科学网—标签

相关帖子	版块	作者	回复/查看	最后发表

zhoutianshun 2019-12-1 00:07

2 个 RING 型 E3 泛素连接酶促进 SPX4 的降解，调控水稻磷酸盐稳态和信号途径名称： Two RING-Finger Ubiquitin E3 Ligases Regulate the Degradation of SPX4, An Internal Phosphate Sensor, for Phosphate Homeostasis and Signaling in Rice 第一作者： Wenyuan Ruan 通讯作者：易可可研究员第一单位：中国农科院农业资源与农业区划研究所 DOI ： https://doi.org/10.1016/j.molp.2019.04.003 摘要： SPX 蛋白在植物的无机磷感知，信号传导和转运具有重要的作用。水稻 SPX4 在 Pi 缺乏时大量减少，但其降解机制不清楚。该研究利用 Y 2 H 筛选到两个和 SPX4 降解相关的 RING 型 E3 泛素连接酶蛋白 SDEL1 和 SDEL2 。 SDEL1 和 2 在细胞核和细胞质中均有定位，且具有 E3 泛素连接酶活性。在 Pi 充足条件下， PHR2 与 SDELs 竞争性的和 SPX4 结合，抑制 SPX4 的泛素化降解。在 Pi 充足条件下，过表达 SDLE1/2 提高 Pi 积累并诱导 Pi 饥饿信号传导；而 sdle1/2 突变体降低 Pi 积累并较少 Pi 饥饿信号转导。 SDEL1/2 通过调节 SPX4 蛋白的降解，进一步调节 PHR2 的活性，从而实现水稻外部 Pi 供应时对 Pi 稳态和 Pi 信号传导的调节。前沿： PHRs 蛋白是植物 Pi 信号途径的关键调控因子，可以通过结合到 PSIs 基因（ PHTs 、 miRNA399/827 ）启动子的 P1BS 顺势作用元件上调节对 Pi 饥饿的响应。 SPXs 蛋白负调控 PHRs 蛋白，其 SPX 结构域可以低亲和力地结合 Pi ，高亲和力地结合 IPs ，在高 Pi 或低 IPs 状态下和多种蛋白共同调节 Pi 转运和 Pi 信号。水稻中有 6 个 SPX 蛋白，可以在 Pi 充足时和 PHR 蛋白互作抑制 PHRs 和 PSIs 地结合，抑制 PHRs 的转录和活性。 OsSPX4 可以抑制 PHR2 的质核转移和与 P1BS 基序的结合，但 SPX4 的降解机制尚不清楚。结果： 1、 SDEL1 和 SDEL2 具有 E3 泛素连接酶活性并可以泛素化 SPX4 利用 Y2H 筛选到一个 E3 连接酶 SDEL1 (Os12g35320) ，水稻中具有 5 个同源基因，其中 SDEL2(Os03g22680) 同源性最高。 SDEL1 和 SDEL2 的表达模式和 SPX4 相似，在叶，根，茎，话要和穗中表达。水稻表达数据库和 GUS 报告基因系统表明 SDEL1 和 SDEL2 的转录不响应 Pi 饥饿，但受无 Pi 状态诱导。利用 Y2H ， BiFC 和 Co-IP 进一步验证表明， SDEL1 和 SDEL2 在体内外可以和 SPX4 物理互作，且 SDEL1 、 SDEL2 和 SPX4 均定位在细胞质和细胞核。体外泛素化实验表明：在 E1 和 E2 存在时， SDEL1 具有 E3 泛素连接酶活性（作者未纯化出 SDEL2-His 蛋白）。进一步研究发现， SDEL1 介导 SPX4 的泛素化。 2、 SDEL1 和 SDEL2 调控 SPX4 蛋白的稳定性对 sdel1 、 sdel2 、 OE-SDEL1 、 OE-SDEL2 和 sdel1-sdel2 双突变体（ Pi 缺乏状态下）中 GST-SPX4 蛋白进行细胞外降解实验表明， sdel1 和 sdel2 突变体中 GST-SPX4 蛋白的半衰期长于 WT ，双突变体更显著，而两个过表达株系的 GST-SPX4 蛋白的半衰期显著缩短，表明 SDEL1 和 SDEL2 正调控 SPX4 的降解。当添加 MG132 时， sdel1-sdel2 双突变体的 SPX4 泛素化水平显著降低，而 OE-SDEL1/2 株系中的 SPX4 蛋白的泛素化水平显著升高，表明 SDEL1/2 对 SPX4 蛋白的泛素化至关重要。 3、 SPX4 的 K213 和 K299 赖氨酸残基是 SPX4 的主要泛素化位点 Y2H 表明 SDEL1 可以和 SPX4 的 SPX 结构域互作， SPX4 结构域含有 6 个 α 螺旋结构，其中第 5 和第 6 个是 SPX4 和 SDEL1 互作所必须的。泛素化位点分析表明 SPX4 的 C 端的赖氨酸残基是潜在泛素化靶位点。体外泛素化实验表明 SDEL1 可以泛素化 SPX4 的 K 213 和 K 299 赖氨酸残基。突变掉两个位点后进行蛋白体外降解实验发现，突变后蛋白的半衰期增长，表明 K 213 和 K 299 赖氨酸残基对于 SPX4 降解十分关键。 SDEL1 通过和 SPX4 的 SPX 结构域的第 5/6 个 α 螺旋互作，泛素化 K 213 和 K 299 赖氨酸残基，进而介导 SPX4 的降解。 4、 SPX4-RHR2 复合体抑制 SDEL1 的泛素化作用体外泛素化实验表明， SDEL1 不能泛素化 PHR2 ，且 IPs 的添加不影响 SDEL1 对 SPX4 的泛素化作用，但在 IPs 存在时，随着 PHR2 的增加， SPX4 的泛素化逐渐降低，无 IPs 存在时， PHR2 对 SPX4 的泛素化抑制作用显著降低。 WT 、 phr1phr2 双突变体和 OE-PHR2 中 SPX4 的细胞外降解实验表明， OE-PHR2 中 SPX4 的半衰期显著降低， phr1phr2 中 SPX4 的半衰期增长。 LCI 报告系统实验表明共转 PHR2 时， nLUC-SPX4/cLUC-SDEL1 的荧光信号显著降低。以上表明， PHR2 和 SDEL1 竞争性的与 SPX4 结合。 5、 SDEL1 和 SDEL2 正调控水稻 Pi 积累和 Pi 信号途径在 Pi 充足条件下， OE- SDEL1/2 株系的根和地上部分的 Pi 含量增加，干重下降， PSIs 基因的表达增加； sdel1/2 缺失突变体的生物量下降， PSIs 基因表达降低， sdel1-sedl2 双突变体更明显，表明 SDEL1/2 在生长发育中发挥着关键作用，且正调控水稻 Pi 积累和 Pi 信号途径。讨论： 1、 sdel1-sdel2 双突变体中的 GST-SPX4 稳定，但进一步孵化后还是可以降解，表明存在其他 E3 连接酶调控 SPX4 的降解； 2、 NBIP 调控硝酸盐诱导的 SPX4 的稳定性，那么 SDEL1 和 NBIP 之间是否存在一定的联系，调控 NP 信号途径； 3、水稻中 6 个 SPX 蛋白定位有差异， SPX3/4/5/6 定位在细胞核和细胞质， SPX1/2 定位在细胞核，且均能和 PHR2 互作，是否存在相似的降解模式？需要仅有研究其他 SPXs 蛋白的降解； 4、 SDELs-SPX4-PHRs 的互作模型：在 Pi 充足时， SPX4 和 PHRs 在 IPs 的协助下形成稳定的异源二聚体，阻止 SDELs 对 SPX4 的泛素化降解，于此同时 SPX4-IPs-PHRs 复合体抑制 PHRs 的质核转移，阻止下游基因的激活；在 Pi 缺乏时， IPs 含量下降，导致 PHRs-SPX4 二聚体的解体，积累的 SDELs 泛素化降解 SPX4 ，释放的 PHRs 进入细胞核，与 PSIs 基因启动子上的 P1BS 基序结合，启动下游基因的表达，响应 Pi 饥饿。

个人分类: 论文阅读日记|4997 次阅读|0 个评论

OsSPX4通过与OsPHR2互作负调控水稻控磷酸盐信号和磷酸盐稳态

zhoutianshun 2019-11-28 19:24

OsSPX4通过与OsPHR2互作负调控水稻控磷酸盐信号和磷酸盐稳态名称： SPX4 Negatively Regulates Phosphate Signaling and Homeostasis through Its Interaction with PHR2 in Rice (2016) 第一作者：Qundan Lv, 通讯作者：吴平教授第一单位：浙江大学 DOI ： www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.114.123208 PHR2 是水稻磷信号途径的关键调节因子，在 Pi 缺乏时，可以通过增强 PSIs 基因的表达，提高 Pi 获取。但是 PHR2 不响应 Pi 饥饿，那么 PHR2 是如何被激活去调节适应不同 Pi 状态的呢？近期的研究表明， NRT1.1B-SPX4-PHR2 是 N-P 调控网络的关键分子模块，该论文是 SPX4 和 PHR2 的互作关系证明。前言 At-PHR 通过和 P1BS （ PHR1 结合序列）结合，激活 PSIs 基因表达，磷酸盐剂量性的调节磷饥饿响应，水稻中 Os-PHR2 具有相同的功能。 At-PHR1 和 At-PHL1 (PHR1-like1) 调控分子模块至少存在 3 个 Pi 信号和稳态途径：第一， PHR1 正调控 IPS1 和 miR399 ，从而调控 PHO2 的转录， PHO2 进一步调控 PHO1 蛋白的稳定性，最终介导 Pi 木质部维管束的装载，其中 miR399 介导 PHO2 的剪切，而 IPS1 干扰 miR399 对 PHO2 的靶向作用。第二， At-PHR1 (PHR2) 正调控 miR827 对 SPX-MFS1 和 SPX-MFS2 的剪切作用。第三， PHR2 直接调控 Pi 转运基因，如 PT2 （地下向地上 Pi 转运）。水稻中有 6 个 SPX 家族蛋白，除了 OsSPX4 均正调控 Pi 饥饿反应。水稻 SPX1 , SPX3 和 SPX5 负调控 PHR2 ，但负调控机制和 SPX 功能的差异尚不清楚。结果 1、 SPX4 和 PHR2 互作利用高低 Pi 条件下的水稻 OE-PHR2-FLAG 转基因株系进行 Co-IP 实验，寻找有无磷下的差异蛋白，并用 LC-MS 鉴定，发现了 4 个蛋白，其中有一个为 SPX4 (LOC_Os03g61200) 。利用 Y2H 和 Pull-Down 实验进一步对 SPX4-PHR2 的互作进行验证，表明 SPX4 可以和 PHR2 的 C 端的 MYB-CC 结构域直接互作。 2、 SPX4 负调控 PHR2 OE-SPX4 在正常情况下生长受到抑制，地上部分的 Pi 含量下降， PSIs 显著下降，表明 SPX4 参与维持 Pi 稳态。 OE-PHR2 株系高磷状态下地上部分 Pi 过度积累（老叶出现坏死症状）， PSIs 表达上调，但被 OE-SPX4 导入后抑制。 spx4 突变体高磷状态下生长受到抑制，地上部分 Pi 积累增多 IPS1, miR399 ， miR827 ， PT2 及 PSIs 等 PHR2 下游基因下调，表明 SPX4 通过抑制 PHR2 的活性负调控 Pi 信号。 EMSA 和 ChIP-qRT 实验表明 SPX4 本身不能结合到 P1BS （ -LIKE ）基序，但通过与 PHR2 互作抑制 PHR2 结合到 P1BS 基序上。 3、 SPX4 蛋白的稳定性依赖于细胞内磷酸盐水平 GUS 染色和原位杂交实验表明在高磷状态下， SPX4 主要在根细胞，叶肉和叶维管束中表达，但表达水平在无 Pi 条件下下降。在磷饥饿条件下， SPX4 蛋白的随着时间的正常而不断减少，在添加 Pi 后，又迅速恢复，表明 Pi 饥饿加速 SPX4 蛋白的降解。细胞外降解实验表明， Pi 或者类似物在体外促进 SPX4 的稳定性。 4、 SPX4 蛋白抑制 PHR2 的质核转移 SPX4 定位在质膜和细胞核。 SPX4 和 PHR2 的 BiFC 实验表明， PHR2 可以在细胞核中形成同源二聚体，当 SPX4-GFP 和 PHR2-mCherry 共表达时， PHR2 信号主要在质膜上，核中信号减少。对 WT ， spx4 ， OE-SPX4 不同背景下细胞质和细胞核中的 PHR2 蛋白水平检测，发现 spx4 背景下质膜和细胞核中的 PHR2 蛋白增高，但核中蛋白增加的更加显著； OE-SPX4 背景的细胞核中 PHR2 蛋白显著减少，而细胞质中的 PHR2 含量无显著变化。总结： SPX4 通过抑制 PHR2 的质核转移，抑制 PHR2 对下游 PSIs 的激活作用。在高 Pi 状态下， SPX4 在细胞质和细胞核中与 PHR2 互作，在核中抑制 PHR2 对 PSIs 基因启动子 P1BS 基序的结合能力；在 Pi 缺乏时， SPX4 通过 26S 泛素化蛋白酶体途径降解，降低了对 PHR2 的抑制作用， PHR2 进入核中启动下游 PSIs 基因的表达。

个人分类: 论文阅读日记|4807 次阅读|0 个评论

Nitrate–NRT1.1B–SPX4调控植物的氮磷信号网络

zhoutianshun 2019-11-7 20:43

Nitrate–NRT1.1B–SPX4 调控植物的氮磷信号网络名称： Nitrate–NRT1.1B–SPX4 cascade integrates nitrogen and phosphorus signalling networks in plants 期刊： Nature Plants 作者及单位：胡斌…储成才研究员（中科院遗传与发育研究所） DOI ： 10.1038/s41477-019-0384-1 研究背景氮磷是植物需求最多的两种矿质营养素，也是农业生产利用最多的肥料。研究表明，不同的 N/P 供应比影响 NP 的吸收，高氮磷比可以有效促进 P 的吸收，但其分子机理尚未可知。氮磷信号之间是否存在互作？有，又是如何整合氮磷信号的呢？研究结果 1、硝酸盐通过激活磷信号途径协调氮磷利用率低硝酸盐状态下，高磷酸盐供应不影响水稻生长和生物量，磷饥饿诱导基因 (phosphate starvation-induced genes ， PSIs) 受到抑制。高硝酸盐状态下促进水稻生长和生物量增加，磷酸盐吸收增强，磷酸转运基因 (phosphate transporter genes , PTs) 和 PSIs 表达升高。且短期硝酸盐可以诱导 PTs 和 PSIs 的表达，表明硝酸盐可以直接激活磷饥饿信号，协调 N-P 平衡，促进生长。 a. 中花 11 在不同 NP 状态下的生长表现； b. 不同 NP 状态下的中花 11 的生物量； c. 不同 NP 状态下 Pi 摄取活性； d. PSIs 的硝酸盐诱导实验 2、硝酸盐引发磷信号需要 NRT1.1B nrt1.1b 突变体的 PSIs 不受硝酸盐诱导，而 NRT1.1B-OE 株系中， P 含量和 PSIs 表达量上升，表明 NRT1.1B 的功能缺失影响硝酸盐引发的磷信号。长期培养时，高硝酸盐条件下供应高磷酸盐并不能显著促进生物量的累计；高磷酸盐高硝酸盐条件下 nrt1.1b 突变体的生长迟缓更显著。田间实验表明， nrt1.1b 突变体叶鞘、叶片和茎中的硝酸盐含量显著下降。这些表明硝酸盐激活的磷酸盐响应依赖于 NRT1.1B 。 a. WT 和 nrt1.1b 突变体根中磷酸盐响应基因的硝酸盐诱导实验； WT 和 nrt1.1b 突变体在不同 NP 条件下的生长表现 (b) 和生物量 (c) ； 3、硝酸盐通过 SPX4-PHR2 诱导 PSIs 的表达硝酸盐不诱导 SPX4 基因的转录，但使蛋白积累减少，且蛋白降解过程受 MG132 （ 26S 蛋白酶抑制剂）的抑制，暗示蛋白时发生了泛素化降解。此外，硝酸盐促进 PHR2 蛋白定位从细胞质向细胞核中转移。 SPX4 -OE 和 phr2 突变体中，硝酸盐诱导的磷酸盐信号和 PSIs 基因受到抑制，表明 SPX4-PHR2 介导硝酸盐诱导的磷酸盐信号. a. WT 根中 SPX4 的硝酸盐诱导实验 ; b. 水稻原生质体中硝酸盐处理后 eGFP-SPX4 的荧光信号； c. SPX4–FLAG- OE 株系中硝酸盐处理后根 SPX4–FLAG 蛋白水平； d. 水稻原生质体中硝酸盐处理后 eGFP-PHR2 的亚细胞定位； e. 水稻原生质体中共转 SPX4 硝酸盐处理后 eGFP-PHR2 定位的影响 4、 NRT1.1B 介导硝酸盐引发的 SPX4 降解，且硝酸盐促进 NRT1.1B-SPX4 互作共表达 NRT1.1B 可以降低 eGFP-SPX4 的荧光强度， eGFP-SPX4 蛋白显著降低，且蛋白降解过程受 MG132 抑制； nrt1.1b/SPX4-RNAi 株系中 PSIs 表达上调。表明 NRT1.1B 部分介导 SPX4 的降解。体内体外 NRT1.1B-SPX4 互作验证实验（ pull-down ， co-IP ， LCI ）表明 NRT1.1B 与 SPX4 互作，且硝酸盐可以增强互作； NRT1.1B 的 His356 位点突变株系中， NRT1.1B-SPX4 互作受阻。这表明 NRT1.1B-SPX4 存在物理互作，且互作受硝酸盐的获取影响。 a. NRT1.1B 对 eGFP-SPX4 荧光强度的影响 b. 共表达 MYC–NRT1.1B 对 eGFP-SPX4 蛋白积累的影响 c. 硝酸盐诱导后 WT 和 nrt1.1b 突变体中 SPX4–LUC 的相对活性 d. 硝酸盐诱导后 WT, nrt1.1b 和 nrt1.1b/SPX4-RNAi (Ri) 根中磷酸盐响应基因的表达量 e. 有/无硝酸盐时 GST–SPX4 与 NRT1.1B–eGFP-OE 细胞裂解物的 Pull-down 实验 f. NRT1.1B-eGFP 和 SPX4-FLAG 的 Co-IP 实验 g. SPX4–nLUC 和 cLUC–NRT1.1B 的 LCI 实验 h. SPX4–nLUC 和 cLUC–NRT1.1B / cLUC–NRT1.1B H362A 的 LCI 实验 5、 SPX4 通过调节 NLP3 的质 - 核转移参与硝酸盐信号途径 OsNLP3 是 AtNLP7 的直系同源基因，其核定位受硝酸盐调控， nlp3 突变体中硝酸盐响应基因诱导受阻，表明 NLP3 参与硝酸盐信号。 LCI 和 co-IP 表明 SPX4 与 NLP3 互作，共表达 SPX4 抑制 NLP3 的质 - 核转移， OE- SPX4 中硝酸盐响应基因表达受到抑制。 SPX4-OE 与 nlp3 突变体的 N 摄取能力降低。这些表明 SPX4 通过 NRT1.1B 参与硝酸盐信号，并通过硝酸盐信号转导途径中的 NLP3 激活下游硝酸盐响应基因。 a. SPX4–nLUC 和 cLUC–NLP3 的 LCI 实验 b. eGFP–SPX4 和 NLP3–FLAG 的 Co-IP 实验 c. 硝酸盐诱导后 SPX4 对 eGFP–NLP3 亚细胞定位的影响 d. WT 和 SPX4-OE 根中硝酸盐响应基因的硝酸盐诱导实验 e. 有 / 无 NRT1.1B 条件下，硝酸盐对 SPX4–NLP3 互作的影响 6、 NRT1.1B 招募 E3 泛素连接酶介导 SPX4 降解利用 IP-MS 鉴定到 NRT1.1B 结合蛋白 1 （ NBIP1 ），是定位在质膜的 E3 泛素连接酶，其表达模式与 NRT1.1B 和 SPX4 相似。 NBIP1 的表达受低磷和高硝酸盐处理诱导， NBIP1- OE 中 PSIs 和硝酸盐诱导基因表达均上调，磷酸盐含量显著提高，表现出磷酸盐中毒性状（ spx4 也有）。 Co-IP 实验表明， NRT1.1B 、 NBIP1 和 SPX4 在体外可以形成复合体，无 NRT1.1B 时， NBIP1 和 SPX4 存在微弱的互作。体外泛素化实验表明， NBIP1 具有 E3 泛素化连接酶活性，且能显著减少 WT 中 eGFP-SPX4 蛋白的积累，而 nrt1.1b 突变体中该过程受到抑制。表明硝酸盐存在时， NRT1.1B 招募 NBIP1 泛素化降解 SPX4 。 NRT1.1B–NBIP1–SPX4 分子模块整合了硝酸盐和磷酸盐信号网络，包括硝酸盐获取 (NRT1.1B) ，信号转导 (NRT1.1B–NBIP1–SPX4–PHR2/NLP3) 及硝酸盐 / 硝酸盐响应 ( 硝酸盐 / 磷酸盐响应基因的表达调控 ) 。 a. NBIP1–eGFP 的亚细胞定位 b. 无硝酸盐时， WT 和 NBIP1-OE 根中硝酸盐 / 磷酸盐响应基因的表达 c. eGFP–SPX4 、 NBIP1–FLAG 和 MYC–NRT1.1B 的 co-IP 验证 d. 体外跨膜结构域截断 NBIP1 的自泛素化实验 e. NBIP1 T 对 GST–SPX4 泛素化作用的体外检测 f. 共表达 NBIP1–FLAG 时， eGFP–SPX4 的蛋白水平。总结建立了磷酸盐和硝酸盐的互作网络。硝酸盐信号首先被 NRT1.1B 感知，接着加强 NRT1.1B ， SPX4 和 NBIP1 三者之间的互作，加快 SPX4 的泛素化降解，促进 PHR2 和 NLP3 的质核转移激活硝酸盐和磷酸盐的响应基因，最终实验 N-P 平衡。？： 1、聚合 NRT1.1B indica 和 spx4 是否能进一步提高水稻产量和 N\\P 的利用率？ 2、 P 和氨态氮信号之间是否也具有相似的联系？ 3、除了 SPX4 之外，是否还有 NP 网络枢纽？希望大家可以指出错误的地方，提更多的问题或者解答问题，谢谢！

个人分类: 论文阅读日记|5670 次阅读|0 个评论

帐号		自动登录	找回密码
密码			注册

关闭安全验证

标签: SPX4

相关帖子

相关日志

关闭 安全验证

标签: SPX4

相关帖子

相关日志

关闭安全验证