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2个RING型E3泛素连接酶促进SPX4的降解，调控水稻磷酸盐稳态和信号途径: zhoutianshun 2019-12-1 00:07; 2 个 RING 型 E3 泛素连接酶促进 SPX4 的降解，调控水稻磷酸盐稳态和信号途径名称： Two RING-Finger Ubiquitin E3 Ligases Regulate the Degradation of SPX4, An Internal Phosphate Sensor, for Phosphate Homeostasis and Signaling in Rice 第一作者： Wenyuan Ruan 通讯作者：易可可研究员第一单位：中国农科院农业资源与农业区划研究所 DOI ： https://doi.org/10.1016/j.molp.2019.04.003 摘要： SPX 蛋白在植物的无机磷感知，信号传导和转运具有重要的作用。水稻 SPX4 在 Pi 缺乏时大量减少，但其降解机制不清楚。该研究利用 Y 2 H 筛选到两个和 SPX4 降解相关的 RING 型 E3 泛素连接酶蛋白 SDEL1 和 SDEL2 。 SDEL1 和 2 在细胞核和细胞质中均有定位，且具有 E3 泛素连接酶活性。在 Pi 充足条件下， PHR2 与 SDELs 竞争性的和 SPX4 结合，抑制 SPX4 的泛素化降解。在 Pi 充足条件下，过表达 SDLE1/2 提高 Pi 积累并诱导 Pi 饥饿信号传导；而 sdle1/2 突变体降低 Pi 积累并较少 Pi 饥饿信号转导。 SDEL1/2 通过调节 SPX4 蛋白的降解，进一步调节 PHR2 的活性，从而实现水稻外部 Pi 供应时对 Pi 稳态和 Pi 信号传导的调节。前沿： PHRs 蛋白是植物 Pi 信号途径的关键调控因子，可以通过结合到 PSIs 基因（ PHTs 、 miRNA399/827 ）启动子的 P1BS 顺势作用元件上调节对 Pi 饥饿的响应。 SPXs 蛋白负调控 PHRs 蛋白，其 SPX 结构域可以低亲和力地结合 Pi ，高亲和力地结合 IPs ，在高 Pi 或低 IPs 状态下和多种蛋白共同调节 Pi 转运和 Pi 信号。水稻中有 6 个 SPX 蛋白，可以在 Pi 充足时和 PHR 蛋白互作抑制 PHRs 和 PSIs 地结合，抑制 PHRs 的转录和活性。 OsSPX4 可以抑制 PHR2 的质核转移和与 P1BS 基序的结合，但 SPX4 的降解机制尚不清楚。结果： 1、 SDEL1 和 SDEL2 具有 E3 泛素连接酶活性并可以泛素化 SPX4 利用 Y2H 筛选到一个 E3 连接酶 SDEL1 (Os12g35320) ，水稻中具有 5 个同源基因，其中 SDEL2(Os03g22680) 同源性最高。 SDEL1 和 SDEL2 的表达模式和 SPX4 相似，在叶，根，茎，话要和穗中表达。水稻表达数据库和 GUS 报告基因系统表明 SDEL1 和 SDEL2 的转录不响应 Pi 饥饿，但受无 Pi 状态诱导。利用 Y2H ， BiFC 和 Co-IP 进一步验证表明， SDEL1 和 SDEL2 在体内外可以和 SPX4 物理互作，且 SDEL1 、 SDEL2 和 SPX4 均定位在细胞质和细胞核。体外泛素化实验表明：在 E1 和 E2 存在时， SDEL1 具有 E3 泛素连接酶活性（作者未纯化出 SDEL2-His 蛋白）。进一步研究发现， SDEL1 介导 SPX4 的泛素化。 2、 SDEL1 和 SDEL2 调控 SPX4 蛋白的稳定性对 sdel1 、 sdel2 、 OE-SDEL1 、 OE-SDEL2 和 sdel1-sdel2 双突变体（ Pi 缺乏状态下）中 GST-SPX4 蛋白进行细胞外降解实验表明， sdel1 和 sdel2 突变体中 GST-SPX4 蛋白的半衰期长于 WT ，双突变体更显著，而两个过表达株系的 GST-SPX4 蛋白的半衰期显著缩短，表明 SDEL1 和 SDEL2 正调控 SPX4 的降解。当添加 MG132 时， sdel1-sdel2 双突变体的 SPX4 泛素化水平显著降低，而 OE-SDEL1/2 株系中的 SPX4 蛋白的泛素化水平显著升高，表明 SDEL1/2 对 SPX4 蛋白的泛素化至关重要。 3、 SPX4 的 K213 和 K299 赖氨酸残基是 SPX4 的主要泛素化位点 Y2H 表明 SDEL1 可以和 SPX4 的 SPX 结构域互作， SPX4 结构域含有 6 个 α 螺旋结构，其中第 5 和第 6 个是 SPX4 和 SDEL1 互作所必须的。泛素化位点分析表明 SPX4 的 C 端的赖氨酸残基是潜在泛素化靶位点。体外泛素化实验表明 SDEL1 可以泛素化 SPX4 的 K 213 和 K 299 赖氨酸残基。突变掉两个位点后进行蛋白体外降解实验发现，突变后蛋白的半衰期增长，表明 K 213 和 K 299 赖氨酸残基对于 SPX4 降解十分关键。 SDEL1 通过和 SPX4 的 SPX 结构域的第 5/6 个 α 螺旋互作，泛素化 K 213 和 K 299 赖氨酸残基，进而介导 SPX4 的降解。 4、 SPX4-RHR2 复合体抑制 SDEL1 的泛素化作用体外泛素化实验表明， SDEL1 不能泛素化 PHR2 ，且 IPs 的添加不影响 SDEL1 对 SPX4 的泛素化作用，但在 IPs 存在时，随着 PHR2 的增加， SPX4 的泛素化逐渐降低，无 IPs 存在时， PHR2 对 SPX4 的泛素化抑制作用显著降低。 WT 、 phr1phr2 双突变体和 OE-PHR2 中 SPX4 的细胞外降解实验表明， OE-PHR2 中 SPX4 的半衰期显著降低， phr1phr2 中 SPX4 的半衰期增长。 LCI 报告系统实验表明共转 PHR2 时， nLUC-SPX4/cLUC-SDEL1 的荧光信号显著降低。以上表明， PHR2 和 SDEL1 竞争性的与 SPX4 结合。 5、 SDEL1 和 SDEL2 正调控水稻 Pi 积累和 Pi 信号途径在 Pi 充足条件下， OE- SDEL1/2 株系的根和地上部分的 Pi 含量增加，干重下降， PSIs 基因的表达增加； sdel1/2 缺失突变体的生物量下降， PSIs 基因表达降低， sdel1-sedl2 双突变体更明显，表明 SDEL1/2 在生长发育中发挥着关键作用，且正调控水稻 Pi 积累和 Pi 信号途径。讨论： 1、 sdel1-sdel2 双突变体中的 GST-SPX4 稳定，但进一步孵化后还是可以降解，表明存在其他 E3 连接酶调控 SPX4 的降解； 2、 NBIP 调控硝酸盐诱导的 SPX4 的稳定性，那么 SDEL1 和 NBIP 之间是否存在一定的联系，调控 NP 信号途径； 3、水稻中 6 个 SPX 蛋白定位有差异， SPX3/4/5/6 定位在细胞核和细胞质， SPX1/2 定位在细胞核，且均能和 PHR2 互作，是否存在相似的降解模式？需要仅有研究其他 SPXs 蛋白的降解； 4、 SDELs-SPX4-PHRs 的互作模型：在 Pi 充足时， SPX4 和 PHRs 在 IPs 的协助下形成稳定的异源二聚体，阻止 SDELs 对 SPX4 的泛素化降解，于此同时 SPX4-IPs-PHRs 复合体抑制 PHRs 的质核转移，阻止下游基因的激活；在 Pi 缺乏时， IPs 含量下降，导致 PHRs-SPX4 二聚体的解体，积累的 SDELs 泛素化降解 SPX4 ，释放的 PHRs 进入细胞核，与 PSIs 基因启动子上的 P1BS 基序结合，启动下游基因的表达，响应 Pi 饥饿。; 个人分类: 论文阅读日记|4973 次阅读|0 个评论

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