经常有一些老师和同学咨询这个问题，实际上这个具体方法已经在日本 07 年的文章中有比较详细的介绍。但有一些细节可能大家一下子无法掌握。我这里把这个内容进行介绍一下，但提醒大家注意，如果将来在写文章的时候不要忘记在致谢中注明是我告诉你们的具体方法。 这个方法具体的操作为： 首先是制备含不同气体的培养基 。二氧化碳、氧气和氢气。为什么要制备含不同气体的培养基？因为这个培养体系需要密闭，为什么需要密闭，主要是避免发生严重爆炸的危险。由于氢气的燃烧能按照体积计算是非常小的，只要把含氢气的系统体积缩小，就没有发生破坏性爆炸的危险了。如何制备含不同气体的培养基，最简单的方式是把培养基放在一个密闭的软袋内，只需要充满 2/3 的体积，另外 1/3 用相应的气体充满。这个袋子的气密性一定要足够好。然后把这个袋子放在加压舱内加压到 4 个压力 4 个小时。如果没有条件，可以把这个袋子的溶液减少到 1/2 ，气体相应增加。放在 4 度冰箱内放 24 小时以上。为了获得更好的气体溶液，可以更换几次气体。 其次要制作一个密闭的小培养环境。 可以买一个密封盒，大小以放入一个培养扳为标准。下面放一些水和纱布，以保持盒子内的湿度，用三个管子分别连接二氧化碳、氧气和氢气，根据需要通入一定体积的气体。其中二氧化碳的浓度是 5% ，氧气与氢气根据需要调整。至于如何把气体换到这个盒子内，我建议先用一个气体混合袋子，内部根据比例把三种气体混合，然后用这个气体给密封盒进行换气。主要的危险就在这个阶段，一定要避免发生爆炸。 能不能直接把含氢气的培养基根据需要换到细胞内观察效应。这要根据情况 ，由于气体在液体中很容易释放到空气中，培养基内的氢气浓度就随着时间延长而改变，无法进行比较准确的剂量效应观察。当然如果效应观察时间相对比较短，例如 6 小时以内，这样做也是可以的。尽管不够准确，但要知道动物和人体实验体内的氢气的浓度也是动态改变的，作用的时间比较短，甚至比培养体系内的变化更快。如果使用这种方法，制备含氢气的培养基（方法同上）就是唯一要做的准备工作了，目前国内许多实验室都采用这种方法，如果让我说是可以的，至少在国际上发表论文是没有问题的。 采用开放系统的方法一定要注意培养基深度的影响。 由于气体从液体中总体释放速度主要决定于体积与释放面积的比，那么培养基的深度就是一个非常重要的影响因素了。因此一定要保持各组之间的培养基深度尽量要一致。 以下是来自《 Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals 》693页方法中的内容： Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively-nature med 2007.pdf Hydrogen treatment of cultured cells. Over a 2-h period, we dissolved H2 beyond saturation levels into DMEM medium under 0.4 MPa pressure. We dissolved O2 into a second medium by bubbling O2 gas at the saturated level (42.5 mg/l), and CO2 into a third medium by bubbling CO2 gas. All three media were maintained at atmospheric pressure. We then combined the three media (H2 medium:O2 medium:CO2 medium) in the proportion 75%:20%:5% (vol/vol/vol) and added fetal bovine serum (FBS) to achieve a final concentration of 1%. For culture, we put the combined medium into a culture flask and immediately examined H2 or O2 concentration with an H2 or O2 electrode. Then we filled the culture flask with mixed gas consisting of 75% H2, 20% O2 and 5% CO2 (vol/vol/vol) and cultured cells in the closed culture flask. We prepared degassed medium lacking H2 by stirring the medium, which had been saturated with H2, in an open vessel for 4 h, and checked the concentration of H2 with a hydrogen electrode. In the experiments on the dose dependence of H2 (results shown in Fig. 2f ), we diluted the combined medium with a fourth medium containing 1% FBS equilibrated with air containing 5% CO2 , in orde rto obtain the desired concentration of H2; we then filled the culture flasks with the mixed gas diluted with air containing 5% CO2.
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