从《 “ 总司令 ”EIN3 》中我们了解到， 在乙烯信号通路中， EIN3/EIL1 绝对处于中流砥柱的位置，他们共同把控着乙烯信号通路的命脉，直接影响着信号能否顺利传递和执行，是乙烯信号通路中名副其实的 “ 总司令 ” 。 和我们人类历史上的许多伟人一样， EIN3 这位乙烯信号王国里的 “ 伟人 ” 也是一位情感丰富的多情种，它到底有着怎样为人津津乐道的 “ 八卦 ” 呢？今天就让我们扒一扒 EIN3“ 风花雪月 ” 的那些事儿。 俗话说：能者多劳。正是由于 EIN3 在乙烯信号通路中决定性的作用，它也承担了乙烯和其他信号交流互作的任务。 2011 年，郭红卫课题组在 PNAS 上发表题为 Derepression of ethylene-stabilized transcription factors (EIN3/EIL1) mediates jasmonate and ethylene signaling synergy in Arabidopsis 的文章，首次报道了 EIN3/EIL1 介导 JA 和乙烯互作的分子机制。研究人员发现，用 JA 处理拟南芥可以诱导 JA 响应基因的表达，促进根毛的发育，并抑制根的伸长；而在 ein3eil1 双突中，上述现象都受到了不同程度的抑制，说明 EIN3/EIL1 在许多 JA 反应中起到正调控的作用。进一步研究揭示， JA 信号通路中主要的转录抑制子 JAZ 可以和 EIN3/EIL1 互作，抑制其转录活性。同时， PRD3 类型的组蛋白去乙酰酶 HDA6 作为共抑制子，和 EIN3/EIL1 以及 JAZ 互作，也参与抑制 EIN3/EIL1 的转录活性。另外， JA 处理后， ERF1 上游启动子区域的乙酰化程度增加，促进了该基因的表达。鉴于以上结果，他们提出了 EIN3/EIL1 介导乙烯和 JA 互作的工作模型：没有 JA 时， JAZ 蛋白招募 HDA6 并和 EIN3/EIL1 互作，使下游基因启动子区域组蛋白乙酰化程度降低，破坏 EIN3/EIL1 和靶基因的结合；有 JA 时， JAZ 蛋白被降解， JAZs-HDA6 共抑制子解体， EIN3/EIL1 脱抑制，可以正常激活下游基因的表达。 EIN3/EIL1 正调控 JA 介导的根毛发育【 1 】 除了 JA ， EIN3/EIL1 是否还介导乙烯和其他激素的互作呢？ 2012 年，郭红卫课题组又在 Cell Research 上发表论文 Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings ，揭示了乙烯和 GA 共同调控拟南芥黄化苗弯钩形成的分子机制。有意思的是，和乙烯与 JA 互作的机制相似， GA 信号通路中重要的抑制子 DELLA 蛋白可以和 EIN3/EIL1 直接互作，抑制其转录活性。 GA 处理后， DELLA 蛋白降解， EIN3/EIL1 脱抑制，和控制弯钩形成的关键基因 HLS1 （ HOOKLESS1 ）启动子结合，激活基因的表达，促进弯钩的形成。 GA 和乙烯促进弯钩的形成需要 HLS1 【 2 】 如上所述，在植物生长发育的许多方面（根毛发育、根的伸长、死体营养型真菌抗性） JA 和乙烯是相互协同的，但是这并不是绝对的。 2014 年，谢道昕课题组和郭红卫课题组分别在 The Plant Cell 上发表文章，共同揭示了乙烯和 JA 相互拮抗，调控拟南芥黄化苗弯钩形成的分子机制。他们同时发现， JA 信号通路中的重要转录因子 MYC2 可以和 EIN3 直接互作，抑制 EIN3 的转录活性，从而抑制 HLS1 的表达，最终影响了弯钩的形成。另外，郭红卫课题组还发现， MYC2 可以和 F-box 基因 EIN3 BINDING F-BOX PROTEIN1 的启动子结合，诱导基因的表达，从而促进了 EIN3 蛋白的降解。此外，谢道昕课题组还发现， EIN3 和 MYC2 的影响是相互的，除了 MYC2 抑制 EIN3 的活性， EIN3 也能反过来抑制 MYC2 的转录活性，进而减弱了 JA 介导的植物对食草动物的抗性。 JA 抑制乙烯诱导的弯钩形成【 4 】 在上面的例子中， JAZ 、 DELLA 以及 MYC2 都是 EIN3 转录活性的抑制子，那么有没有 两者互作后增强某一方活性的情况呢？答案当然是肯定的。 2011 年，德国 Saarland 大学的科研人员在 The Plant Cell 上发表题为 Interaction between the bHLH transcription factor FIT and ETHYLENE INSENSITIVE3/ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE1 reveals molecular linkage between the regulation of iron acquisition and ethylene signaling in Arabidopsis 的文章，揭示了铁吸收和乙烯信号互作的分子机制。 FIT （ FER-LIKE FE DEFICIENCY-INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR ）是植物根系吸收铁的重要调控因子，为了解析 FIT 调控植物吸收铁的分子机制，研究人员通过酵母双杂交体系筛选 FIT 的互作蛋白，发现 EIN3/EIL1 和 FIT 互作。进一步研究发现，这一互作增加了 FIT 蛋白的稳定性，减少了蛋白酶体对 FIT 蛋白的降解，进而促进铁吸收相关基因的表达，最终增强了植物吸收铁的能力。 EIN3 这位能者，不仅决定着乙烯信号通路的顺利传递，还和许多其他通路的关键因子来了场风花雪月的亲密接触。 EIN3 正如那四通八达的交通网络中的枢纽，其重要作用不言而喻。 在植物复杂的调控网络中，到底还会有多少因子通过 EIN3 和乙烯发生更多的亲密接触呢？让我们一起期待后续更多精彩的研究！ 【 1 】 Zhu, Z., An, F., Feng, Y., Li, P., Xue, L., Mu, A., ... Zhang, X. (2011). Derepression of ethylene-stabilized transcription factors (EIN3/EIL1) mediates jasmonate and ethylene signaling synergy in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(30), 12539-12544. 【 2 】 An, F., Zhang, X., Zhu, Z., Ji, Y., He, W., Jiang, Z., ... Guo, H. (2012). Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell research, 22(5), 915. 【 3 】 Song, S., Huang, H., Gao, H., Wang, J., Wu, D., Liu, X., ... Xie, D. (2014). Interaction between MYC2 and ETHYLENE INSENSITIVE3 modulates antagonism between jasmonate and ethylene signaling in Arabidopsis. The Plant Cell, tpc-113. 【 4 】 Zhang, X., Zhu, Z., An, F., Hao, D., Li, P., Song, J., ... Guo, H. (2014). Jasmonate-activated MYC2 represses ETHYLENE INSENSITIVE3 activity to antagonize ethylene-promoted apical hook formation in Arabidopsis. The Plant Cell, tpc-113. 【 5 】 Lingam, S., Mohrbacher, J., Brumbarova, T., Potuschak, T., Fink-Straube, C., Blondet, E., ... Bauer, P. (2011). Interaction between the bHLH transcription factor FIT and ETHYLENE INSENSITIVE3/ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE1 reveals molecular linkage between the regulation of iron acquisition and ethylene signaling in Arabidopsis. The Plant Cell, tpc-111. 【 6 】 Smith, S. M., Li, C., Li, J. (2017). Hormone function in plants. 欢迎关注 BioArt植物 微信公众号
通过前面的介绍，我们了解到，在空气中，CTR1被受体激活，磷酸化EIN2的C端，磷酸化的EIN2被F-box蛋白ETP1/2降解，抑制信号向下游传递；而有乙烯存在时，受体和CTR1失活，ETP1/2蛋白减少，EIN2 C端去磷酸化，稳定性增强，并从内质网切割下来，进入细胞核，激活下游信号。 在乙烯的帮助下，EIN2总算脱离了内质网的“束缚”，由此开始了向细胞核的“朝圣之路”。正如唐僧西天取经要经历九九八十一难一样，EIN2通往细胞核的路途也注定不会一帆风顺，这其中又会发生怎样精彩的故事呢？下面，就让我们一探究竟吧！ 在正式开始今天的故事之前，我们先简单介绍一下背景知识。通过前面《乙烯信号简史》系列的介绍，我们已经了解了已知的乙烯信号通路中的大部分组分。不过，仍有一个重量级的嘉宾还没有涉及到，那就是在乙烯信号转导中起非常重要作用的转录因子EIN3和EIL1。它们可以直接调控乙烯响应基因的表达，使植物对乙烯作出特定的反应。 2003年，Joseph R. Ecker实验室在 Cell 上发表论文 Plant responses to ethylene gas are mediated by SCFEBF1/EBF2-dependent proteolysis of EIN3 transcription factor ，揭示了泛素化/蛋白酶体介导的蛋白质降解途径参与乙烯信号转导的新机制。他们发现，当没有乙烯时，细胞核中的EIN3/EIL1会被F-box蛋白EBF1/2介导的泛素化/蛋白酶体途径快速降解，抑制下游基因的表达。而有乙烯时，EIN2的C端进入细胞核，稳定EIN3/EIL1并使其积累，激活下游乙烯信号。另外，研究人员还发现，EBF1/2介导的EIN3/EIL的蛋白降解依赖EIN2，但是机制却不清楚。那么，乙烯和EIN2到底是通过什么机制抑制EBF1/2的功能呢？这个问题一直困扰着人们。 2015年，两个独立的研究小组同时在Cell上发表文章，共同揭示了乙烯信号转导的新机制：乙烯促进EIN2和EBF1/2 mRNA 3’UTR的polyU motif结合，并进入P-body，进而抑制EBF1/2蛋白的翻译。 其中的一篇文章是 郭红卫课题组 的研究成果，题为 EIN2-directed translational regulation of ethylene signaling in Arabidopsis 。他们的灵感来自于前期的研究发现。ein5是一个乙烯钝感突变体，它的XRN4(EXORIBONUCLEASE 4)基因发生了突变。在前期的研究工作中，科研人员发现在ein5突变体中，EBF1和EBF2的3’UTR片段会累积。那么，这些累积的3’UTR和ein5的乙烯钝感表型有什么关系呢？为了回答这一疑问，研究人员将EBF1的3’UTR片段在WT材料中过表达。他们惊奇地发现，过表达EBF1的3’UTR可降低拟南芥的乙烯敏感性，抑制EIN3蛋白的累积，并促进内源EBF1/EBF2 mRNA的翻译。研究人员推测，植物体内可能存在某种翻译抑制机制，会结合到内源EBF1/2的3’UTR，抑制EBF1/2的翻译，而外源过表达EBF1的3’UTR会导致竞争性结合，最终解除或降低了这种翻译抑制机制。 过表达EBF1的3’UTR降低拟南芥的乙烯敏感性【2】 为了验证这一假设，研究人员将EBF1/2的3’UTR与GFP蛋白融合，转化到拟南芥中。当用乙烯处理转基因拟南芥时，GFP的荧光减弱蛋白减少，说明EBF1/2的3’UTR确实可以抑制蛋白的翻译。进一步的遗传分析表明，这种抑制蛋白翻译的作用依赖于上游的乙烯受体和EIN2，但是并不依赖EIN3/EIL1。进一步研究发现，EBF1/2 3’UTR的poly U motif以及EIN2蛋白的654-1272位氨基酸及其NLS都是这种翻译抑制作用所必须的。 EBF1的3’UTR参与乙烯诱导的翻译抑制【2】 那么这种翻译抑制作用的分子机制到底是什么呢？研究人员发现，EIN2可以和EBF1/2的 3’UTR直接互作，并且这种互作随着乙烯的处理而加强。进一步研究发现，EIN2蛋白和EBF1/2的3’UTR共定位于细胞质中的P-body，并和P-body中的多种组分互作。 至此，EBF1/2翻译抑制的机制就比较清楚了：当有乙烯时，EIN2的C端从内质网上切割下来。细胞质中的EIN2 CEND可以和EBF1/2 mRNA的3’UTR互作，并且通过和P-body中的组分互作，将EBF1/2 mRNA带入P-body，从而抑制EBF1/2 mRNA的翻译。 EIN2抑制EBF1/2 mRNA翻译的原理图【2】 有意思的是，北卡罗莱纳州立大学的 Jose M. Alonso 和 Anna N. Stepanova 实验室也发现了与上述相同的机制，并以 Gene-Specific Translation Regulation Mediated by the Hormone-Signaling Molecule EIN2 为题，与郭红卫实验室的文章以背靠背的形式共同发表在同一期的Cell上。不禁让人发出“英雄所见略同”的感慨！ 背靠背发表的两篇Cell文章 值得一提的是，在以往的研究中，乙烯信号通路的研究成果大多属于国外实验室。而此次EIN2对EBF1/2蛋白翻译抑制的研究成果，是我国科学家在乙烯信号转导领域作出的重大发现，具有非常重要的意义。而近年来，我国植物科学研究快速发展，高水平的科研成果层出不穷。我们正处在一个做植物研究最好的时代！ ——— 【1】Guo, H., Ecker, J. R. (2003). Plant responses to ethylene gas are mediated by SCFEBF1/EBF2-dependent proteolysis of EIN3 transcription factor. Cell, 115(6), 667-677. 【2】Li, W., Ma, M., Feng, Y., Li, H., Wang, Y., Ma, Y., … Guo, H. (2015). EIN2-directed translational regulation of ethylene signaling in Arabidopsis. Cell, 163(3), 670-683. 【3】Merchante, C., Brumos, J., Yun, J., Hu, Q., Spencer, K. R., Enríquez, P., … Alonso, J. M. (2015). Gene-specific translation regulation mediated by the hormone-signaling molecule EIN2. Cell, 163(3), 684-697. 【4】Li, J., Li, C., Smith, S. M. (2017). Hormone Metabolism and Signaling in Plants. Academic Press. 欢迎关注 BioArt植物 微信公众号
通过上一讲《“伟光正”EIN2》的介绍，我们了解到，EIN2是乙烯信号通路中第一个起正调控作用的关键因子，它 “伟光正” 的高大形象已经深入人心。既然EIN2在乙烯信号转导通路中起到非常重要的作用，那么人们自然会好奇，它到底是如何发挥作用的呢？我们已经知道，EIN2定位在胞质中的ER膜上，而植物接受乙烯信号后要引起生物体的应答，必然会涉及细胞核中基因的表达调控，那么乙烯信号是如何通过EIN2从ER膜传递到细胞核中的呢？这一个又一个的问题，等着全世界的科学家们去回答。 2012年，是乙烯信号研究史上值得载入史册的一年。因为就在这一年，来自世界各地的三个实验室几乎同时发表文章，为我们揭示了EIN2介导乙烯信号转导的分子机制。 2012年8月， Joseph R. Ecker实验室在 Science 发表题为 Processing and subcellular trafficking of ER-tethered EIN2 control response to ethylene gas 的文章，揭示了EIN2由ER到细胞核转移的机制。在前期的研究中，Melanie M.A. Bisson等人通过保守结构域预测，在EIN2的C端发现了一个可能的核定位信号（NLS）。随后，Ecker实验室对该NLS的功能进行了深入研究。他们将野生型的EIN2-YFP融合蛋白转化至突变体ein2-5中，可以恢复突变体的表型；而将NLS突变后的EIN2Fm-YFP转化到ein2-5中后，突变体的表型并不能被互补，说明 NLS是EIN2行使功能所必需的 。 既然该NLS结构域是一个预测的核定位信号，那么EIN2蛋白是否具有核定位信号呢？研究人员用乙烯处理转化了EIN2-YFP融合蛋白的拟南芥发现，乙烯处理前EIN2-GFP定位在内质网上，而用乙烯处理10min后，即可在细胞核中发现EIN2-GFP的定位信号，并且随着处理时间的延长，信号强度也逐渐增强。而将NLS突变后，乙烯处理无法使EIN2Fm-YFP转移到细胞核。以上结果说明， 乙烯处理会使EIN2由ER转移至细胞核，并且这种转移对EIN2行使正常的功能是必须的 。 NLS影响EIN2的核定位【1】 那么，乙烯信号转导中的什么组分会影响EIN2的亚细胞定位呢？将EIN2-YFP分别转化至受体突变体etr1-1，ctr1-1和转录因子突变体ein3-1eil1-1中，发现etr1-1中ACC处理前后EIN2-YFG都不会出现核定位信号，而在ctr1-1中EIN2-YFP会出现组成型核定位，在ein3-1eil1-1双突中EIN2则能正常响应乙烯。以上结果说明 ETR1和CTR1影响乙烯介导的EIN2由ER向细胞核的转移，而EIN3和EIL1对EIN2的定位没影响 。 ETR1和CTR1影响EIN2的核定位【1】 我们在《“伟光正”EIN2》中介绍过，按照保守结构域可将EIN2可分为两段：N端和C端。N端有12个保守的跨膜结构域，决定EIN2的ER定位。将EIN2的C端（CEND）在ein2-5中过表达，即可导致光下生长的幼苗出现组成型乙烯反应，并可持续激活乙烯响应基因的表达。而本文作者也发现，定位于细胞核的EIN2-CEND足以植株表现出乙烯反应。因此他们推测，当乙烯处理后，EIN2的C端被蛋白水解酶剪切，随后进入细胞核。为了验证上述推测，通过western blot检测乙烯处理后植物体内是否有内源的剪切后的EIN2形式存在。结果表明， 乙烯处理后，确实在细胞核提取物中检测到了分子量更小的剪切后的EIN2-CEND肽段 。 乙烯处理使EIN2-CEND剪切入核【1】 那么另一个问题就来了，EIN2的剪切位点在哪儿呢？Ecker实验室使用了MS并结合Pseudo-Multiple Reaction Monitoring技术检测EIN2可能的剪切位点，最终锁定在第645和646个氨基酸之间。随后，他们又使用了蛋白磷酸化组学方法，在空气中生长的黄化苗中提取出的EIN2上发现了3个高水平的磷酸化位点。有意思的是，其中的一个位点S645正好也是可能的剪切位点。那么，S645的磷酸化水平到底是否受乙烯影响呢？研究发现，空气处理的野生型中EIN2的S645被磷酸化，而乙烯处理后却不被磷酸化；而在ctr1-1突变体中，无法检测到S645的磷酸化。以上结果说明， EIN2 S645的磷酸化需要CTR1 。 CTR1介导的EIN2 S645的磷酸化对其剪切入核有什么影响呢？研究人员在EIN2中引入了S645A的突变，使该位点丧失被磷酸化的功能。将突变后的EIN2转化至ein2-5中，可使植株出现组成型乙烯反应，并使EIN2-YFP出现组成型的剪切和核定位。转录组分析也发现，S645A突变可在转录水平持续激活乙烯响应。而可模拟磷酸化的S645E突变则不能恢复ein2-5的表型，同时EIN2-YFP也无法剪切入核。以上结果说明， 乙烯可以抑制CTR1对EIN2的磷酸化，使EIN2的C端被剪切入核 。 CTR1介导的EIN2磷酸化影响EIN2-CEND的剪切入核【1】 有意思的是，几乎与此同时，郭红卫实验室和Caren Chang实验室发表的文章，得到了与该文章几乎相同的结论。只能再一次感慨国际同行对于科技前沿问题的角逐和竞争有多激烈。 都说文无第一武无第二，可是在学术圈，却永远只有第一，没有第二 。 我们知道，自然界中的万事万物都必须维持一种相对平衡的状态，才能长久稳定地存在。既然EIN2在乙烯信号转导中具有如此关键的作用，那么它是不是就可以“为所欲为”，不受其他事物控制了呢？答案肯定是否定的，大自然绝对不允许如此不和谐的事情发生。 2008年Joseph R. Ecker实验室在 GENES DEVELOPMENT 上发表题为 Interplay between ethylene, ETP1/ETP2 F-box proteins, and degradation of EIN2 triggers ethylene responses in Arabidopsi s的文章，揭示了ETP1/ETP2调控 EIN2蛋白降解的机制。 我们在 《“伟光正”EIN2》 曾经介绍过，在前期研究中发现，EIN2 mRNA对乙烯处理并没有反应。于是本文作者通过western blot检测EIN2是不是存在转录后调控。他们使用蛋白合成抑制剂CHX处理，检测EIN2蛋白的变化，发现CHX处理30min后，EIN2蛋白含量显著降低，2h后基本检测不到。说明EIN2蛋白的寿命极短，半衰期仅为30mim。进一步使用蛋白酶体抑制剂MG115和MG132处理，发现EIN2蛋白逐渐累积，并且还出现了分子质量更大的条带，说明EIN2蛋白可能存在被修饰的状态，并且很可能是泛素化修饰。进一步使用乙烯处理后发现，在野生型Col中EIN2蛋白会迅速累积，并且银离子可抑制该过程的发生。而etr1-1突变可抑制EIN2的积累，ctr1-1突变则导致EIN2组成型积累，ein3eil1中EIN2蛋白对乙烯的响应不受影响，说明 乙烯促进EIN2蛋白的积累和乙烯反应相一致，并依赖于EIN3和EIL1上游的组分 。 为了进一步揭示EIN2转录后调控的机制，研究人员使用EIN2-CEND为诱饵，进行了酵母双杂交筛选，筛选到了1个新的F-box蛋白ETP1（EIN2 TARGETING PROTEIN2）。经过蛋白序列比对，发现拟南芥基因组中还有另外一个蛋白和ETP1具有较高的一致性（50%），将其命名为ETP2。 EIN2-CEND和ETP1/ETP2互作【5】 将ETP1或ETP2过表达可以抑制EIN2的累积，并且转基因植株表现出非常强的乙烯不敏感表型。使用amiRNA降低ETP1和ETP2 mRNA的表达会导致EIN2蛋白积累，并使转基因植株出现组成型乙烯反应。另外，乙烯处理会降低ETP1和ETP2蛋白的含量，抑制它们与EIN2的互作。 综上所述，当没有乙烯时，ETP1/ETP2蛋白积累，通过泛素化途径降解EIN2蛋白，关闭乙烯信号途径；而有乙烯时，ETP1/ETP2蛋白被含量减少，EIN2稳定性增强，被切割入核，激活下游乙烯信号。 ETP1/ETP2通过调控EIN2的含量负调控乙烯信号【5】 由此联想到了韩信和萧何的典故，不禁要感慨一声： 真是成也EIN2，败也EIN2！ 在乙烯的帮助下，EIN2总算成功从内质网上解离下来了，由此开始了向细胞核的“朝圣之路”。可是，这一路途注定不会一帆风顺，中间又会发生怎样精彩的故事呢？ 欲知后事如何，请听下回分解：《乙烯信号简史 | 入核“路漫漫”》 。 【参考文献】 【1】Qiao, H., Shen, Z., Huang, S. S. C., Schmitz, R. J., Urich, M. A., Briggs, S. P., Ecker, J. R. (2012). Processing and subcellular trafficking of ER-tethered EIN2 control response to ethylene gas. Science, 1224344. 【2】Bisson, M. M., Groth, G. (2011). New paradigm in ethylene signaling: EIN2, the central regulator of the signaling pathway, interacts directly with the upstream receptors. Plant signaling behavior, 6(1), 164-166. 【3】Ju, C., Yoon, G. M., Shemansky, J. M., Lin, D. Y., Ying, Z. I., Chang, J., … Cooper, B. (2012). CTR1 phosphorylates the central regulator EIN2 to control ethylene hormone signaling from the ER membrane to the nucleus in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences , 109 (47), 19486-19491. 【4】Wen, X., Zhang, C., Ji, Y., Zhao, Q., He, W., An, F., … Guo, H. (2012). Activation of ethylene signaling is mediated by nuclear translocation of the cleaved EIN2 carboxyl terminus. Cell research , 22 (11), 1613. 【5】Qiao, H., Chang, K. N., Yazaki, J., Ecker, J. R. (2009). Interplay between ethylene, ETP1/ETP2 F-box proteins, and degradation of EIN2 triggers ethylene responses in Arabidopsis. Genes development . 欢迎关注 BioArt植物 微信公众号
在前面的讲解中，我们介绍了乙烯信号转导通路中的两大组分：乙烯受体家族和CTR1。和大多数植物激素信号通路不同，乙烯信号中起始的这两大组分“狼狈为奸”，共同把持着乙烯信号通路的命脉，抑制信号向下游的传递。 不过，“天理昭昭，报应不爽，邪恶终归抵不过正义”。大自然这位伟大的编剧，巧妙地安排了一位“少年英雄”替天行道、除恶扬善，把邪恶消亡，让正义永存。这位英雄就是我们今天的主角，“伟光正”的EIN2 。 在《乙烯反应突变体的筛选》一文中，我们曾提到过，1990年Ecker课题组在 The Plant Cell 上发表的系统阐述以拟南芥三重反应为模式，进行乙烯反应突变体筛选的文章中，筛选到了一个乙烯不敏感突变体，在高浓度乙烯存在的情况下仍然不出现三重反应，这就是第一个EIN2（Ethylene Insensitive 2）等位突变体ein2-1。 1999年，Ecker实验室在 Science 上发表题为 EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis 的文章。文章中总结，在后续的遗传筛选中，陆续筛选出了25个ein2等位突变体。在这些突变体中，除了ein2-9，其他24个突变体在形态学、生理学以及分子水平都对乙烯处理不敏感。此外，它们除了对外源乙烯处理不敏感外，对内源乙烯也完全不敏感，并且在拟南芥的各个生长时期都有表型，这就说明了 EIN2在乙烯信号通路中起到非常关键的作用 。 有意思的是，除了在筛选乙烯不敏感突变体的过程中筛选到ein2等位突变外，在筛选生长素转运抑制剂、细胞分裂素和ABA不敏感突变体，以及衰老延缓突变体的过程中，也都筛选到了ein2等位突变，但是并没有筛选到其他乙烯信号通路的组分，这说明 EIN2可能特异地介导了乙烯和其他激素的互作 。 ein2突变体对乙烯不敏感【2】 通过图位克隆将EIN2定位在5号染色体的头部，并进一步克隆到EIN2基因。通过杂交实验发现EIN2在拟南芥基因组中为单拷贝，这可在一定程度上解释为什么唯独EIN2突变会导致拟南芥对乙烯完全不敏感。Northern blot发现EIN2在拟南芥的根、茎、叶以及花中都有表达，但是mRNA水平不受乙烯的影响。对25个ein2等位突变体中的EIN2进行测序后发现，它们中的EIN2基因都存在不同的突变。将野生型的EIN2转化至ein2-5中，可以互补突变体的表型，说明突变体的乙烯不敏感表型确实是由于EIN2基因的突变导致，并且 EIN2在乙烯的信号转导中发挥正调控作用 ，这是我们迄今为止讲到的第一个在乙烯信号通路中起正向作用的组分。 EIN2的图位克隆及等位突变【2】 将EIN2基因组和cDNA序列比对后发现，EIN2含有7个内含子。EIN2基因编码1294个氨基酸，蛋白大小约为141kD。N端的461个氨基酸具有非常强的疏水性，而C端的833个氨基酸却具有非常高的亲水性。蛋白结构预测发现EIN2蛋白具有12个跨膜结构域，全部位于N端。进一步通过体外实验证明，EIN2蛋白确实具有完整的膜定位。蛋白序列比对后发现EIN2的N端和Nramp家族蛋白具有较高的序列相似性（21% identity）。Nramp家族蛋白在细菌到人类的所有生物中都有发现，主要起到转运二价金属离子的作用。但是，将EIN2蛋白在爪蟾卵母细胞、酵母等系统中表达，并没检测到离子转运的活性，说明 EIN2并不具有离子转运的功能，可能通过其他的机制行使功能 。 EIN2 N端与Nramp蛋白序列比对（箭头所示为12个跨膜结构域）【2】 按照一般的理解，既然EIN2在乙烯的信号转导中起正调控的作用，如果将EIN2过表达，拟南芥应该会表现出组成型乙烯反应或者乙烯过敏感的表型。可是，将EIN2的N端和全长过表达，并没有出现上述表型。但是将EIN2的C端（CEND）在ein2-5中过表达，却可导致光下生长的幼苗出现组成型乙烯反应，并可持续激活乙烯响应基因的表达。以上结果说明， EIN2的Nramp-like domain可能通过某种机制调控CEND的功能 。 将EIN2 CEND在ein2-5中过表达，导致光下生长幼苗出现组成型乙烯反应【2】 2009年， Georg GROTH实验室在 Biochemical Journal 上发表题为 EIN2, the central regulator of ethylene signalling, is localized at the ER membrane where it interacts with the ethylene receptor ETR 1的文章。他们将EIN2-GFP融合蛋白在烟草叶片中瞬时表达，并通过激光共聚焦显微镜观察，发现EIN2-GFP和ER的marker蛋白共定位，并在细胞核周围表现出典型的ER网状结构，证明 EIN2定位在ER上 。 EIN2定位在内质网上【3】 我们在乙烯受体系列文章中介绍过，乙烯受体家族的5个成员，都在内质网有定位。那么，EIN2和受体之间有什么关系呢？ Groth组的科研人员通过FRET分析，证明乙烯受体ETR1和EIN2可以互作。随后又通过荧光滴定法（Fluorescence titration studies）进一步从体外证明了ETR1和EIN2的互作。 FRET分析证明ETR1和EIN2互作【3】 既然EIN2在乙烯的信号通路中起到关键性的作用，而它在mRNA水平上对乙烯又没有响应，那么它受什么调控，又是如何发挥作用的呢？ 欲知后事如何，请听下回分解：《乙烯信号简史 | 成也EIN2，败也EIN2》。 【参考文献】 【1】Guzman, P., Ecker, J. R. (1990). Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. The Plant Cell, 2(6), 513-523. 【2】Alonso, J. M., Hirayama, T., Roman, G., Nourizadeh, S., Ecker, J. R. (1999). EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science, 284(5423), 2148-2152. 【3】Bisson, M. M., Bleckmann, A., Allekotte, S., Groth, G. (2009). EIN2, the central regulator of ethylene signalling, is localized at the ER membrane where it interacts with the ethylene receptor ETR1. Biochemical Journal, 424(1), 1-6. 欢迎关注 BioArt植物 微信公众号
俗话说： “ 好兄弟高打墙，亲戚朋友远离乡。 ” 意思是说，如果想兄弟之间和睦相处，就必须在两家之间打一堵墙隔离，如果想亲戚朋友之间的关系好，那就必须要离得远一点。正所谓，距离产生美。 我们在上一讲中提到，乙烯受体家族一共有 “ 五兄弟 ” 。和我们人类一样，乙烯受体家族成员一多，肯定就不可避免地惹出许多麻烦，生出许多事端。那么， 这些成员之间有没有什么远近亲疏呢？植物为什么要进化出这么多受体，它们之间的功能又有什么分化呢？下面，让我们一起来看一下乙烯受体家族里的那些“爱恨情仇”。 1. 乙烯受体家族的分类 首先，我们来看一看乙烯受体家族的分类。总体来看，乙烯受体家族主要包括以下几个保守的结构域：一个负责和乙烯结合的 N 端，一个 GAF 结构域以及一个蛋白激酶结构域。另外，其中的三个受体（ ETR1 、 ETR2 和 EIN4 ）的 C 端还有一个接收结构域（ receiver domain ）。根据乙烯结合结构域的蛋白序列相似性，可将乙烯受体分为两个亚家族。亚家族 I 包括 ETR1 和 ERS1 ，它们具有组氨酸激酶活性所必需的氨基酸残基，具有组氨酸激酶的活性。亚家族 II 包括 ETR2 、 ERS2 和 EIN4 ，它们的组氨酸激酶结构域退化，具有丝 / 苏激酶的活性。另外，亚家族 II 的 N 端还多了一段氨基酸序列，可能具有信号肽的作用。非常有意思的一点是， ERS1 既有组氨酸激酶的活性，又有丝 / 苏激酶的活性。由此可见，和其他植物激素比，乙烯受体具有更强的结构和功能的复杂性。 乙烯受体的分类（ Lacey等，2014） 2. 乙烯受体的功能分化 正如我们人类讲究长幼尊卑，许多生物学过程也是要讲究次序的。既然乙烯受体家族有这么多成员，那么这五个成员在乙烯信号转导中是起到同等重要的作用，还是也有一定的主次之分呢？ 2003 年， Anthony B. Bleecker 实验室在 The Plant Cell 上发表一篇题为 Analysis of combinatorial loss-of-function mutants in the Arabidopsis ethylene receptors reveals that the ers1 etr1 double mutant has severe developmental defects that are EIN2 dependent 的文章。文章中对乙烯受体 loss of function 突变体进行不同的组合，构建了多种组合的双突和多突。对这些突变体表型进行观察后发现，对于拟南芥黄化苗，所有的乙烯受体突变体组合都表现出部分的组成型乙烯反应，但对外源乙烯处理仍有反应，这也在此说明了乙烯受体家族存在功能冗余。而对于生长在光照下的幼苗， ers1etr1 双突的生长发育受到更加明显的影响，比如莲座叶变小，晚花以及不育，说明乙烯受体亚家族 I 在光下拟南芥的生长发育过程中具有更重要的作用。 ers1etr1双突的表型（Hall等，2003） 2007 年， Schaller, G. E 实验室在 BMC Plant Biology 上发表题为 A strong constitutive ethylene-response phenotype conferred on Arabidopsis plants containing null mutations in the ethylene receptors ETR1 and ERS1 的文章，对乙烯受体亚家族 I 的功能进行了详细的研究。研究发现， etr1ers1 loss of function 双突表现出非常严重的组成型乙烯反应表型，说明亚家族 I 可能在乙烯信号转导通路中发挥更重要的作用。同时，将 ETR1 转化到双突中即可完全回复突变体的乙烯反应表型。另外， etr1ers1 仍然具有一定的乙烯反应，说明乙烯受体亚家族 II 可以独立行使部分乙烯受体的功能。 etr1ers1双突的组成型乙烯反应（Qu等，2007） 2010 年，中科院上海植生所文啟光课题组在 BMC Plant Biology 上发表文章 Genetic and transformation studies reveal negative regulation of ERS1 ethylene receptor signaling in Arabidopsis 。研究发现，在含有野生型 ETR1 的乙烯受体突变体中引入 ers1 突变，反而会减轻其组成型乙烯反应表型，而过表达 ERS1 则增强对植物生长的抑制，说明在调控乙烯反应方面， ERS1 具有双重作用：抑制乙烯反应，以及依赖于 ETR1 的促进乙烯反应。关于这一双重功能是如何实现以及如何调控的，仍需进一步研究。 ERS1的双重作用（Liu等，2010） 2012 年，上海植生所文啟光课题组一鼓作气，在 Plant Physiology 上发表文章 Arabidopsis ETR1 and ERS1 differentially repress the ethylene response in combination with other ethylene receptor genes ，创新性地将 ETR1 和 ERS1 显性突变导入乙烯受体 loss of function 五突（ 5LOF ）中，观察显性突变对五突乙烯反应的恢复情况，研究基因的功能。研究发现，将 etr1-1 显性突变导入 5LOF 中，杂交后代表现出乙烯不敏感的表型，说明 etr1-1 可独立于其他乙烯受体，抑制拟南芥的乙烯反应。而 ers1-1 显性突变对乙烯反应的抑制依赖于 ETR1 和 EIN4 。以上结果说明，不同的乙烯受体之间可能发生互作，共同调控植物复杂的乙烯反应。 etr1-1显性突变可独立地抑制拟南芥乙烯反应（Liu等，2012） 3. 乙烯受体多样化的意义 除了拟南芥，在其他植物中（比如番茄）也发现了乙烯受体家族，这说明乙烯受体家族并不是拟南芥所特有的，更不是拟南芥基因组复制造成的。那么， 乙烯受体家族的存在有什么意义呢？ 对于这一问题，科学家们有许多假设： (1) 不同受体对乙烯的亲和性可能不同，它们分工合作，共同感知不同浓度的乙烯； (2) 在转录水平，不同的受体对乙烯的反应不同，受体特异的乙烯响应模式，可能会引起不同的乙烯反应； (3) 受体在植物中的表达模式不同，这可能和植物在不同生长发育时期，各个组织和器官不同的乙烯反应有关； (4) 不同的受体，可能和不同的下游因子互作，或者和同一因子具有不同的亲和性； (5) 受体之间可能存在复杂的互作模式，相互影响，共同调控乙烯反应。 总之，由于乙烯在生物的生长发育以及响应外界环境的过程中具有非常重要的作用。 乙烯受体的复杂性，可能是乙烯功能复杂性和重要性的结果。 【参考文献】 Lacey, R. F., Binder, B. M. (2014). How plants sense ethylene gas—The ethylene receptors.Journal of inorganic biochemistry,133, 58-62. Gallie, D. R. (2015). Ethylene receptors in plants-why so much complexity?.F1000prime reports,7. Hall, A. E., Bleecker, A. B. (2003). Analysis of combinatorial loss-of-function mutants in the Arabidopsis ethylene receptors reveals that the ers1 etr1 double mutant has severe developmental defects that are EIN2 dependent.The Plant Cell,15(9), 2032-2041. Qu, X., Hall, B. P., Gao, Z., Schaller, G. E. (2007). A strong constitutive ethylene-response phenotype conferred on Arabidopsis plants containing null mutations in the ethylene receptors ETR1 and ERS1.BMC Plant Biology,7(1), 3. Liu, Q., Xu, C., Wen, C. K. (2010). Genetic and transformation studies reveal negative regulation of ERS1 ethylene receptor signaling in Arabidopsis.BMC plant biology,10(1), 60. Liu, Q., Wen, C. K. (2012). Arabidopsis ETR1 and ERS1 differentially repress the ethylene response in combination with other ethylene receptor genes.Plant Physiology, pp-111. Hua, J., Meyerowitz, E. M. (1998). Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana. Cell, 94(2), 261-271. 欢迎关注 BioArt植物 微信公众号
邮箱预订了一下新闻，还挺管用。 最新一期植物生物学年评已经可以在线阅读了， Annual Review of Plant Biology Vol. 60 (June 2009) ，里面有几篇我个人很感兴趣的文章。 My Journey from Horticulture to Plant Biology Jasmonate Passes Muster: A Receptor and Targets for the Defense Hormone A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors Genetically Engineered Plants and Foods: A Scientist's Analysis of the Issues (Part II) 下午抽空，浏览了一下茉莉酸信号的那篇，强烈觉得信号转导这一块的东西太多了，各种各样的hypothesis。解决了一个问题，又产生更多的问题。最后，各种成分交织在一起，错综复杂。面对生物体，科学家还真的是能量有限。
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