工频电磁场对皮层神经元瞬时外向钾电流的影响 1. 引言 随着现代科技的进步和社会经济的迅猛发展，各种电子产品、电力设备被大量的应用到人们生活环境中，人为产生的电磁场已逐渐成为威胁人体以及其他生物体健康和安全的环境污染因子。电磁辐射污染，又称电磁污染，已成为继大气污染、水污染和噪声污染后的第四污染 。工频电磁场 (power frequency electromagnetic field) 是由输电线及家用电器 所产生的一种极低频电磁场 ，我国采用 50Hz 为工作频率，而西方一些国家 ( 如美国、加拿大 ) 使用 60Hz 。 人类接触这种极低频电磁场的机会远远多于其他频段的电磁场和天然磁场，有研究表明，极低频电磁场可能与肿瘤、胚胎畸形以及神经、心血管、免疫、内分泌、生殖等器官系统的病变相关 。极低频电磁场暴露能增加肿瘤(尤其是白血病、脑瘤和乳腺癌等)发生的危险度 ，在一定程度上具有促癌效应 ；细胞分子水平上的很多研究提示，环境中的极低频电磁场可能具有潜在的生物学危害 ；但是也有相当一部分研究结果对此持否定或矛盾的观点 。工频电磁场暴露可导致小鼠精子数量、活力下降，精子头部畸形率上升 ；50Hz正弦磁场暴露引起鸡胚畸形率增加 ；50Hz，0.5mT正弦磁场暴露可引起鼠胚胎细胞DNA双链断裂，卵裂速度明显下降 ， 0.4 mT工频磁场长时间辐照可以使人晶状体上皮细胞DNA 双链断裂增加 。但也有报道称，人血细胞暴露于50 Hz、l mT磁场中48 h，DNA无损伤 。目前多数的研究还局限于肿瘤和生殖方面的调查研究，而对神经系统研究的比较少，仅有一些工频电磁场对大鼠记忆力的影响 ，以及工频磁场能够造成大鼠脑组织的脂质过氧化，尤其是基底前脑和额皮质部位 的研究。 经过多年的研究发现极低频电磁场能通过诱导细胞膜受体的聚集、降低膜的流动性和导电性、改变膜的结构等干扰细胞信号超导 。实际上，在许多病理状态下，都有细胞膜势能的改变，膜的结构组织上出现的变化导致了细胞膜极性的翻转等。现阶段磁场生物效应没有明确的理论基础，很多对于此方面的原因的研究都处于假设阶段 。 现已发现许多脑部疾病与钾通道特性改变有关，研究工频电磁场对中枢神经细胞膜钾离子通道特性的影响，有可能为电磁场直接作用于脑组织引起某些脑部病变的机理起指导作用。鉴于电压门控K + 通道在调节神经细胞膜兴奋性及神经可塑性中起着关键作用，本文利用膜片钳实验技术，研究50Hz工频电磁场对小鼠皮层神经元瞬时外向钾通道特性的影响，为从细胞和分子水平探索50Hz工频电磁场的生物刺激效应开辟了一条新的道路，为人们研究极低频磁场对神经系统的影响提供依据。 2. 材料与方法 2.1. 材料 动物：昆明小鼠，鼠龄10～13天，雌雄不限，由中国医学科学院放射医学研究所提供。 试剂：链霉蛋白酶（Pronase），Merck公司产品。河豚毒素（TTX）、氯化镉（CdCl 2 ）、氯化四乙胺（TEA-Cl）、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、已二醇－双（2－氨基乙基）四乙酸（EGTA）、Na 2 ATP均为Sigma公司产品。其余为国产分析纯。 （1）人工脑脊液(ACSF, mmol/L)：NaCl 134，KCl 5，NaH 2 PO 4 1.5，MgSO 4 2，CaCl 2 2， NaHCO 3 25，Glucose 10，HEPES 10，pH7.4；使用前通氧气饱和。 （2）K通道标准细胞外液（mmol/L）：NaCl 130，KCl 5.4，CaCl 2 2，MgCl 2 1，Glucose 10，HEPES 10，pH7.3，使用前通氧气饱和； （3）K通道电极内液（mmol/L）：KCl 120，CaCl 2 1，HEPES 10，EGTA 10，Na 2 ATP 3，MgCl 2 2，pH7.2，经0.22滤膜过滤。 2.2. 小鼠大脑皮层神经元急性分离 取出生10天左右的昆明小鼠迅速断头取脑，置于4C人工脑脊液中，一分钟后将脑切成冠状切片，并继续切取皮层组织，厚度约为400左右，放入连续通95%O 2 +5%CO 2 混合气的人工脑脊液中，孵育50分钟。之后加入Pronase，其终浓度为0.36g / L，32C下消化15min。消化结束用人工脑脊液洗脑片3次，加入盛有人工脑脊液的离心管中，用4根口径渐小的Pasteur吸管轻轻吹打组织块，制成细胞悬液，静置5min后取上部细胞悬液，放入带有盖玻片的培养皿内，约15～20min后细胞贴壁。分离完整的皮层神经细胞显微镜下观察，形态呈锥体或椭圆形，顶树突和轴突完整，细胞表面光滑，颗粒均匀细腻，它可在6～8小时内保持良好的生理状态 。 2.3. 全细胞膜片钳记录和数据分析 在20～25C室温下，利用PC2C膜片钳放大器（华中科大仪博生命科学仪器有限公司，中国）进行全细胞膜片钳记录，实验参数的设置、数据采集和刺激方式的施加均通过PC2C膜片钳自带软件来控制，采样频率为100kHz。记录用玻璃微电极（中科院电子所生产）经05-E型程控玻璃微电极拉制仪两步拉制而成，充灌电极内液后，电极阻抗为2～5。当电极与细胞膜之间形成高阻封接（1G）后，将钳制电位调到-80mV，进行快电容补偿后，稍加负压破膜，使电极液与细胞内液相通，再进行慢电容和串联电阻补偿，串联电阻补偿为60%～80%。 实验所用刺激装置由实验室自行研制，由自制圆形线圈外接交流稳压电源的形式产生2mT、50Hz磁场，通过改变线圈中电流的大小来改变线圈中心磁场的大小。先将小鼠的皮层神经细胞分离和贴壁，而后再将得到活性状态较好的细胞放置于工频电磁场当中，刺激后在进行膜片钳试验，最后将得到的数据和正常的进行对比研究，刺激过程如图1所示。 图 1 工频电磁场刺激示意图 Fig. 1 Schematic diagram of pulsating magnetic fields irradiation 实验结果分析采用Pclamp软件和Origin7.5统计软件完成，分析结果用MeanSD表示，脉冲磁场刺激前后差异的显著性用单因数方差分析和检验进行分析，P0.05表示有统计学差异。 3. 结果 3.1. 瞬时外向钾通道电流(I A )的记录 采用上述标准细胞外液和电极内液，且在外液中加入1 TTX 、0.1的CdCl 2 和20的TEA-Cl，记录皮层神经细胞膜上外向钾电流。置钳制电位于-80mV，给予脉冲幅度为-60mV～+50mV，脉冲宽度60ms，步幅+10mV的去极化脉冲刺激电压(图2A)，由于刺激频率与电流的强度大小没有直接关系，因此此次实验采用统一的刺激频率为0.25Hz，对得到的数据进行处理。该激活的外向电流即为快速激活和失活的瞬时外向钾电流I A (图2B)。 (A) (B) (C) 图2(A)刺激脉冲(B)记录的IA(C)曝磁后的IA Fig. 2 Transient outward potassium current traces (A) Depolarizing steps (B) Transient outward potassium current traces （ C ） Transient outward potassium current traces after magnetic fields exposure 考察正常皮层神经细胞I A 电流随时间变化的特点。给予图2A所示的去极化脉冲刺激，分别在1~6min记录不同时间的I A ，可知I A 在4min基本达到稳定。本试验分别采用加刺激与并未加刺激细胞第四分钟的I A 电流进行比较。 3.2. 工频电磁场刺激对I A 时间依赖性的影响 由于钾通道具有衰减（Rundown）现象，需要进行时间依赖性考察。给予与3.1相同的去极化脉冲刺激，分别对磁场照射15min和30min的I A 进行记录，已知I A 在4min基本达到稳定，数据记录应该从此时刻开始进行。为给予不同阶梯去极化脉冲刺激，经磁场作用15min和30min后的I A 电流密度的曲线。由实验结果可知：细胞经过曝磁后，I A 受到明显的抑制，对照组的最大电流密度为205.5326.95pA/pF (n=9, P0.05)，15min照射组最大电流密度为81.689.15pA/pF(n=9, P0.05) ，30min曝磁组的最大电流密度为43.575.59pA/pF(n=9, P0.05)。 图 3I A 随时间变化 曲线 Fig.3Effects of magnetic field irradiation on transient outward potassium currents in different irradiating time. Activation potential of transient outward potassium channel began to shift towards more negative potentials after irradiating for 15 min and 30min ( n =9) 3.3. 工频电磁场对瞬时外向钾电流 I - V 曲线的影响 给予同3.1中相同的刺激方式，将未加刺激和加工频电磁场刺激30min后得到的瞬时外向钾电流数据加以比较，以不同膜电位（去极化刺激电位）为横轴，该膜电位下激活的I A 电流密度值（电流/膜电容）为纵轴，绘制通道电流的曲线（图4）。对照组和曝磁组的最大激活电流密度分别为 205.53 26.95pA/pF ，43.57 5.59pA/pF 。由 I - V 曲线可知，经检验，对照组和工频电磁场刺激组I A 在统计学上具有显著性差异（n=9, P0.05）。 图 4 对照组、曝磁组 I A 的 曲线 Fig.4 Transient outward potassium currents difference between the control and magnetic field irradiation 3.4. 工频电磁场对I A 稳态激活特性的影响 置钳制电位-80mV，预置-120mV超极化条件刺激200ms，然后给予脉冲幅度从-60mV～+50mV，脉冲宽度60ms，步幅+10mV的去极化测试脉冲电压刺激，引出一系列瞬时外向钾电流，以第四分钟纪录的瞬时外向钾电流作为对照。以本文前述方法磁场照射细胞，照射时间30min，再次记录上述电流，利用公式将电流值转换成电导值，其中 G 为电导、为测试膜电位，为翻转电位，为不同膜电位下测定的电流峰值。以电导值与最大电导值的比值对应膜电位分别绘制工频电磁场作用前后I K 的稳态激活曲线（图5）。所得曲线可以用玻尔兹曼（Boltzmann）方程拟和，其中为半数激活电压， 为曲线的斜率因子。由图 5可以看出对照组与工频电磁场组激活曲线均呈 S型，并由此计算出对照组和磁场照射组瞬时外向钾通道的半数激活电压 分别为19.962.87mV和8.121.67mV（n＝9, P0.05），斜率因子分别为22.282.09和19.771.71mV（n=9,P0.05）。由此可知，工频磁场作用可明显改变I A 的激活特性，使激活曲线向左移动，并改变其斜率因子。 图5 对照组、工频磁场照射组I A 的激活曲线 Fig. 5 Effects of magnetic field irradiating on steady-state activation kinetics of I A . 4. 结论 实验结果表明，2.0mT、50Hz工频磁场作用，使小鼠皮层神经细胞膜瞬时外向钾通道电流I A 受到一定程度的抑制，且这种抑制作用呈现时间依赖性、电压依赖性。结果还表明，工频磁场的作用可使I A 的激活曲线显著地左移，且改变曲线的斜率因子。说明工频磁场作用皮层神经元，引起神经细胞膜瞬时外向钾离子通道I A 的激活过程受到抑制，使得动作电位复极化早期电压依赖性钾通道的开放延迟且关闭加快，从而使得 K + 外流减少。这一结果为各种家用电器对人体影响及磁疗产品对真实的治疗疗效提供实验参考。 电压门控离子通道是神经元电活动的分子基础，它参与初级生物信息传导，并在神经动作电位的产生、突触传递和其它重要的生理功能中起着重要作用。电压门控 Na + 通道决定了动作电位的产生，Ca 2+ 通道是再生电位产生的基础，而K + 通道在调节神经细胞膜兴奋性、神经可塑性及 在神经元的信号调控过程中起主要作用，同时也是某些神经毒素和药物作用的靶点。通过抑制瞬时外向 K+ 通道激活，使胞内钙浓度增加，对受损神经元起保护作用。 瞬时外向钾电流I A 是动作电位复极化早期外向电流的主要成分，主要调节静息膜电位，减慢去极化的速度，决定动作电位产生的频率。工频磁场作用改变小鼠皮层神经元瞬时外向钾通道电流的稳态激活特性，从而会影响神经元动作电位的形成和发放，最终调节神经元的生理功能。 磁场的生物刺激作用机制和作用靶点目前尚不明确，仅限于一些假说，而低频电磁场对有机体的作用更是一个非线性、瞬态的复杂过程。本实验从细胞膜电压门控钾离子通道角度研究工频磁场这种极低频磁场的生物刺激作用。磁场作为一种物理因素，对运动的带电物质有洛伦兹力的作用，影响细胞膜的离子通透性和膜两侧的电位，引起机体内环境平衡，从而影响带电物质的转移过程，产生一些生物效应。本实验结果提示工频磁场的生物刺激作用与细胞膜离子通道特性及通道构形变化有关，但仍需进一步从分子生物学及细胞信号转导方面进行分子层面的理论和实验验证。 参考文献 刘志华，时丽冉. 电磁辐射对人体健康的影响 ，生物学通报，2006,41(3):30-31 LIU Z H, SHI L R. Effects of Electromagnetic radiation on the Health of People , Bulletin of Biology, 2006,41(3):30-31. (in Chinese) Repacholi MH, Greenebaum B, Interaction of static and extremely low frequency electric and magnetic fields with living system: health effects and research needs , Bioelectromagnetics , 1999, 20:133-160 Adey WR. Cell membranes: the electromagnetic environment and cancer promotion , Neurochem Res , 1998,13:671-677 ． Caili Jia, Zhenjie Zhou, Renchen Liu, eta1 ．EGF Receptor Clustering is Induced by a 0.4mT Power Frequency Magnetic Field and Blocked by the EGF Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor PD153035 , Bioelectromagnetics , 2007,28(3):197-207 ． Walleczek J, Shiu EC, Hahn GM. Increase in radiation-induced HPRT gene mutation frequency after non-thermal exposure to nonioning 60 Hz electromagnetic fields , Radiat Res , 1999,151:489-497． 洪蓉，刘簧，喻云梅，等．极低频电磁场对小鼠雄性生殖的影响 ，中华劳动卫生职业病杂志,2003,21:342-345． HONG R, LIU Y, YU Y M, et al. . Effects of extremely low frequency electromagnetic fields on male reproduction in mice , Chin J Ind Hyg Occup Dis , 2003,21:342-345. (in Chinese) Juutilainen J. Developmental effects of electromagnetic fields , Bioelectromagnetics , 2005,(Suppl 7):s107-l15． Luo Q, Yang J, Zeng QL, et a1 . 50 Hz electromagnetic fields inducegaummH2AX Foci formation in mouse preimplantation embryos in vitro , Biol Reprod , 2006,75:673-680． 杜晓刚，徐珊珊，陈苘，鲁德强，许正平，曾群力. 工频磁场对人晶状体上皮细胞DNA双链断裂的影响 , 浙江大学学报(医学版),2008,37(1):9-14. DU X G,XU S S.CHEN Q,LU D Q,XU Z P,ZENG Q L.Effects of 50 Hz magnetic fields on DNA double-strand breaks in hum anlens epithelial cells , JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCES) , 2008,37(1):9-14. (in Chinese) Testa A, Cordelli E, Stronati L, eta1 ．Evaluation of genotoxic effect of low level 50 Hz magnetic fields on human blood cells using different cytogenetic assays , Bioelectromagnetics , 2004, 25:613-619． Majid J, Seyed M F, Ali R-P, Ahmad A S, Hassan S, Abbas A T. Acute exposure to a 50Hz magnetic field impairs consolidation of spatial memory in rats , Neurobiology of Learning and Memory , 2007, 88(4):387-392. Jelenkovic A，Janac B，Pesic V， et a1 ．Effects of extremely lowfrequency magnetic field in the brain of rats ． Brain Res Bull ，2006, 68(5):355-360. 李平阳，冯鉴强，戴恩盛，等. 50Hz磁场暴露对大鼠海马单胺类神经递质的影响 , 环境与健康杂志, 2006,23(1):25-28 LI P Y, FENG J Q, DAI E S, et al. The Effects of 50 Hz Magnetic Field on the Monoamine Neurotransmitters Contents in the Hippocampus of Rats , J Environ Health , 2006,23(1):25-28. (in Chinese) 贾彩丽，周贞洁，刘仁臣，等．50Hz弱磁场诱导离体表皮生长因子受体聚集 , 生物物理学报, 2005,21(4):269-276. (in Chinese) JIA C L, ZHOU Z J, LIU R C, et al. The clustering effect of purified epidermal growth factor receptor induced by 50 Hz magnetic field , Acta biophysica sinica , 2005,21(4):269-276． LEI Y, LIU T, WILSON .F. A. W, ZHOU. D, etal .. Effects of extremely low-frequency electromagnetic fields on morphine-induced conditioned place preferences in rats , Neuroscience Letters , 2005,390(2):72-75. 邱纪方. 超低频磁场的生物效应和临床应用 , 中华物理医学与康复杂志, 2002,24(4):439-441. QIU J F. Biological effect clinical application of extremely low-frequency electromagnetic fields , Chin H Phys Med Rehabil , 2002,24(4):439-441.(in Chinese) 王毅，牛金龙，沈强,等. 强脉冲磁场作用于大鼠脑部镇痛效果的初步研究 , 生物医学工程杂志, 2001,18(4):552-553. WANG Y,NIU J L,SHEN Q, etal. . Analgesic effect induced by stimulation of rats brain with strong pulsed magnetic field: a preliminary study , J Biomed Eng , 2001,18(4):552-553.(in Chinese) YUICHIRO HASHIMOTO .M. K. M. S. Effect of static magnetic field on cell migration , Electrical Engineering in Japan , 2007,160(2):46-52. 乔晓艳，李刚，林凌，等. 弱激光对神经元钾离子通道特性影响的实验研究 , 物理学报, 2007,56(4):2448-2454. QIAO X Y, LI G, LIN L ， et al .. Research on characteristics of neuron potassium channel under low laser irradiation , ACTA PHYSICA SINICA, 2007,56(4):2448-2454.(in Chinese) 乔晓艳，李刚，贺秉军. 弱激光对大鼠海马神经元钠通道特性的影响 , 生物化学与生物物理进展, 2006,33(2):178-182. QIAO X Y, LI G, HE B J. Effects of low level laser irradiation on properties of sodium channel in rat hippocampal neurons , Progress in Biochemistry and Biophysics , 2006, 33(2): 178 - 182. (in Chinese)
脉冲磁场对皮层神经元瞬时外向钾电流 影响的初步实验研究 1. 引言 现代科学的发展已经表明，任何空间都存在着或低或高的磁场，这些生物磁场及其变化与生物的生命活动、生理状态密切相关。随着生物磁技术的发展，有关磁场作用与生物学效应的研究，取得了积极的成果，不仅丰富了磁场疗法的基础理论，而且推动了磁场疗法的发展与深入，各类磁疗在医学中的基础和临床应用研究越来越广泛。现代科技的发展使人们越来越多的暴露在各种各样的磁场中，磁场对人体正常的机理有着何种影响，及其影响机理如何至今未明 。 低频脉冲磁场在促进骨折愈合 、改善血流变 、预防静脉血栓、脊髓损伤及脑创伤 等方面不断有研究报道；同时射频电磁场可对人体造成多种伤害也多见报道。在神经系统主要表现为神经衰弱，同时伴有植物神经功能失调的征候 。也可影响内分泌功能。微波可使精子数量减少，活动能力降低，甚至可发生暂时性不育。妇女在妊娠早期受微波照射可引起流产，分娩后可引起乳汁分泌量减少。人们又可以利用电磁场的生物学效应来治疗某些疾病，如促进骨折愈合用做肿瘤的辅助治疗等脉冲电磁场刺激对周围神经的再生有一定促进作用 。 经过多年的研究磁场对于细胞膜有着特殊的影响 ，特别是磁场的脉冲作用 ，能够改变细胞膜两侧的离子分布，从而在某些创伤或是变性的组织产生的炎症反映中表现出治疗效应。磁场对生物膜效应有以下几个方面：磁场对于许多细胞内的酶系统有影响、它们影响了抗原和抗体的关系、它们使得细胞膜通透性发生了改变，从而改变了膜两侧离子平衡；实际上，在许多病理状态下，都有细胞膜势能的改变，膜的结构组织上出现的变化导致了细胞膜极性的翻转等。现阶段磁场生物效应没有明确的理论基础，很多对于此方面的原因的研究都处于假设阶段，因此对于电磁作用生物组织治疗机理的研究还在逐步进行中 。 2. 材料与方法 2.1. 材料 动物：昆明小鼠，鼠龄10～14天，雌雄不限，天津医科大学动物实验中心提供。 试剂：链霉蛋白酶（Pronase），Merck公司产品。河豚毒素（TTX）、氯化镉（CdCl 2 ）、氯化四乙胺（TEA-Cl）、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、已二醇－双（2－氨基乙基）四乙酸（EGTA）、Na 2 ATP均为Sigma公司产品。其余为国产分析纯。 （1）人工脑脊液(ACSF, mmol/L)：NaCl 134，KCl 5，NaH 2 PO 4 1.5，MgSO 4 2，CaCl 2 2， NaHCO 3 25，Glucose 10，HEPES 10，pH7.4；使用前通氧气饱和。 （2）K通道标准细胞外液（mmol/L）：NaCl 130，KCl 5.4，CaCl 2 2，MgCl 2 1，Glucose 10，HEPES 10，pH7.3，使用前通氧气饱和； （3）K通道电极内液（mmol/L）：KCl 120，CaCl 2 1，HEPES 10，EGTA 10，Na 2 ATP 3，MgCl 2 2，pH7.2，经0.22滤膜过滤。 2.2. 小鼠大脑皮层神经元急性分离 取出生10天左右的昆明小鼠迅速断头取脑，置于4C人工脑脊液中，一分钟后将脑切成冠状切片，并继续切取皮层组织，厚度约为400左右，放入连续通95%O 2 +5%CO 2 混合气的人工脑脊液中，孵育50分钟。之后加入Pronase，其终浓度为0.36g / L，32C下消化15min。消化结束用 人工脑脊液洗脑片3次，加入盛有人工脑脊 液的离心管中，用4根口径渐小的Pasteur吸管轻轻吹打组织块，制成细胞悬液，静置5min后取上部细胞悬液，放入带有盖玻片的培养皿内，约15～20min后细胞贴壁。分离完整的皮层神经细胞显微镜下观察，形态呈锥体或椭圆形，顶树突和轴突完整，细胞表面光滑，颗粒均匀细腻，它可在6～8小时内保持良好的生理状态 。 2.3. 全细胞膜片钳记录和数据分析 在25C室温下，利用PC2C膜片钳放大器（华中科大）进行全细胞膜片钳记录，实验参数的设置、数据采集和刺激方式的施加均通过软件来控制，采样频率为100kHz。记录用玻璃微电极经两步拉制而成，充灌电极内液后，电极阻抗为1.5～3。当电极与细胞膜之间形成高阻封接（1G）后，将钳制电位调到-80mV，进行快电容补偿后，稍加负压破膜，使电极液与细胞内液相通，再进行慢电容和串联电阻补偿。 实验所用刺激装置由实验室自行研制，先将小鼠的皮层神经细胞分离和贴壁，而后再将得到活性状态较好的细胞放置于脉冲磁场当中，刺激后在进行膜片钳试验，最后将得到的数据和正常的进行对比研究，刺激过程如图1所示。 图 1 脉冲磁场刺激示意图 Fig. 1 Schematic diagram of pulsating magnetic fields irradiation 实验结果分析采用Pclamp软件和Origin7.5统计软件完成，分析结果用MeanSD表示，脉冲磁场刺激前后差异的显著性用单因 数方差分析和检验进行分析，P0.05表示有统计学差异。 3. 结果 3.1. 瞬时外向钾通道电流(I A )的记录 采用上述标准细胞外液和电极内液，且在外液中加入1 TTX 、0.1的CdCl 2 和20的TEA-Cl，记录皮层神经细胞膜上外向钾电流。置钳制电位于-80mV，给予脉冲幅度为-60mV～+50mV，脉冲宽度60ms，步幅+10mV的去极化脉冲刺激电压(图2A)，由于刺激频率与电流的强度大小没有直接关系 ，因此此次实验采用统一的刺激频率为0.025Hz，对得到的数据进行处理。该激活的外向电流即为快速激活和失活的瞬时外向钾电流I A (图2B)。 (A) (B) (C) 图 2 (A) 刺激脉冲 (B) 记录的 I A (C) 曝磁后的 I A Fig. 2 Transient outward potassium current traces (A) Depolarizing steps (B) Transient outward potassium current traces （ C ） Transient outward potassium current traces after magnetic fields exposure 考察正常皮层神经细胞I A 电流随时间变化的特点。给予图2A所示的去极化脉冲刺激，分别在1~6min记录不同时间的I A ，可知I A 在4min基本达到稳定。本试验分别采用加刺激与并未加刺激细胞第四分钟的I A 电流进行比较。 3.2. 脉冲磁场刺激对 I A 时间依赖性的影响 给予与3.1相同的去极化脉冲刺激，分别对磁场照射25min和45min的I A 进行记录，已知I A 在4min基本达到稳定，数据记录应该从此时刻开始进行。为给予不同阶梯去极化脉冲刺激，经磁场作用25min和45min后的I A 电流密度的曲线。由实验结果可知：细胞经过曝磁后，I A 受到明显的抑制，对照组的最大电流密度为213.8041.65pA/pF(n=9, P0.05)，25min照射组最大电流密度为70.2421.92pA/pF(n=6, P0.05) ，45min曝磁组的最大电流密度为49.2810.91pA/pF(n=6, P0.05)。 图 3I A 随时间变化 I-V 曲线 Fig.3Effects of magnetic field irradiation on transient outward potassium currents in different irradiating time. Activation potential of transient outward potassium channel began to shift towards more negative potentials after irradiating for 25 min and 45min ( n =6). 3.3. 脉冲磁场对瞬时外向钾电流 曲线的影响 将未加刺激和加磁场刺激后得到的瞬时外向钾电流数据加以比较，其结果如图4所示。 以不同膜电位（去极化刺激电位）为横轴，该膜电位下激活的I A 电流密度值（电流/膜电容）为纵轴，绘制通道电流的曲线（图4）。对照组和曝磁组的最大激活电流密度分别为213.8041.65pA/pF、67.4622.34pA/pF。由曲线可知，脉冲磁场可以抑制I A 。并且经检验，对照组和脉冲磁场刺激组I A 在统计学上具有显著性差异（n=10, P0.05）。 图 4 对照组、曝磁组 I A 的 曲线 Fig.4 Transient outward potassium currents difference between the control and magnetic field irradiation 3.4. 脉冲磁场对I A 稳态激活特性的影响 给予同3.1中相同的刺激方式，以第四分钟纪录的瞬时外向钾电流作为对照。利用公式将电流值转换成电导值，其中 G 为电导、为测试膜电位，为翻转电位，为不同膜电位下测定的电流峰值。以电导值与最大电导值的比值对应膜电位分别绘制脉冲磁场作用前后I A 的稳态激活曲线（图5）。所得曲线可以用Boltzmann方程拟和，其中为半数激活电压，为曲线的斜率因子。由图5可以看出对照组与脉冲磁场组激活曲线均呈S型，并由此计算出对照组和曝磁组瞬时外向钾通道的半数激活电压分别为13.252.22mV和30.984.11mV（n＝6, P0.05），斜率因子分别为24.002.05mV和23.302.13mV（n=6,P0.05）。由此可知，脉冲磁场作用可明显改变I A 的激活特性，使激活曲线向右移动，并不改变其斜率因子。 图5 对照组、脉冲磁场照射组I A 的激活曲线 Fig. 5 Effects of magnetic field irradiating on steady-state activation kinetics of I A . Currents were elicited with a series of 160 ms step pulses from 60 mV to 50 mV (10 mV increment for each step). Each point represents meanS.D. (n=6). 4. 结论 实验结果表明，频率为15Hz，强度为1.4mT,占空比位50%的脉冲磁场的作用，使小鼠皮层神经细胞膜瞬时外向钾通道电流I A 受到一定的抑制。结果还表明，脉冲磁场的作用可使I A 的激活曲线显著地右移，但其并不改变曲线的斜率因子。据文献 ，神经细胞膜瞬时外向钾离子通道I A 的激活过程受到抑制，会使得电压依赖性钾通道的开放延迟,抑制I A 的激活过程而调节神经细胞的静息电位和兴奋性，延缓神经细胞的去极化过程，加速动作电位的产生。因此可知脉冲磁场作用皮层神经细胞可以改变其瞬时外向钾通道特性，从而影响动作电位的形成和发放频率，调节神经元的生理功能,有利于受损神经元的恢复和再生。 低频脉冲磁场对有机体的作用是一个非线性、瞬态的过程，主要集中在生物膜上。在中枢神经系统，由于对获取的信号存在放大机制，即便采用低频低能脉冲磁场，在毫微秒的瞬间使膜电位发生毫伏量级的细微改变，也可使神经细胞膜电位发生意义深远的变化。神经元的快速信号获取，是典型敏感的膜离子通道关闭或开往，控制膜内外的钠、钾、钙等离子转运。无论是膜两侧离子浓度比之的变化还是电荷穿越质膜迁移所携带的信息，都会改变细胞自身的生理和生化状态。但其具体影响的机理则需要进一步的工作去研究。 参考文献 : MIYAKOSHI.J. Biological responses to extremely low-frequency electromagnetic fields , Journal of Dermatological Science Supplement , 2006,2(1):S23-S30. 徐巧玲，路丽华，罗二平，等. 低强度脉冲电磁场对大鼠骨密度及骨形态计量学的影响 , 第四军医大学学报, 2004,25(21):2004-2006. XU Q L,LU L H,LUO E P, et al .. Effects of low intensity PEMFs on bone mineral density and histomorphometry in SD rats . J Fourth Mil Med Univ ,2004,25(21):2004-2006.(in Chinese) 罗二平，张峰，张建保，等. 低强度脉冲电磁场暴露对小鼠血液流变学指标的影响 , 第四军医大学学报, 2000,21(8):932-934. LUO E P,ZHANG F,ZHANG J B, et al .. Effects of low intensity PEMFs on mouse hemorheology , J Fourth Mil Med Univ, 2000,21(8): 932-934.(in Chinese) 蒋马莉，韩太真. 电磁场对脑发育的影响 , 中国儿童保健杂志, 2003,11(2):114-116. JIANG M L,HAN T ZH. Effects of electromagnetic fields on the growth of brain , Chinese Journal of infants health care ,2003,11(2):114-116.(in Chinese) 邢萱，李怡，王小平,等. 极低频点磁场对中脑神经干细胞体外诱导分化的影响 , 中国临床康复, 2004,8(13):2458-2459. XING X,LI Y,WANG X P, et al .. Effects of extremely low-frequency electromagnetic fields on the induction and differentiation in vitco of midbrain neural stem cells , Chinese Journal of Clinical Rehabilitation , 2004,8(13):2458-2459.( in Chinese) E. BRILLAUD, A. PIOTROWSKI, R. D , et al ..Effect of an acute 900 MHz GSM exposure on glia in the rat brain: A time-dependent study , Toxicology, 2007,238(1):23-33. I. MERAL, H. MERT, N. MERT, Y. DEGER, et al ..Effects of 900-MHz electromagnetic field emitted from cellular phone on brain oxidative stress and some vitamin levels of guinea pigs , Brain Research , 2007,1169(120-124. R. SELVAM, K. G, K. V. S. NARAVANA. RAJU, et al .. Low frequency and low intensity pulsed electromagnetic field exerts its antiinflammatory effect through restoration of plasma membrane calcium ATPase activity , Life Sciences , 2007,80(26):2403-2410. 赵仑，赵德明，魏金河,等. 15Hz 磁场刺激对大鼠局灶性脑创伤影响的实验研究 , 航天医学与医学工程, 2003,16(1):75-76. ZHAO,ZHAO D M,WEI J H, et al .. Effects of extremely low-frequency electromagnetic fields on focal brain injury in rats . Space Medicine Medical Engineering , 2003,16(1):75-76.(in Chinese) 王江，张骅，邓斌. 交变电场作用下细胞膜离子通道电流的趋肤效应 , 天津大学学报, 2004,37(9):792-796. WANG J,ZHANG H,DENG B. Skin effect of currents in trans-membrane ion channels exposes to electric field , Journal of Tianjin University ,2004,37(9):792-796.( in Chinese) Pavan K. Manikonda, P. Rajendra, D. Devendranath, B. Gunasekaran, Channakeshava, R. S. S. Aradhya, R. B. Sashidhar, C. Subramanyam. Influence of extremely low frequency magnetic fields on Ca2+ signaling and NMDA receptor functions in rat hippocampus , Neuroscience Letters, 2007,413(2):145-149. LEI Y, LIU T, WILSON .F. A. W, ZHOU. D, etal .. Effects of extremely low-frequency electromagnetic fields on morphine-induced conditioned place preferences in rats , Neuroscience Letters , 2005,390(2):72-75. 邱纪方. 超低频磁场的生物效应和临床应用 , 中华物理医学与康复杂志, 2002,24(4):439-441. QIU J F. Biological effect clinical application of extremely low-frequency electromagnetic fields , Chin H Phys Med Rehabil , 2002,24(4):439-441.(in Chinese) 王毅，牛金龙，沈强,等. 强脉冲磁场作用于大鼠脑部镇痛效果的初步研究 , 生物医学工程杂志, 2001,18(4):552-553. WANG Y,NIU J L,SHEN Q, etal. . Analgesic effect induced by stimulation of rats brain with strong pulsed magnetic field: a preliminary study , J Biomed Eng , 2001,18(4):552-553.(in Chinese) YUICHIRO HASHIMOTO .M. K. M. S. Effect of static magnetic field on cell migration , Electrical Engineering in Japan , 2007,160(2):46-52. 乔晓艳，李刚，林凌，等. 弱激光对神经元钾离子通道特性影响的实验研究 , 物理学报, 2007,56(4):2448-2454. QIAO X Y, LI G, LIN L ， et al .. Research on characteristics of neuron potassium channel under low laser irradiation , ACTA PHYSICA SINICA, 2007,56(4):2448-2454.(in Chinese) 乔晓艳，李刚，贺秉军. 弱激光对大鼠海马神经元钠通道特性的影响 , 生物化学与生物物理进展, 2006,33(2):178-182. QIAO X Y, LI G, HE B J. Effects of low level laser irradiation on properties of sodium channel in rat hippocampal neurons , Progress in Biochemistry and Biophysics , 2006, 33(2): 178 - 182. (in Chinese) 乔晓艳，李刚，贺秉军，等. 弱激光对神经元瞬时外向钾通道电流特性的影响 , 光学精密工程, 2007,15(3):337-343. QIAO X Y, LI G, HE B J, et al .. Effects of low power laser irradiation on characteristics of transient outward potassium current of neurons , Optics and Precision Engineering , 2007,15(3):337-343.( in Chinese) 乔晓艳，李刚，贺秉军，等. 弱激光对神经细胞膜延迟整流钾通道电流特性的影响 , 中国激光, 2006,33(9):1289-1293. QIAO X Y ,LI G ,HE B J, et al.. Effects of low power laser irradiation on delayed rectifierpotassium current in neuron membrane , CHINESE JOURNAL OF LASERS 2006, 33(9): 1289 - 1293.(in Chinese)
标签: 生物效应
