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SARS-CoV-2的S蛋白抗体鸡尾酒可防止单独抗体出现的快速突变逃逸: IPBCS 2020-7-22 16:07; SARS-CoV-2 的S蛋白抗体鸡尾酒可防止单独抗体出现的快速突变逃逸本文为读后感，原文见文后，读后感作者张楚对抗 COVID19 大流行的一个有希望的方法是开发针对 SARS-CoV-2 S 蛋白的抗病毒抗体。通过与 ACE2 受体结合， S 蛋白是病毒附着和进入靶细胞所需的病毒感染性的关键介质。任何抗病毒治疗的一个重要问题是由于病毒病原体的快速突变而获得抗药性的可能性。当在药物治疗环境中施加选择性压力时，这种耐药性变得更加明显。例如，当艾滋病药物最初单独使用时，这种药物选择的突变导致了广泛的耐药性。随后的HIV联合疗法的成功表明，要求病毒在多个基因位置同时变异可能是避免耐药性的最有效方法。作者利用基因人源化的小鼠和恢复期人类的B细胞产生大量的针对 SARS-CoV-2 S 蛋白 RBD 的高度有效的完全人类中和抗体。生成这个大的集合的预期目标是选择能够同时结合 RBD 的高效个体抗体对，这可能是治疗性抗体鸡尾酒疗法的理想抗体对，这种鸡尾酒疗法不仅可以作为一种有效的治疗方法，而且可以防止由于病毒逃逸突变而产生的抗体耐药性。为了评估抗病毒抗体对截至 2020 年 3 月底鉴定的公开可获得的 SARS-CoV-2 序列中所代表的广泛的 S 蛋白 RBD 变体的有效性，我们使用了表达 SARS-CoV-2 的 S 蛋白突变体 VSV 伪粒子系统。作者的前八大中和抗体保持了它们对所有测试突变体的效力(表1)。接下来，通过使用复制的 VSV-SARS-CoV-2-S 病毒，在单个抗体和抗体组合的压力下选择逃逸突变体( 图1A ) 。在第一代中为四种单个抗体中的每一种快速鉴定了多个独立的逃逸突变体( 图1，B和C，以及图2 ) 。通过第二代，这些突变体中的一些很容易固定在群体中，代表了100%的测序读数，并且对高达50ug/ml的抗体浓度(比针对亲本病毒的IC50高出约10,000-100,000浓度)具有抵抗力。逃逸突变体的测序(图2)显示，单个氨基酸的变化甚至可以消除与针对所有已知RBD变体的抗体的结合(表1)，并且在低PM IC50(3)下中和亲本病毒。表1：抗 sars - cov-2 S 蛋白单克隆抗体在 SARS-CoV-2 spike RBD 突变体中表现出广泛的中和作用。对22,872个公开可用的独特基因组序列(截至2020年5月底)的分析表明，存在与研究中确定的两个逃逸氨基酸残基相似的多态性。因此，尽管在自然界中并没有广泛观察到对单个抗病毒抗体有抵抗力的自然变异，但这些罕见的逃逸变异很容易在正在进行的抗体治疗的压力下被选择和扩增。虽然这些研究是在体外用替代病毒进行的，但人们预计，在单一抗体治疗的选择性压力下，SARS-CoV-2病毒在体内也可能发生类似的逃逸突变。虽然VSV和SARS-CoV-2病毒获得突变的不同倾向可能会影响这些逃逸突变的出现速度，但最终逃逸的可能性仍然很高。接下来，作者评估了之前描述的抗体鸡尾酒(REGN10987+REGN10933)治疗后的逃逸，合理设计以避免通过包含两种抗体来避免逃逸，这两种抗体结合了RBD的不同和不重叠的区域，因此可以同时结合和阻断RBD功能。在这种抗体鸡尾酒存在下培养VSV-SARS-CoV-2-S病毒的尝试没有导致逃逸突变体的生长(表2，图1，B和C，以及图2)。因此，这种选定的鸡尾酒没有快速选择突变体，可能是因为逃逸需要在两个不同的遗传位点同时发生病毒突变，从而消除鸡尾酒中两种抗体的结合和中和。除了上述鸡尾酒外，我们还评估了用其他组合(REGN10989+REGN10934和REGN10989+REGN10987)治疗后的逃逸，这一次包括完全或部分竞争与RBD结合的抗体-即两种与RBD重叠区域结合的抗体。在这些组合处理的选择压力下，对一种组合有抗性的逃逸突变体迅速产生，但对另一种没有抗性(表2，图1，B和C，以及图2)。对于各组分表现出完全竞争的抗体鸡尾酒(REGN10989+REGN10934)，单个氨基酸取代就足以消除鸡尾酒的中和作用，表明这两种抗体都需要与E484残基结合才能中和SARS-CoV-2。有趣的是，在另一种仅表现出部分竞争的抗体鸡尾酒(REGN10989+REGN10987)中，没有发生这种快速逃逸；当REGN10989预先结合时，REGN10987可以弱结合RBD。因此，即使没有被选择同时结合的抗体组合也可能偶尔抵抗逃逸，因为它们的表位仅部分重叠，或者因为导致逃逸的残基不容易被病毒耐受，因此不容易被选择用于。为了从功能上证实测序检测到的刺突蛋白突变是导致抗体失去SARS-CoV-2中和作用的原因，作者产生了表达单个已鉴定的刺突突变的VSV-SARS-CoV-2 S蛋白伪粒子。将这些假颗粒用于单一抗体处理和联合抗体处理的中和试验，并计算IC50值(表2和图2)。正如预期的那样，通过在四种单一抗体以及REGN10989+REGN10934竞争抗体鸡尾酒存在的情况下传代病毒而选择的具有氨基酸突变的伪颗粒，足以在这些检测中完全消除或极大地降低这些处理的中和能力。在由两种抗体(例如，由REGN10934和REGN10987两者产生的K444Q)产生的病毒群体中，在早期传代中低频率检测到但在后期仅由其中一种抗体(REGN10987)固定的单一逃逸突变体，能够消除两种处理的中和作用。这表明抗体可以推动病毒向不同方向进化和逃逸。然而，如果两个抗体有部分重叠的结合表位，那么一个固定在病毒群体中的逃逸突变体可能会导致另一个抗体活性的丧失-这突显了广泛使用单一抗体治疗的风险。重要的是，REN10987+REGN10933抗体鸡尾酒-由两种抗体组成，可以同时与RBD上的两个独立表位结合-保持了其中和所有已识别的突变体的能力，即使是那些通过用其一种成分单一处理而选择的突变体也是如此。在对传代病毒库的测序中，发现了RBD结构域以外的多个突变，其中大多数在对照样本中以不同的丰度存在，包括最初的接种量和仅限病毒的传代(图2)。其中最丰富的突变(H655Y和R682Q)位于S蛋白的S1‘/S2’裂解位点附近，并在多碱基呋喃类裂解位点内含有残基。该区域的突变和缺失已经在组织培养传代的VSVSARS-CoV-2-S和SARS-CoV-2病毒中被鉴定，并可能代表组织培养适应众所周知，RNA病毒会随着时间的推移积累突变，任何抗病毒治疗的一个重要问题是选择治疗诱导的逃逸突变体的可能性。一种防止逃逸到抗体疗法的常用策略包括选择与保守表位结合的抗体，然而这一策略可能还不够。虽然基于序列和结构分析可以对表位的保守性进行一些知情的分析，但在强大的选择压力下仍然存在逃逸的可能性。在多种冠状病毒中表现出广泛中和的抗体，因此可能针对更保守的残基的抗体，尚未被证明对选择性压力下的逃逸具有免疫力。此外，它们的中和效力比针对SARS-CoV-2的最有效的中和抗体低几个数量级。中和被认为是抗冠状病毒S蛋白抗体的关键作用机制，以前在动物模型中已被证明与疗效相关，因此可能被证明是最初临床疗效的最重要驱动因素。然而，正如我们的单抗逃逸研究所证明的那样，即使是高度有效的中和也不能防止病毒逃逸突变体的快速产生，而逃逸仍然是单个抗体方法的主要关注点。这里描述的数据强烈支持这样的观点，即鸡尾酒疗法可能提供一种有效的方式来最大限度地减少SARS-CoV-2的突变逃逸；特别是，我们的研究指出了抗体鸡尾酒的潜在价值，在这种情况下，选择两种抗体以结合病毒靶标的不同和不重叠的区域(在这种情况下，是刺突蛋白的RBD)，因此需要不太可能在两个不同的遗传位点同时发生突变才能使病毒逃逸。一个广泛效力的临床候选选择标准，包括针对自然循环序列变体的功能评估，以及包括具有非重叠表位的多个抗体，可能会提供增强的保护，防止有效性丧失。未来的活体动物和人类临床研究需要密切关注可能出现的逃逸突变和随后可能的药物疗效丧失。来源： https://www-sciencemag-org.webvpn.cams.cn/cgi/pmidlookup?view=longpmid=32540904; 个人分类: 读后感|2389 次阅读|0 个评论

影响SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2和中和行抗体结合的关键氨基酸相关研究: IPBCS 2020-6-23 21:14; 影响SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2和中和行抗体结合的关键氨基酸相关研究本文为读后感，原文见文后，读后感作者侯鹏姣目前，由新型人类冠状病毒SARS-CoV-2引起的2019年冠状病毒疾病（COVID-19）是全球公共卫生的主要威胁。通过对该病毒的基因测序表明SARS-CoV-2与SARS-CoV相似性很高。因此，前期关于SARS-CoV的大量研究提供的有用信息，可直接用于对抗SARS-CoV-2。但是新型冠状病毒在某些方面（如抗原表位）也具有不同的特征，需要进一步深入研究。该博文介绍的主要内容是近期发表在“ Cellular Molecular Immunology” 的一篇研究论文，该文章揭示了SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在不同的关键抗原表位，这为疫苗和抗体的研发提供了更全面的信息。前期研究表明，SARS-CoV-2使用与SARS-CoV相同的病毒入侵机制，即通过其表面的S蛋白中的RBD结合人类功能受体ACE2（hACE2）从而完成病毒的入侵，这是病毒进入靶胞的关键步骤。通过对两种病毒的序列比对发现，RBD的同源性只有73.5%，而 RBD 的功能基序（RBM）的同源性仅47.8%。尽管两种病毒RBM序列差异显著，但仍可以引起抗体交叉反应，因此其中的机制有待阐明。作者主要通过以下几个方面进行验证。 1. SARS-CoV 和SARS-CoV-2 RBD均通过与hACE2结合以感染细胞研究者分别构建可表达S蛋白的 SARS-CoV 与SARS-CoV-2的假病毒进行细胞感染实验，实验结果显示，相对于对照组，表达ACE2的HEK293T细胞对SARS或SARS-CoV-2病毒更易感。为了进一步探究S蛋白在SARS-CoV与SARS-CoV-2感染入侵种的重要性，作者又设计了合胞体实验进行验证。利用HEK293T细胞分别表达ACE2蛋白与SARS-CoV与SARS-CoV-2的S蛋白，发现两种细胞可融合形成合胞体。除此之外，作者还通过BLI和ELISA实验定量的分析ACE2与S蛋白之间的亲和力，BLI结果表明， SARS-CoV-2-RBD 与hACE2结合的解离常数为5.09nM，而对于SARS -CoV-RBD 为1.46nM。 2. SARS-CoV RBD 和SARS-CoV-2 RBD的独特免疫原性基于两种病毒RBD序列之间的保守性（76%）,作者进一步确定两种病毒的RBD是否引起交叉反应免疫反应，以提供对两种病毒的保护。研究者首先设计体内免疫实验，分别用重组表达的SARS-CoVS和SARS-CoV-2 S蛋白注射到小鼠体内，引起小鼠的体内免疫反应。将小鼠免疫血清分别与两种病毒的RBD进行ELISA实验，结果表明小鼠的免疫血清对同种病毒的RBD具有强的结合能力，但是对另一种病毒RBD的结合能力较低；研究者进一步利用小鼠产生的免疫血清，阻断ACE2和RBD之间的结合，证实了免疫血清对相同病毒具有显著抑制作用，但对另一种病毒交叉保护效率很低。同时，作者结合加病毒中和实验，研究两种病毒之间的交叉免疫保护反应，结果显示，两种病毒之间交叉保护效率很低，表明两种病毒具有不同的免疫原性。 3. 确定影响SARS-CoV和SARS-CoV-2中影响RBD受体结合水平的关键氨基酸高分辨率的晶体结构显示，RBM形成了S蛋白和ACE2相互作用的表面，结合结构生物学信息，作者设计了一系列突变以确定核心氨基酸。其中，9个氨基酸的突变（ SARS-CoV-2 to SARS-CoV ）可以使得SARS-CoV-2 RBD与ACE2之间的亲和力完全丧失；而6种突变可以增强它们之间的亲和力。作者进一步将 SARS-CoV 中的6个氨基酸替换为SARS-CoV-2中的相应氨基酸，亲和力显著降低。作者还进一步分析并确定了SARS-CoV和SARS-CoV-2中 RBD-ACE2 的关键识别位点是不同的,这也解释了为什么两种病毒无法引起交叉免疫保护。 4. 突变实验确定影响病毒中和实验和单克隆抗体结合的核心氨基酸作者分别选取了6种中和性单克隆抗体：5种针对 SARS-CoV （80R, S230, m396, CR3022 和 N-176-15）；1种针对 SARS-CoV-2 （HA001）。利用中和抗体鉴定两种病毒的免疫原性，发现除 CR3022外，其他抗体只能结合一种病毒，假病毒试验也说明两种抗体均无法中和另一种病毒。在此基础上，作者通过对 SARS-CoV-2 和SARS-CoV 设计出一系列突变实验，对影响RBD与中和抗体结合的核心氨基酸进行鉴定。总体而言，以上研究表明SARS-CoV和SARSCoV-2之间存在不同的抗原表位，并对这些关键核心位点进行了确认。这表明有必要开发新的预防性疫苗和抗体药物来特异性控制COVID-19大流行。原文链接： https://www.nature.com/articles/s41423-020-0458-z; 个人分类: 读后感|5059 次阅读|0 个评论

冠状病毒S蛋白与细胞受体的相互作用: 热度 1 IPBCS 2015-9-11 21:19; 冠状病毒S蛋白与细胞受体的相互作用作者：关洪鑫病毒与宿主的进化史就是一部入侵与反入侵的斗争史，病毒想尽一切办法感染宿主细胞，而宿主则尽量阻止病毒入侵和感染，或者将病毒的危害降至最低，实现共存。最近，MERS（中东呼吸综合征）肆虐韩国，人们不禁担心其是否会像SARS一样灾难性的大流行。冠状病毒本身广泛的存在于野生动物中，那么，是什么原因导致它们跨越物种感染人类？这些病毒又为什么能入侵不同的宿主？要回答这些问题，我们不仅需要了解冠状病毒表面刺突蛋白（Spike，S蛋白）本身的结构，还需要清楚它与宿主细胞受体共同构架的类似于“桥梁”的结构（S蛋白-受体复合物）以及它们在病毒入侵过程是如何发挥关键作用。病毒进入宿主细胞，首先必须能够识别宿主细胞，建立一座“桥梁”，联通彼此，进而突破细胞膜屏障进入细胞内部。在冠状病毒感染宿主细胞的过程中，S蛋白特异性识别细胞表面受体并形成复合物是决定病毒入侵的关键性因素。冠状病毒可以分为α、 β 、 γ和 δ 四个属，每个属又可以分成不同的亚型，其中β属可以分为A、B、C和D四个亚型。目前已知的可以感染人类的冠状病毒有六种，分别是：α属的hCoV-229E和hCoV-NL63，β属中A亚型的hCoV-OC43 和 hCoV-HKU1，B亚型的SARS-CoV以及C亚型的MERS-CoV。这些冠状病毒表面S蛋白的整体空间结构类似，但与受体的相互作用却千差万别。S蛋白从结构上可以分为两个功能域：N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD），NTD和CTD都可能结合受体结合。宿主细胞表面受体也有多种类型，包括血管紧张素转移酶（ACE2）；氨基肽酶N（APN）；二肽基肽酶4（DPP4）等蛋白，或者Neu5，9Ac2；Neu5Ac等糖基。无论是哪个冠状病毒的S蛋白，它都需要与相应的受体在空间构象上“契合”，能形成稳定复合物，就像 “钥匙”与“门”的关系一样，从而感染宿主细胞。 S 蛋白和细胞表面受体的识别复杂而多样。如下图1所示：虽然 hCoV-NL63 和SARS-CoV分别属于 α 和β属，但是二者S蛋白的CTD都利用ACE2作为入侵受体。 hCoV-NL63 、 TGEV 和PRCV属于α属，但是TGEV和PRCV以APN作为受体，而 hCoV-NL63 以ACE2为受体。此外，虽然MHV和BCoV同属一个属，且都以NTD作为受体结合区，但是前者识别CEACMA1，后者识别糖基。图1（F. Li / Journal of Virology 89(2015) 1954–1964）不同冠状病毒的S蛋白的结构核心区高度保守，但是其受体结合区的空间构象各有不同，这在一定程度上决定了病毒感染的宿主种类。如图2所示，浅蓝色的部分表示了SARS-CoV、MERS-CoV、 hCoV-NL63 和PRCVCTD的空间构象，其核心结构域（core）均由反相平行的β折叠和起连接作用的α螺旋组成。可以明显看出SARS-CoV（图2A）和MERS-CoV（图2B）的CTD结构核心区极其相似，而在受体识别中发挥关键作用的受体结合模序（receptorbinding motif RBM 红色部分）明显不同，这决定了二者对细胞受体识别的特异性。图2（F. Li / Journal of Virology 89(2015) 1954–1964）此外，对于一些亲缘关系较近的病毒来说，RBM区中个别氨基酸的改变都足以改变对不同宿主感染能力。例如，果子狸cSz02株冠状病毒的RBD区479位氨基酸是K，而引起2003年SARS爆发的hTor02株冠状病毒的479位氨基酸为N。人类受体ACE2的31位K与35位E形成盐键，并构成了一个可以与RBD结合的稳定结合面。然而，cSz02-ACE2的479K可与人类ACE2的31K竞争35E形成盐键，从而破坏了RBD原有结合面。因此，cSz02与人类受体的亲和力较差，感染能力低。病毒在进化过程中，hTor02的479位由K突变成N，从而消除了原来479K对RBD结合面的破坏，大幅提升了RBD与人类受体的结合能力，K479N这一关键突变为冠状病毒实现从果子狸到人的跨中传播提供了可能性。另一方面，人类ACE2的353位为K，它可以在疏水环境中与38D形成盐键，而盐键的形成需要一个甲基基团的协助。hTro02的487位是T，可以提供甲基基团协助盐键形成，cSz02的487位则是S，不能帮助盐键的形成。相对hTro02而言，hcGd03株冠状病毒具有较低的致病性，并且不具备人传人的能力，其原因就在于它的487位是S而非T。因此，S487T突变为冠状病毒从果子狸到人的跨种传播提供了便利，并在决定冠状病毒人传人能力方面起了关键作用。（F. Li / Antiviral Research 100 (2013) 246–254）同样，不同物种的同一种细胞表面受体的高级结构整体保守，但是其病毒结合模序（virus binding motifVBM ）却各有不同。一些个别关键氨基酸差异就导致了与冠状病毒RBM亲和度改变，最终影响了病毒感染的种属特异性。; 个人分类: 病毒入侵机制|11337 次阅读|1 个评论

冠状病毒Spike蛋白简介 - 钱朝晖: IPBCS 2015-6-13 10:23; 冠状病毒 Spike蛋白简介 - 钱朝晖冠状病毒的 S蛋白（spike）组合成一个三聚体，约含有1300个氨基酸，属于第一类膜融合蛋白（Class I viral fusion protein），同类的病毒膜融合蛋白还包括HIV的Env蛋白，流感的HA蛋白，以及埃博拉病毒的Gp蛋白等。 S蛋白决定了病毒的宿主范围和特异性，也是宿主中和抗体的重要作用位点。同时也是疫苗设计的关键靶点。与其它第一类病毒膜融合蛋白类似， S蛋白含有两个亚基（subunit）， S1和S2。S1主要包含有受体结合区（receptorbinding domain， RBD），负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件，包括一个内在的膜融合肽（fusion peptide），两个7肽重复序列（heptad repeat， HR），一个富含芳香族氨基酸的膜临近区域（membrane proximal external region， MPER），以及跨膜区（transmembrane，TM）。S1蛋白可进一步分成两个区域（domain），即N-端区域（N-terminal domain, NTD）和C-端区域（C-terminal domain， CTD），其中NTD的构象与galectin蛋白非常相似。大部分的冠状病毒S蛋白的RBD都位于CTD，例如SARS病毒和中东呼吸道综合症病毒（MiddleEast respiratory syndrome， MERS）等等。只有少部分 b 冠状病毒的 RBD则位于NTD，例如小鼠肝炎病毒（mouse hepatitisvirus, MHV）。另外，牛冠状病毒（bovine coronavirus, BCoV）和人冠状病毒OC43的NTD能结合特异的糖分子（唾液酸等），它们也参与了冠状病毒的入侵过程。同一家族病毒包膜蛋白需要两个不同的区域识别宿主受体，并有效的介导病毒与细胞的膜融合过程。这是冠状病毒S蛋白跟其它一类病毒膜融合蛋白的一个重要区别之一。目前，已经发现的冠状病毒受体主要包括以下几种：氨基肽酶N（animopeptidaseN， APN），血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme II， ACE2），二肽基肽酶4（dipeptidylpeptidase 4, DPP4），以及CEACAM1（carcinoembryonicantigen-related cell adhesion molecule）。其中，具有种属特异性的APN蛋白是人冠状病毒229E，猫冠状病毒（FCoV），和猪冠状病毒TGEV的受体。人类ACE2是SARS病毒和NL63的受体。人类DPP4是MERS病毒的受体。小鼠CEACAM1是、蛋白的α亚型是MHV的受体。许多冠状病毒RBD与宿主受体结合的复合物晶体结构已经获得解析，主要包括：SARS-RBD-ACE2复合物, NL63-RBD-ACE2复合物，MERS-RBD-DPP4复合物，HKU4-RBD-DPP4复合物，和MHV-RBD-mCEACAM1α复合物晶体结构。关于冠状病毒S蛋白介导的膜融合过程的研究取得较大的进展，然而有许多科学问题尚待解决。例如：冠状病毒的S蛋白缺乏完整的三聚体结构信息；大多数冠状病毒的受体未知；S蛋白介导的细胞入侵途径不明；S介导的膜融合机制步骤尚不清晰等等。; 个人分类: 病毒入侵机制|19679 次阅读|1 个评论

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