分泌增加,而TRAC-CART仍在较长时间内维持未分化状态。CD45RA与CD62L表达水平与T细胞分化程度相关。 Fig7 TRAC-CART中免疫调节因子PD-1,LAG3和TIM3的表达量显著低于RV-CART,表明TRAC-CART能够更长时间地杀灭肿瘤细胞。 改变RV-CAR转染T细胞的剂量,使RV-CART中CAR的表达水平与TRAC-CART一致,前者仍明显加快T细胞激活和分化(Fig8),揭示了动态调控CAR表达水平在T细胞抗肿瘤作用中的重要性。 研究者们构建了定向于基因组不同位点或利用不同启动子的CART(Fig9),与TRAC-CART作用模式进行比较,发现只有TRAC-CART具有分化晚,消亡迟(Fig10),CAR表达水平低(Fig11)三个特性,且只有TRAC-CART具有强效肿瘤免疫效应(Fig12)。 Fig8 在较低水平RV-1828Z转导的T细胞中,细胞激活和分化仍比TRAC-CART快。 Fig9 研究者们构建不同CART的策略,包括定位于基因组其他位点,使用内源性或外源性启动子等。 Fig10 相较于其他构建的CART,TRAC-CART具有分化晚,消亡迟的特性。 Fig11 TRAC-CART的CAR表达维持在基础水平。 Fig12 只有TRAC-CART变现出显著的肿瘤抗性。 T细胞接触抗原后,细胞表面的CAR內吞,随后在细胞内被降解(Fig13),表明为达到对肿瘤细胞的长效免疫,CAR的mRNA表达量和从CAR mRNA重新合成蛋白的过程需要精确调控。研究者发现只有TRAC-CART在未接触抗原时维持CAR基础水平表达(Fig14),且反复接触抗原后CAR表达水平仍保持稳定(Fig15),揭示了启动子强度和转录水平的精确调控是调节CAR表达的重要环节 ,在构建高效CART中至关重要。 Fig13 T细胞接触抗原后,细胞表面标记GFP的CAR內吞,随后被降解。LNGFR为AAV载体上的一个独立标记,LNGFR高表达显示转录水平无抑制。 Fig14 TRAC-CART在未接触抗原时维持CAR基础水平表达 Fig15 TRAC-CART接触抗原后CAR表达水平仍保持稳定。(B2M-CART接触抗原后CAR表达水平也维持稳定,推测可能是其基础水平CAR过低,不足以产生强大的肿瘤杀伤作用) 论文通信作者、斯隆凯特林癌症纪念中心基因转移与基因表达实验室科学家Michel Sadelain博士说, “癌细胞总是无休止地试图躲避治疗,因此我们需要能制造出够与它们相匹配的并且比它们活得更长的CAR-T细胞。这一新的发现证实我们可能能够利用基因组编辑的力量内在地改进这些‘活细胞疗法’。我们迫切地持续探究基因组编辑技术如何可能给我们提供下一代CAR-T细胞疗法。 ” Sadelain博士和他的团队旨在在临床试验中探究这些利用CRISPR/Cas9构建出的CAR-T细胞的安全性和疗效。 定位于TRAC的CART构建策略可能提供更安全、更高效的治疗性T细胞,在临床抗肿瘤试验中拥有巨大潜力。目前很多科学家们利用基因编辑技术来进行人类临床试验, 其中包括肿瘤细胞治疗大牛Carl June进行的一项研究,他们当时利用基因编辑技术来帮助患者抵御HIV ,他同时也是美国CRISPR–Cas9修饰免疫细胞进行癌症治疗的科学委员会顾问。 参考资料: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature21405.html https://www.mskcc.org/press-releases/car-cells-more-powerful-when-built-crispr-msk-researchers-find ( 未止科技 原创,转载请联系我们。原文: CRISPR与免疫治疗 )
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如何在《Nature》杂志上发表文章
icstu1 2009-12-4 12:02
如何在《Nature》杂志上发表文章 《Nature》杂志上发表科学文章的基本要求   报道原始性的科学研究;文章要具有显著重要的科学性;文章要能使广泛的读者群感兴趣;发表的文章对科学家和一般读者具有广泛的强烈影响。 论文取舍的判断   《Nature》杂志每周大约收到170篇文章,只能发表其中的10%左右,可见其选择标准非常严格。由编辑而不是评议人来判断哪篇文章会引起读者群的兴趣。原因之一是每个评议人只看很少一部分文章,而编辑却会看到所有的文章,因此其视野更为宽广。   《Nature》杂志不聘用海外资深科学家,也不附属任何特殊科学团体或机构,以避免编辑部某些成员因科学或民族偏见而在决定上受到强烈影响,从而缩短决定时间。   由于刊登哪些文章是由编辑独立进行决定的,因此决定就更为迅速,学科分布更公平。 文章能否发表的决定因素   打算向《Nature》杂志投稿的作者,必须首先查阅《Nature》杂志为作者提供的指南。其指南从网址 www.nature.com 上很容易看到。这种指南将保证文章的水平、长度和版式符合《Nature》杂志的要求,并且可以减少处理文章的时间。投寄文章需一式5份。   1.首次投寄的文章。编辑部成员判断该论文能否引起广泛的兴趣从而决定是否送交同行评议。这方面的判断由所涉及的对口学科的编辑作出。但是也会非正式地向科学家咨询并与若干编辑一起讨论,以保证具有相同的评价标准。   文章的作者将文章以及这篇文章为什么投到《Nature》杂志而不是投到该领域的其他优秀专业期刊上发表的简要说明一起寄来,帮助编辑进行判断。   送交同行进行评议的基本原则是文章的结果是否具有创新性和吸引力,并且所做的工作应该在这个领域之外也具有重要影响。   2.经过初步评选后的文章可以送给评议人。在选择评议人时,编辑通常是知道哪些人可以处理这个题目,哪些人可以处理这个领域中的其他文章。大多数文章要送给2-3位评议人,考虑选择某些领域评议人的依据是:   评议人在技术上是否可以保证全面和公正;能否考虑到相关论文;最近是否评议过这方面的其他文章;评议人在规定的时间内是否能够完成评议。 评议报告 评议报告包括:   哪些人对这种新的结果感兴趣,为什么?为作者立论得以确定前必须谈到的任何技术上的缺陷。   《Nature》杂志的编辑可以判断专业以外的读者是否会对某篇文章感兴趣,评议人也会经常提出一些很有帮助的意见。例如,这篇文章并不象编辑所描述的那么重要或者其重要性被作者自己低估了。   杂志的编辑认为评议人对文章中的任何技术上的缺陷的描述都是非常重要的,但是这篇文章是否被录用并不完全取决于评议人的看法。   《Nature》杂志的编辑要求评议人在不丢掉任何重要信息的情况下,将评议意见压缩为一封信。 竞争者   编辑在选择评议人时,考虑让作者的同行去评议会影响他们的观点。为了避免此类利益冲突,《Nature》杂志要求评议人在从事评议前公开他们的任何冲突或商业利益,并且要求评议人不得复印或在未被聘请为评议人的同事中传阅。《Nature》杂志欢迎作者提出恰当的评议人,但是编辑并不一定使用这些人。《Nature》杂志尊重作者提出的文章不被送到一个或两个竞争小组去评议的要求。 评审速度   《Nature》杂志尽可能快地对收到的文章作出决定。评议后的文章如果不被录用,作者一周之内就可以得到通知。   《Nature》杂志会尽快提供评议报告。大多数评议人能遵守与《Nature》杂志的协议,在7天或规定的时间内提交报告。大多数评议人是通过E-mail送交报告的。如果他们不能在规定时间内提交报告就会被电话、电传或E-mail催促。 特别重要的文章   当然每个作者都认为他(她)的文章是重要的。特别是在竞争激烈的领域,并且有权利要求尽快进行处理。   《Nature》杂志对所收到的全部稿件都力争提供这种服务。对于特殊案例,如果编辑认为投来的文章所作的工作是非常重要的,会请评议人给予特殊的考虑。一般情况下,这类文章将在2周内刊登。 决定   一旦收到有关某篇文章的所有评议报告,编辑就会着手写一篇文章综述以及评议意见、推荐书以及关于作者的简介,以便与其他编辑包括生物学和物理学编辑进行内部讨论。所以《Nature》杂志可以保证所有编辑使用的判断标准是一致的。   一旦编辑们统一了意见,将通过Fax和E-mail给作者发函,并将评议意见通知作者。 信函所包涵的内容 《Nature》杂志编辑提供给作者的信函包括几种:   文章不用任何修改就可以刊登,实际上这种情况是非常少见的。   原则上作者只要按照评议意见进行修改,文章就可以刊登。这种情况下,通常修改后的文章不用再送给评议人进行第2次评议,但是编辑必须检查评议意见是否被采纳。   在作者回答评议意见之前,将推迟决定最终是否被录用。修改后的文章应逐一回答评议人所提出的所有问题。   如果评议人认为文章中存在技术问题或作者的论点不能充分成立时,则文章不能被录用。在这种情况下,信函通常要明确说明是否考虑接受作者重新提交的改定稿。   如果编辑邀请作者再次提交文章,作者应保证所有评议人所提出的问题都得到满意的答复(而不是部分)并且重新提交的文章应逐一回答评议人的意见。   文章如没有被录用,作者会被告知不要提交类似的修改稿,如果没有新的观点文章将会被退回。如果作者认为他们的案例有很强的科学性,应该给予重新考虑。(例如,如果评议人没有发现这篇文章的要点)他们可以以书面的形式提出要求。但是,由于《Nature》杂志的版面非常紧张,并且在同一时间有大量的文章要考虑,编辑们不可能给予这种要求太多的优先权。 修改文章   在回答评议人提出的问题时,如果评议人或编辑没有搞清楚你们的观点,作者应避免在语言上冒犯他们,因为文章还要再请他们进行评议。请牢牢记住,如果连评议人都未理解的研究内容一般读者对此也未必清楚。 修改文章和图表时,作者应再次参阅为其提供的指南,并且保证将正确数量的复印件包括在内。 文章的版式与长度   一旦《Nature》杂志的编辑原则上同意刊登某篇文章,他们会详细地检查文章的版式。作者必须严格遵守《Nature》杂志对文章的版式的要求。   大多数情况下,文章长度限制在《Nature》杂志的2个页面。对物理学方面文章正文大约1500个单词和4张图;对于生物学方面文章大约1000个单词和4张图,后者的图往往较大,并有关于方法的一些章节。作者可以按照读者指南给的尺度将图表和正文进行置换以保证总长度不超过2.5页。   《Nature》杂志的编辑有时候会决定让某一篇文章超过或少于2.5页(个别文章超过或少于5页),这些决定通常是经过编辑的仔细考虑和大家共同讨论后作出的决定。当《Nature》杂志要求作者大量压缩文章长度时,编辑将特别建议作者如何进行压缩。许多作者会惊喜地发现,只需针对编辑建议的关键点,便可以很容易将文章压缩。经过修改过的文章更容易读懂并且影响会更广泛。   如果作者没有按照编辑的要求进行压缩,文章将被退回进行修改,这样会延误发表时间。如果文章只需进行少量的压缩,编辑有时会自己动手对文章进行压缩。所以,作者最好按要求的长度撰写文章,以避免其原意在压缩时被曲解。 准备文章   准备最后的修改文章时,作者应该进一步参阅指南,值得强调的是: 介绍文章的所有章节。全部的介绍不得超过180个单词,其中包括作者所作的工作及技术的简介,这些章节的撰写是比较困难的。如果作者有要求,《Nature》杂志的编辑和助理编辑是十分乐意为作者重新撰写介绍文章而提供帮助。   讨论。《Nature》杂志的版面非常有限,不对其他刊物上的各种发现进行扩展讨论。在信函栏目上讨论只能是简介。   参考文献应该包括引证的书和文章的题目。 不超过800个单词的关于方法的段落应放在文章的最后,除非插图的说明少于100个单词,图注不包括方法内容。 另:见附件 Nature投稿指南2007-7
个人分类: E 请教专家看法和学习的访谈|2763 次阅读|2 个评论
Nature和Science哪个影响力更大?一个实证
zhaoxing 2009-4-3 15:01
《 Nature 》和《 Science 》哪个影响力更大? 半个世纪的 h 指数视角浅析 《 Nature 》和《 Science 》可能是现有最具影响力的综合类科技期刊。国人在上面发表论文,很多所在单位也会给予几十万甚至上百万的重奖,可谓名利双收。 但关于《 Nature 》和《 Science 》哪个更好一直存在很大争议。这里以两种期刊在 Web of Science 中 5 年等距抽样 h 指数(含义见注释 1 )数据,粗略探讨过去半个世纪以来,《 Nature 》和《 Science 》的影响力演进实况和相互差别。 统计时段选择 1955 年- 2005 年。未选择更早的数据,是因为 Web of Science 1955 年之前的数据只能按较长时段查询不能按具体年份检索。另外,据笔者所知,此两种期刊在世界范围的权威地位于 20 世纪下半叶才逐渐完全确立。 图 1 是两种期刊的 h 指数演变数据。 图 1 1955 年- 2005 年《 Nature 》和《 Science 》的 h 指数演变及比较 可见, 20 世纪下半叶,《 Nature 》和《 Science 》的 h 指数一直在上升,特别是 1975 年后,两种期刊的影响力扩大很快。两种期刊的 h 指数峰值都在 1995 年,当年两种期刊各有 280 余篇论文至今被引用了不少于 280 余次,论文影响力持续能力较强。新世纪里 h 指数的下降并不能证明两种期刊影响力有所下降,而是 h 指数增长需要时间积累所致。 半个世纪以来,除了 1965 年两种期刊 h 指数相等外,其余统计点上,《 Nature 》的 h 指数都大于《 Science 》,这种差别在 1980 年- 1990 年之间较为明显,但近年来差距似乎有所缩小。 h 指数主要关注产出论文集合的高被引论文及其被引强度 。应指出的是,任一单一指标的测度总有片面性,本博文数据仅供参考。 注释: 1. h 指数由美国物理学家 Hirsch 于 2005 年提出,以简单的计算同时衡量学者个人论文成果的数量和质量(影响力) 。 Braun 将其扩展到对期刊的 影响力测评 。 期刊 h 指数的定义为:某一时段内,期刊发表的总计 N 篇论文中,有 h 篇论文的被引次数至少为 h 次,且其余 N-h 篇论文的被引次数均小于或等于 h 。期刊 h 指数是目前除学者 h 指数之外,研究和应用最多的 h 指数扩展。 参考文献: 赵星 , 高小强 , 何培 . 科学基金 h 指数 : 基金论文成果数量与影响力的综合衡量 . 中国科学基金 ,2009,1: 15-19 Hirsch J E. An index to quantify an individuals scientific research output. PNAS,2005,102(46): 16569 16572 Ball P.Index aims for fair ranking of scientists.Nature,2005,436(7053): 900 Egghe L, Rousseau R.An informetric model for the Hirsch index. Scientometrics,2006,69(1): 121129 Braun T et al.A Hirsch-type index for journals.Scientometrics,2006,69(1),169-173.
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