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外行看世界（三）电泳: qianlivan 2016-10-11 10:33; 中学时候化学课就学过电泳，但是我从来没跑过电泳。我老婆是生物实验室的小工，倒是经常跑电泳。有时候我和她就会说点电泳，比如今天，我和她说，你们那个实验不就是兑点水么？她马上反驳，水怎么行，要用缓冲液，用水配的胶，跑一下就化了。以前我也听她这么说过，没在意，今天我就忽然有点没想明白，这是为啥？我问她缓冲液的电阻大还是水的电阻大，她说缓冲液有离子，应该电阻小。我又问，电泳的电压不变还是电流不变？她说，电压不变。这我就更迷糊了。这样子发热量不是更大么？转头一想，事情挺复杂的，虽然发热量增加，但是离子也会使电导率增加，还会影响胶本身的性质，所以也可以理解吧。; 个人分类: 思考|2065 次阅读|0 个评论

文章发表: chemxzq 2013-11-18 13:04; Xiaoxue Ye, Satomi Mori, Zhongqi Xu , Shinjiro Hayakawa, Takeshi Hirokawa, DNA aggregation and cleavage in CGE induced by high electric field in aqueous solution accompanying electrokinetic sample injection, Electrophoresis 2013, 34, 3155-3162.; 2391 次阅读|0 个评论

[转载]Fermentas RNA电泳疑难解答指南: charles08 2013-5-9 17:35; 1. RNA条带不可见 1.1. 染色不充分。电泳前，选用2X RNA Loading Dye处理普通型RiboRuler? RNA ladder和RNA样本。该溶液含有足量的溴化乙啶，可在变性甲醛琼脂糖凝胶中染色RNA。即用型RiboRuler? RNA ladders预先与2X RNA Loading Dye混合。非变性琼脂糖凝胶电泳分离RNA时，电泳后需溴化乙啶染色凝胶(终浓度0.5 μg/ml)。变性glyoxal/DMSO琼脂糖凝胶电泳分离RNA时，电泳后先用0.5 M ammonium acetate(醋酸铵) 配制的溴化乙啶溶液(终浓度0.5 μg/ml)染色凝胶15-30分钟，再用新的0.5 M醋酸铵溶液洗涤凝胶15-30分钟。变性聚丙烯酰胺/尿素凝胶电泳分离RNA时，染色前先将凝胶浸入1X TBE缓冲液中15分钟除去尿素，再用1XT BE配制的溴化乙啶溶液(终浓度0.5 μg/ml)染色15分钟。 1.2. 无染色。如果上样染料不含溴化乙啶，则在凝胶和缓冲液中加入溴化乙啶(终浓度0.5 μg/ml)。另外电泳后也可将凝胶浸入溴化乙啶溶液(终浓度0.5 μg/ml)20分钟，或用SYBR? Green II染色(遵照生产商推荐)。 1.3. Ladder上样量不够。按照RiboRuler? RNA ladders产品质检报告推荐的上样量(普通型包装：0.25 μl/mm凝胶泳道宽度；即用型包装：0.5 μl/mm凝胶泳道宽度)。 1.4. RNA降解。减少RNA在UV灯下的曝光时间，因为其会导致RNA降解/黯淡。 RNA，包括RiboRuler? RNA ladders，对核酸酶非常敏感，易于降解。推荐选用新鲜配制的电泳缓冲液和凝胶、DEPC-处理溶液和防护手套。 1.5. 凝胶中RNA扩散。避免长时间电泳、过量染色和过量脱色，否则会引起小分子RNA在凝胶中扩散。避免照相前长时间保存凝胶，因为其会导致RNA片段扩散和条带褪色。 1.6. RNA跑出凝胶。当溴酚蓝电泳至凝胶长度的2/3时，停止电泳。在大多数变性琼脂糖凝胶中，溴酚蓝的电泳迁移率与比5S rRNA稍快，而二甲苯青FF的电泳迁移率比18S rRNA稍慢。确保电泳槽完全水平放置。 2. 弥散的RNA条带 2.1. RNA受核酸酶降解。 RNA，包括RiboRuler? RNA ladders，对核酸酶非常敏感，易于降解。推荐选用新鲜配制的电泳缓冲液和凝胶、DEPC-处理溶液和防护手套。 2.2. RNA ladders的保存条件和使用方法不正确。 RiboRuler? RNA ladders在-20°C可保存6个星期，-70°C可保存24个月。Ladders冰上解冻。 2.3. 凝胶厚度过大或者样品上样体积过大。选用薄的(~0.5 cm)凝胶，避免泳道中样本上样体积过大。 2.4. 电泳条件不正确。确保电泳槽中的缓冲液完全浸没凝胶。电泳时电压不能太高，琼脂糖凝胶电场强度为5 V/cm(聚丙烯酰胺/尿素凝胶为8 V/cm)。为使电泳条带更窄，电泳开始时先用低电压电泳几分钟。但是，全程低电压电泳会导致条带弥散。 2.5. 凝胶中RNA ladder上样过量。按照RiboRuler? RNA ladders产品质检报告推荐的上样量(普通型包装：0.25 μl/mm凝胶泳道宽度；即用型包装：0.5 μl/mm凝胶泳道宽度)。 2.6. 缓冲液未完全浸没凝胶。确保电泳装置中有足量的电泳缓冲液。 3. 非典型电泳带型 3.1. Ladder未有效变性。所有RiboRuler? RNA ladders在上样前需70°C加热10分钟、冰浴3分钟后短暂离心处理，确保RNA完全变性。样本RNA也要采用同样的处理方法。 3.2. 凝胶制备不理想。旧的甲醛pH为酸性，凝胶电泳会产生多余RNA条带。选用新鲜的甲醛以获得最佳效果。 3.3. RNA ladder和样本的上样条件不同。 RNA ladder和样本RNA必须使用相同的上样染料，在相同的条件下上样。总RNA样本电泳(含溴化乙啶)后，28S和18S的人rRNA在UV照射下清晰可见。快速迁移条带5.8S RNA和5S RNA也能清晰可见(与RNA纯化方法有关)。28S RNA条带亮度大约是18S RNA条带亮度的两倍。 28S的人rRNA条带迁移率与5000 b接近，18S的人rRNA条带迁移率与1900 b接近。 3.4. 电泳条件不正确。电泳时间过长，小分子RNA片段易跑出凝胶。电泳时间过短，条带不能完全分离。琼脂糖凝胶电泳的电场强度推荐为5 V/cm(聚丙烯酰胺/尿素凝胶电场强度为8 V/cm)。电泳直到溴酚蓝迁移至凝胶长度2/3位置时才停止。 TAE缓冲液推荐用于分析大片段RNA分子；TBE缓冲液推荐用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和小于1500 b的RNA片段分析。正确的凝胶浓度对RNA ladder的优化分离非常重要。考虑以下因素： RiboRuler? High Range RNA Ladder 可选以下凝胶和缓冲液系统：非变性0.8-1.5%琼脂糖凝胶，TAE缓冲液变性甲醛0.8-1.5%琼脂糖凝胶，MOPS缓冲液变性glyoxal/DMSO 0.8-1.5%琼脂糖凝胶，磷酸钠缓冲液 RiboRuler? Low Range RNA Ladder 可选以下凝胶和缓冲液系统：非变性1.7-2.5%琼脂糖凝胶，TAE缓冲液变性甲醛1.7-2.5%琼脂糖凝胶，MOPS缓冲液变性glyoxal/DMSO 1.7-2.5%琼脂糖凝胶，磷酸钠缓冲液变性4-8%聚丙烯酰胺凝胶，TBE缓冲液 3.5. RNA ladder和样本中溴化乙啶浓度未优化。选用2X RNA Loading Dye上样电泳后，无需额外染色即可在变性琼脂糖凝胶中观察RNA。不推荐在RNA ladder和样本中另外加入溴化乙啶，否则会导致RNA向阴极迁移。非变性琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺/尿素凝胶分离RNA时，推荐在电泳后增加溴化乙啶染色过程。 3.6. 缓冲液未完全浸没凝胶。确保电泳装置中有足量的电泳缓冲液。 4. 高背景染色 4.1. 溶液中溴化乙啶浓度过高或者染色时间过长。溴化乙啶的终浓度推荐为0.5 μg/ml。避免凝胶长时间染色。 4.2. 脱色不充分。如果凝胶经溴化乙啶染色过量，建议增加水洗涤脱色过程，除去背景染色。凝胶染色后用新的0.5 M醋酸铵溶液洗涤glyoxal/DMSO琼脂糖凝胶15-30分钟。 5. 凝胶染色不均匀 5.1. 染色条件不正确。溴化乙啶的电泳方向与RNA相反。如果只在琼脂糖凝胶中加入溴化乙啶(电泳缓冲液中无溴化乙啶)，可能会导致RNA片段的不均匀染色。如果用2X RNA Loading Dye处理RiboRuler? RNA ladders和RNA样本，电泳后无需额外的染色过程，因为上样染料中含有足量的溴化乙啶，可染色变性甲醛琼脂糖凝胶中的RNA。对于非变性琼脂糖凝胶，溴化乙啶(0.5 μg/ml)需同时加入琼脂糖凝胶和电泳缓冲液中，确保电泳时溴化乙啶均匀分布。UV光照射下条带亮度与凝胶中RNA含量成正比。 5.2. 缓冲液未完全浸没凝胶。电泳时确保有足量的电泳缓冲液；电泳和染色时确保缓冲液完全浸没凝胶。 6. RNA在点样孔处残留 6.1. 凝胶点样孔质量差。只有当丙烯酰胺完全聚合后才能移走梳子，然后立即将凝胶浸入缓冲液中。上样前用电泳缓冲液冲洗点样孔，除去变性聚丙烯酰胺凝胶上的尿素。 6.2. 凝胶中RNA上样过量。按照RiboRuler? RNA ladders产品质检报告推荐的上样量(普通型包装：0.25 μl/mm凝胶泳道宽度；即用型包装：0.5 μl/mm凝胶泳道宽度)。 6.3. RNA样本污染。确保您的样本RNA溶液中不含任何沉淀。 7. 定量数据不准确 7.1. RNA不纯。体外转录后，RNA样本中游离的NTPs和断裂的转录子会干扰分光光度计读数，产生不正确的样本RNA定量结果。 RiboRuler? RNA ladders是层析纯化的RNA转录子混合物，无任何NTPs和断裂转录子污染。因此凝胶定量数据与RiboRuler? RNA ladders的分光光度计检测结果相对应。 7.2. 样本定量用RiboRuler?条带选择不正确。选择与样本条带大小接近的Ladder条带为参考，比较分析定量结果。 7.3. RNA ladder和样本的上样条件不一致。样本和Ladder RNA必须在相同的条件下上样电泳。选用配套提供的2X RNA Loading Dye制备样本和Ladder上样混合物。样本RNA和Ladder RNA等体积上样。样本RNA上样体积可以通过加入1:1混合的DEPC处理水(#R0601)和2X RNA Loading Dye混合液来调整。 7.4. 定量方法不正确。如果可能的话，定量时选用视频密度计量仪。该方法可以扣除凝胶背景，比肉眼观测比较条带亮度方法的准确性更高。 7.5. 凝胶染色不均匀和高背景染色都会干扰凝胶定量结果(见上述问题4和5)。; 个人分类: 科研资源|4520 次阅读|0 个评论

[转载]Fermentas DNA电泳疑难问题解答指南: charles08 2013-5-9 17:35; 1. 所有或某些DNA条带不可见或黯淡 1.1. 分子量标准上样量不够。遵照或DNA ladders/markers质检分析报告的推荐上样用量(~0.1-0.2 μg/mm宽凝胶泳道)。 1.2. 染色不充分或不均匀。凝胶电泳后，溴化乙啶溶液(终浓度0.5 μg/ml)或SYBR? Green I染色观察DNA。如果凝胶中的DNA无需回收克隆使用，可以在凝胶和电泳缓冲液中同时加入溴化乙啶，终浓度为0.5 μg/ml。碱性琼脂糖凝胶电泳后，将凝胶浸入300 ml 0.5 M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中处理30分钟，然后再用0.5 μg/ml溴化乙啶溶液染色30分钟。变性聚丙烯酰胺/尿素凝胶电泳后，将凝胶浸入1X TBE缓冲液中15分钟除去尿素。然后再用1X TBE缓冲液配制的溴化乙啶溶液(终浓度0.5 μg/ml)染色15分钟。确保凝胶完全浸没在染色液中。 1.3. DNA电泳跑出凝胶。溴酚蓝电泳至凝胶长度2/3(Orange G, 4/5)处时停止电泳。参考p.441表格了解示踪染料在不同凝胶中的迁移情况。电泳过程中，确保凝胶始终浸没在电泳缓冲液中。确保凝胶和电泳装置水平放置。 1.4. 凝胶中DNA条带弥散。避免长时间电泳、过量染色和脱色过程，否则会导致凝胶中小分子DNA片段弥散。凝胶拍照前不能长时间保存，否则会引起DNA片段弥散和条带黯淡。 1.5. DNA条带被电泳示踪染料掩盖。电泳前，与样本DNA和分子量标准混合的上样染料不能过量。选用Fermentas公司的DNA ladder/marker包装中配套的上样染料溶液，因为这些溶液包含平衡化用量的示踪染料。紫外光照射下，DNA条带不会被示踪染料掩盖。 DNA ladders和样本电泳前处理方法请参考使用推荐。 2. 弥散的DNA条带 2.1. 核酸酶降解DNA。电泳缓冲液和凝胶需新鲜配制，选用无核酸酶的试管和枪头，避免核酸酶污染。 2.2. 电泳条件不正确。参照p.442推荐方法制备凝胶，凝胶制备和电泳使用同一种电泳缓冲液。整个电泳过程中，确保凝胶始终浸没在电泳缓冲液中。电泳时，电压不能太高，电场强度建议为5-8 V/cm。为了使条带更窄，电泳刚开始时先用低电压电泳几分钟。高电压(最高达23 V/cm)快速电泳时，选用GeneRuler?或O’GeneRuler? Express DNA ladders(#SM1551/2/3或#SM1563)。整个电泳过程中，电压过低会导致条带弥散。电压过高会使凝胶过热和DNA变性。如需计算优化的电泳条件(电压)和使用推荐的V/cm值(多数情况下为5-8 V/cm，依分子量标准不同而异)，遵照以下计算方式：测量正、负极之间的距离 – X, cm； X, cm值乘以推荐的电压(Y, V/cm)； X (cm) x Y (V/cm)的计算结果就是Z – 实际电泳的推荐电压。 2.3. 凝胶迁移效应。 DNA结合蛋白(如连接酶、磷酸酶、限制酶等)改变DNA的凝胶迁移率，导致DNA停留在点样孔处或产生凝胶迁移。 Lambda DNA或其它含长互补突出末端的DNA可能会退火结合，迁移带型不规范(见为排除上述影响因素，使用添加1% SDS的6X Loading Dye SDS溶液(#R1151)，防止DNA-蛋白相互作用和避免长粘性末端DNA退火结合。电泳前，65°C加热含有SDS的样本10分钟、冰浴、离心后上样。 DNA结合蛋白(如连接酶、磷酸酶、限制酶等)改变DNA的凝胶迁移率，导致DNA停留在点样孔处或产生凝胶迁移。 Lambda DNA或其它含长互补突出末端的DNA可能会退火结合，迁移带型不规范。为排除上述影响因素，使用添加1% SDS的6X Loading Dye SDS溶液(#R1151)，防止DNA-蛋白相互作用和避免长粘性末端DNA退火结合。电泳前，65°C加热含有SDS的样本10分钟、冰浴、离心后上样。 2.4. DNA上样量过大。遵照或DNA ladders/markers质检分析报告的推荐上样用量(~0.1-0.2 μg/mm宽凝胶泳道)。如果可能的话，建议各样本DNA的上样量相同。 2.5. 样本的盐浓度过高。样本中盐浓度过高会产生弥散或漂移的带型。水或TE缓冲液重悬DNA除盐前，可用离心柱纯化或冷冻的75%乙醇沉淀和洗脱DNA。 2.6. 点样孔质量差。梳子插入凝胶时，确保以垂直方式插入。凝胶浇注和固化过程中，梳子不能移动。 3. 带型异常 3.1. Lambda DNA marker上样前未加热。所有从Lambda DNA制备的DNA markers和Lambda DNA酶切产物均需65°C加热5分钟、冰浴处理后才能上样电泳。这样才能确保粘性末端(Lambda DNA的12 nt cos位点)完全变性，否则粘性末端退火时会产生额外条带，见电泳前Lambda markers处理。 3.2. DNA变性。电压太高会使凝胶过热和DNA变性。如需计算优化的电泳条件(电压)和使用推荐的V/cm值(多数情况下为5-8 V/cm，依分子量标准不同而异)，遵照以下计算方式：测量正、负极之间的距离 – X, cm； X, cm值乘以推荐的电压(Y, V/cm)； X (cm) x Y (V/cm)的计算结果就是Z – 实际电泳的推荐电压。非变性凝胶电泳时，使用Fermentas DNA ladder/marker包装中配套提供的上样染料溶液。该类溶液不含变性试剂。电泳前，根据推荐方法处理DNA ladders和样本。只有Lambda DNA markers在电泳上样前需加热处理。 3.3. 样本和Ladder DNA上样条件不同。样本DNA和Ladder/marker DNA在电泳前选用相同的上样染料(DNA ladder/marker包装中配套提供)处理。可能的话，样本DNA和Ladder/marker的上样体积尽量接近。样本用1X loading dye稀释。 3.4. 电泳条件不正确。电泳时间过长或电压过高都会使小分子DNA片段跑出凝胶。电泳时间过短或电压过低则不能将DNA条带完全分离。电泳时，电压不能太高，电场强度建议为5-8 V/cm。为了使条带更窄，电泳刚开始时先用低电压电泳几分钟。高电压(最高达23 V/cm)快速电泳时，选用GeneRuler?或O’GeneRuler? Express DNA ladders (#SM1551/2/3或#SM1563)。 3.5. 凝胶浓度不正确和电泳缓冲液使用不当。 TAE缓冲液推荐用于分析分子量大于1500 bp DNA片段和超螺旋DNA条带；TBE缓冲液推荐用于分析分子量小于1500 bp DNA片段和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。大片段DNA分子在TBE缓冲液中不能完全分离。正确的凝胶浓度对Ladder DNA的优化分离非常重要。凝胶制备请参考使用推荐(p.442)：凝胶制备时需经常调整凝胶溶液的体积(煮沸时水分蒸发)；否则实际配制出来的凝胶浓度偏高，无法有效分离大分子DNA条带。参考了解不同凝胶有效分离的DNA条带分子量范围。溴化乙啶干扰大分子DNA片段分离。大分子DNA(超过20 kb)或超螺旋DNA分析时避免在凝胶和电泳缓冲液中加入溴化乙啶。电泳后溴化乙啶溶液(0.5 μg/ml)染色凝胶30分钟。 3.6. 由于DNA核苷酸序列或结构不同，产生非正常迁移。高分辨率凝胶电泳时，同分子量DNA片段由于序列和结构的差异而有不同的迁移率。富含AT碱基DNA的迁移速度比同分子量大小的富含GC碱基的DNA片段慢。Fermentas公司的DNA ladder可实现由分子量大小决定的精确迁移，但是由于核苷酸序列和结构的差异，样本DNA的迁移率与分子量标准条带的迁移率有时会稍微不同。不同结构的DNA片段(如缺口、超螺旋和二聚体分子)在凝胶中的迁移率与同样大小的分子量标准条带不同。下图为质粒DNA不同构型的迁移情况： GeneRuler? 1 kb DNA Ladder (#SM0311) 未切割的plasmid pUC19 2,7 kb DNA构型：顶部条带(~5 kb) – 二聚体质粒中间条带，条带黯淡(~4 kb) – 含切口的质粒下部条带(~1.9 kb) – 超螺旋质粒线性化的质粒pUC19 (2,7 kb) – 根据分子大小迁移高水平修饰DNA片段(如甲基化、生物素标记、大荧光分子标记等)的电泳迁移率比未修饰同分子量大小的DNA片段低。 3.7. 凝胶迁移效应。 DNA结合蛋白(如连接酶、磷酸酶、限制酶等)改变DNA的凝胶迁移率，导致DNA停留在点样孔处或产生凝胶迁移。 Lambda DNA或其它含长互补突出末端的DNA可能会退火结合，迁移带型不规范。为排除上述影响因素，使用添加1% SDS的6X Loading Dye SDS溶液(#R1151)，防止 DNA-蛋白相互作用和避免长粘性末端DNA退火结合。电泳前，65°C加热含有SDS的样本10分钟、冰浴、离心后上样。此外，样本中盐浓度过高会引起凝胶迁移效应，见3.8。 3.8. 样本中盐浓度过高。样本中盐浓度过高会产生弥散或漂移的带型。水或TE缓冲液重悬DNA除盐前，可用离心柱纯化或冷冻的75%乙醇沉淀和洗脱DNA。 4. 弯曲的DNA条带 4.1. 凝胶未完全浸入缓冲液中。上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全盖住整块凝胶。 4.2. 样本上样体积太小。样本和分子量标准的上样体积不能太少，至少要超过点样孔总体积1/3。少量样本上样时避免选择大的点样孔；如果需要，可添加1X loading dye调整样本体积。 4.3. 电泳条件不正确。电泳时，电压不能太高，电场强度建议为5-8 V/cm。为了使条带更窄，电泳刚开始时先用低电压电泳几分钟。高电压(最高达23 V/cm)快速电泳时，选用GeneRuler?或O’GeneRuler? Express DNA ladders (#SM1551/2/3或#SM1563)。如需计算优化的电泳条件(电压)和使用推荐的V/cm值(多数情况下为5-8 V/cm，依分子量标准不同而异)，遵照以下计算方式：测量正、负极之间的距离 – X, cm； X, cm值乘以推荐的电压(Y, V/cm)； X (cm) x Y (V/cm)的计算结果就是Z – 实际电泳的推荐电压。 4.4. 凝胶或点样孔中有气泡或物理颗粒。制备凝胶时请使用纯水、干净的器皿和制胶装置。浇注凝胶动作要轻，防止产生气泡。一旦产生气泡，用枪头赶走气泡。 5. DNA停留在凝胶点样孔处 5.1. 点样孔质量差。当凝胶完全聚合后才能移走梳子，然后立即倒入缓冲液。上样前，使用电泳缓冲液冲洗点样孔除去变性聚丙烯酰胺凝胶中多余的尿素。 5.2. 凝胶上样量过大。遵照或DNA ladders/markers质检分析报告的推荐上样用量(~0.1-0.2 μg/mm宽凝胶泳道)。如果可能的话，建议各样本DNA的上样量相同。 5.3. DNA样本污染。确保您的样本DNA溶液不含任何沉淀。 5.4. 凝胶迁移效应。 DNA结合蛋白(如连接酶、磷酸酶、限制酶等)改变DNA的凝胶迁移率，导致DNA停留在点样孔处或产生凝胶迁移。 Lambda DNA或其它含长互补突出末端的DNA可能会退火结合，迁移带型不规范。为排除上述影响因素，使用添加1% SDS的6X Loading Dye SDS溶液(#R1151)，防止DNA-蛋白相互作用和避免长粘性末端DNA退火结合。电泳前，65°C加热含有SDS的样本10分钟、冰浴、离心后上样。 6. 定量数据不正确 6.1. 样本和Ladder DNA的上样条件不同。样本DNA和Ladder/marker DNA在电泳前选用相同的上样染料(DNA ladder/marker包装中配套提供)处理。调整样本浓度，使其在凝胶中的含量与分子量最接近标准DNA条带接近。可能的话，样本DNA和Ladder/marker的上样体积尽量接近。样本用1X loading dye稀释。 6.2. 样本定量用分子量标准参考条带不正确。定量时通常以分子量最接近的标准条带为参照物，分析样本条带的含量。 6.3. 定量方法不正确。可能的话，定量时选用视频密度仪。该仪器可扣除凝胶背景，比目测条带方法更精确。 6.4. 凝胶的不均匀染色或背景过高都会干扰凝胶定量结果。确保凝胶完全浸没在染色液中。凝胶电泳后，溴化乙啶溶液(终浓度0.5 μg/ml)或SYBR? Green I染色观察DNA。染料浓度不要超过推荐用量。染色时间不要超过30分钟，否则会导致高背景染色。如果电泳的同时染色凝胶，确保凝胶和电泳缓冲液都含有溴化乙啶，否则染色不均匀。碱性琼脂糖凝胶电泳后，将凝胶浸入300 ml 0.5 M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中处理30分钟，然后再用0.5 μg/ml溴化乙啶溶液染色30分钟。变性聚丙烯酰胺/尿素凝胶电泳后，将凝胶浸入1X TBE缓冲液中15分钟除去尿素。然后再用1X TBE缓冲液配制的溴化乙啶溶液(终浓度0.5 μg/ml)染色15分钟。 6.5. DNA条带被电泳示踪染料掩盖。电泳前，与样本DNA和分子量标准混合的上样染料不能过量。选用Fermentas公司的DNA ladder/marker包装中配套的上样染料溶液，因为这些溶液包含平衡化用量的示踪染料。紫外光照射下，DNA条带不会被示踪染料掩盖。 DNA ladders和样本电泳前处理方法请参考使用推荐; 个人分类: 科研资源|5064 次阅读|0 个评论

[转载]Fermentas 蛋白电泳&分析疑难问题解答指南: charles08 2013-5-9 17:34; Fermentas 蛋白电泳分析疑难问题解答指南 1. 蛋白条带不清晰 1.1. 染色不充分。考马斯亮蓝染色时，每孔(小凝胶)上样~0.5-5μg总蛋白。细胞裂解液电泳时，推荐上样10 μg总蛋白；如果分析同源蛋白，推荐上样1-3 μg。按照操作手册提供方法，PageBlue? Protein Staining Solution (#R0571)的染色灵敏度可达~5 ng/条带。银染时，每孔(小凝胶)上样~0.1-2 ng总蛋白。PageSilver? Silver Staining Kit (#K0681)染色的灵敏度是~0.05-0.6 ng/条带。未预染蛋白分子量标准可经PageBlue? Protein Staining Solution (#R0571)、PageSilver? Silver Staining Kit (#K0681)或其它蛋白染色技术染色观察。 1.2. 凝胶浓度不正确。线性梯度凝胶可分离小分子和大分子蛋白。均质的低浓度凝胶推荐用于分析大分子量蛋白；而高浓度凝胶推荐用于分析小分子量蛋白。高浓度凝胶(14-18%)无法分离大分子蛋白(150-250 kDa)；而低浓度凝胶(4-8%)中小分子蛋白与示踪染料一同迁移，条带不可见。特定分子量蛋白的电泳需选择适当浓度的凝胶，请参考蛋白电泳分析操作方法和使用推荐 (SDS-PAGE)。 1.3. 电泳时间过长。当示踪染料前端迁移到凝胶底部时停止电泳。在低浓度凝胶(4-8%)中，小分子蛋白(10-15 kDa)与示踪染料一同迁移，条带不可见。分离低分子量蛋白请选择高浓度或梯度凝胶。特定分子量蛋白的电泳需选择适当浓度的凝胶，请参考操作方法和使用推荐蛋白电泳分析 (SDS-PAGE)。 1.4. 未遵守上样推荐。遵照蛋白电泳分析操作方法和使用推荐(上样推荐)上样推荐，按要求加热蛋白样本和Unstained Protein Molecular Weight Marker不要加热Fermentas的其它protein ladders/marker。 2. 弥散的蛋白条带 2.1. 蛋白被蛋白酶降解。操作蛋白时使用干净的枪头和试管。抽提蛋白时添加蛋白酶抑制剂。蛋白样本和分子量标准均需-20篊保存。 2.2. 未使用浓缩胶。分离胶顶部的浓缩胶对浓缩蛋白样本和确保蛋白正确迁移形成窄的条带非常重要。遵照蛋白电泳分析操作方法和使用推荐(SDS-PAGE)凝胶制备使用推荐。 2.3. 样本准备方法不正确。为确保电泳时蛋白正确迁移，蛋白样本需含有SDS、二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇且上样前需加热处理。遵照蛋白电泳分析操作方法和使用推荐蛋白样本准备和protein ladders/markers使用推荐。 2.4. 凝胶上样过量。考马斯亮蓝染色和Western杂交时推荐每孔(小凝胶)上样~0.5-5 μg总蛋白。银染时推荐每孔(小凝胶)上样0.1-2 ng总蛋白。Fermentas公司的protein ladder/marker在使用前需稀释50倍，见蛋白电泳分析操作方法和使用推荐。 3. 蛋白大小不正确 3.1. 凝胶浓度不正确使用高浓度凝胶分析小分子蛋白和使用低浓度凝胶分析大分子蛋白。梯度凝胶适合精确鉴定蛋白分子量大小。特定分子量蛋白的电泳需选择适当浓度的凝胶，请见蛋白电泳分析操作方法和使用推荐。 3.2. 分子量大小精确鉴定用Ladder/marker选择不正确。精确鉴定蛋白分子量大小需使用未预染的蛋白Ladders/markers。预染的分子量标准只适合粗略鉴定蛋白分子大小，因为与预染蛋白偶联的生色团会改变蛋白在不同SDS-PAGE缓冲液和凝胶中的电泳迁移率。预染蛋白分子量标准经未预染蛋白标准校准(完全相同的电泳条件)后可用于蛋白分子量大小的粗略鉴定。 3.3. 蛋白分子量大小鉴定方法不正确。凝胶电泳后数码照相保存，然后根据照片中蛋白分子量标准的迁移率创建标准曲线。蛋白标准品的迁移数据可用于绘制标准蛋白分子量及其相对迁移率(Rf)相互关系的曲线图。通常分子量与迁移率的关系可根据公式log (MW) = a + b x Rf计算出来。a和b是常数，由校准用的蛋白标准品决定。未知蛋白的分子量通过替代以上公式中的Rf计算出来。每个凝胶需计算出新的公式，分析多块凝胶可获得统计学结果。 3.4. 样本处理方法不正确为确保电泳时蛋白正确迁移，蛋白样本需含有SDS、二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇且上样前需加热处理。遵照蛋白样本准备和protein ladders/markers使用推荐。 3.5. 样本中盐浓度过高。样本中盐浓度过高会改变蛋白的迁移率。采用凝胶过滤方法除去多余的盐分。 3.6. Ladder/marker校准用电泳条件不正确。 Fermentas预染蛋白分子量标准的表观分子量经传统的Tris-glycine-SDSLaemmli系统校准。每个批号的蛋白Ladder/marker经已知精确大小的未预染Ladder/marker校准(Tris-glycine凝胶)，校准的表观分子量大小请见产品质检报告。但是分子量标准蛋白在不同电泳缓冲液和凝胶中的迁移率有差异。 3.7. 蛋白修饰导致的迁移率差异。天然蛋白的修饰，如磷酸化和糖基化，会改变蛋白的电泳迁移率。修饰蛋白的分子量可能与同分子大小未修饰蛋白的分子量相同，也可能不同。 4. 歪曲的条带 4.1. 电泳时电压过高。电压依赖于电泳的凝胶数量，参考蛋白电泳分析操作方法和使用推荐 (SDS-PAGE)使用推荐选择适当的电压。当染料前端迁移到分离胶时增加电压。 4.2. 缓冲液用量不够电泳槽(底端和顶端溶液池)中添加新鲜配制的1X Tris-glycine-SDS缓冲液，确保缓冲液完全覆盖凝胶点样孔。电泳使用冷的缓冲液。 4.3. 凝胶中含有气泡和物理颗粒。小心混合和浇注凝胶溶液，防止气泡产生。如果溶液含有物理颗粒，建议过滤除去。 5. 蛋白转移未优化 5.1. Western转膜程序不正确。遵照Western杂交转膜使用推荐。Western杂交半干转膜操作方法。确保操作过程中缓冲液始终完全覆盖凝胶/膜/纸。凝胶转膜前不要染色，因为染色蛋白的转膜效率低。使用预染的蛋白分子量标准和DualColor? Protein Loading Buffer Pack (#R1011)可监控电泳进程和蛋白转膜效率。 5.2. 电泳前样本处理方法不正确。为确保电泳时蛋白正确迁移，蛋白样本需含有SDS、二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇且上样前需加热处理。遵照蛋白样本准备和protein ladders/markers使用推荐。 5.3. 转移用膜质量差。 Western杂交需选用高质量PVDF膜。低分子量蛋白转膜时经常会穿透硝酸纤维膜，因此杂交时不可见。 5.4. SDS-PAGE程序错误。遵照蛋白电泳的特殊使用推荐。使用预染蛋白分子量标准监控电泳进程和转膜效率。; 个人分类: 科研资源|3884 次阅读|0 个评论

瑞典纪事: 实验记录DNA提取/PCR/毛细管电泳: zjlcas 2013-2-7 22:30; 以下是在瑞典的实验记录, 之前, 操作都是靠口授心传, 加上自己操作. 我将这些步骤详细记录下来. 共分为: DNA提取(离心柱法), 浓度测定, DNA提取的电泳检验, PCR, PCR产物的凝胶电泳检验,毛细管电泳, 96孔板进行DNA提取以及检验等. 全部内容, 均根据自己所做实验整理而成. 实验一用试剂盒提取植物的全DNA 目的：从针叶或种子提取裸子植物全DNA，用于SSR，Barcoding等进一步分析。准备： 1. 取冰。冰在UPSC 二楼049房间。 2. 将Elution buffer 在65℃烘箱中预热。操作步骤： 1. 每个待提取DNA样品取2枚针叶，在实验记录本上按照统一编号记录，并誊写样品标签上的所有信息。将2 mL圆底离心管按顺序编号，放在32孔板上。取约60mg针叶（Pinus sylvestris两针），剪碎（长宽不超过3mm），放入圆底离心管中。 2. 加入600μL SP1溶液，加入1μL RNase（在4℃冰箱中）和 2粒瓷珠。 3. 在mixer mill上充分破碎，一般2min即可，若未打碎，继续破碎2min。 4. 将圆底离心管放在65℃ 金属浴，10min － 15min ，中间混合1－2次。 5. 加入210μL SP2，放冰上5min。 6. 14000rpm离心，5min。 *7. 取上清液到绿柱子，12000rpm，1min （对于种子，步骤可以省略） 8. 将上清液移到2mL新的圆底离心管，加入1.5倍体积的SP3（一般为500 － 700μL），混合均匀。 9. 将700μL上清液转移到蓝柱子（放在新的无盖离心管中，注意柱子和离心管都要标号）， 12000rpm， 1min，倒掉离心管下的液体。 10. 将第8步剩余的上清液继续转移到蓝柱子，12000rpm，1min，倒掉离心管下的液体。 11. 加入500μL的Washing Buffer到蓝柱子，12000rpm，1min，倒掉离心管下的液体。 12. 重复第11步。 13. 将蓝柱子放回原离心管离心，14000rpm，2min。 14. 取干净的EP管，标号。将蓝柱子放入干净的EP 管中，加入90μL 65℃ Elution Buffer洗脱，等候约4min， 12000rpm，离心1min。 15. 丢弃蓝柱子，将EP管（下面的溶液即为提好的DNA）贴好标签，写上实验纪录上的编号，放入4℃冰箱保存。如果为种子：发芽至外露1－2cm，除去种皮，整粒种子放入2mL圆底离心管。以下程序同。最后洗脱用100μL Elution Buffer。若需要洗脱完全，则考虑用50μL进行第二次洗脱。实验二 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳检测目的：用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取是否成功准备：烘箱65℃，打开操作步骤： 1 在电子天平上称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶。 2 用量筒量取120mLTBE溶液，倒入锥形瓶。 3 将锥形瓶在微波炉中加热三分钟，在沸腾后，轻摇几次，使得琼脂糖全部溶化。 4 放在常温冷却，待65℃左右，（至外边仍然比较烫手，但没有蒸气散出时）。加入8μL EB（溴化乙锭），摇匀。 5 将胶槽两端用不干胶封好，倒入30mL左右的溶液，插入胶孔成型用的梳子，待15到20分钟冷凝。将锥形瓶用多层保鲜膜盖好，并用铝箔封口，放在65℃的烘箱中。 6点 Loading Buffer。每一次取10μL的红色Loading Buffer，分成五份，每个约两μL，点在事先固定在tip盒盖的石蜡膜上。按照样品的数量，点出相应数量的Loading Buffer水珠。 7 点Lambda标准样（试剂公司合成的特定浓度的DNA样品），2μL，若是两排胶孔，应该点两个Lambda标准样。 8 吸取DNA样品，每个吸取2μL，为防止DNA样品的污染，每一次都要换枪头。按照次序点入Loading Buffer水珠中。 9 将胶放置在电泳槽中，令电泳液将其浸入。注意，胶孔一端要放在负极（黑色电极）一端。 10 点样，先在最左侧的胶孔中点入lambda样，将移液器的量程调至4－5μL，按照顺序，吸取水珠，点入胶孔中，此时不必每一次都换枪头。 11 将电泳仪电压调到80－110V之间，电泳15分钟。 12 取胶：先关闭电源，戴上蓝色在Techtum Lab AB凝胶成像系统中拍照。拍照时用MVPILOT软件，点击摄像机的图标，调整对比度和明暗效果，在左侧MITSUBISHI打印机上打印。保存图像时，点击照相机的图标。 13 完成拍照后，将凝胶丢弃，仪器擦拭干净，并保持Techtum Lab AB的门打开。实验三用Nanodrop检测DNA浓度目的： Nanodrop分光光度计测量提取的DNA浓度操作步骤： 1. 双击打开Nanodrop管理界面，点击Nucleic Acid Measurement。将Nanodrop的探测器旋臂抬起，用蒸馏水擦拭干净。 2. 用移液器吸取1μL 双蒸水（量程可调至1.2μL），点在探头上，盖好，点击Initialize按钮。 3. 打开探测器旋臂，用移液器点一滴Elution Buffer（这是由于之前用的是Elution Buffer，待测的DNA溶于什么溶液，就应该用相应的溶液作为本底对照），点击Blank按钮 4. 抬起旋臂，擦拭干净，换枪头，吸取1.2μL的待测样品，点Measure按钮，记录右下角的DNA浓度。 5．依次重复步骤4，直至所有样品的浓度都测定完。实验四 PCR 反应步骤：（1）将引物成对摆放，9对引物一定要两两放在一起，并排号。在冰板上，放置9个 ep排管，用以9个不同的引物体系。因每排管由8个小ep管组成，每个96孔板上只能做8个DNA样品（8 *9 ＝ 72组合）。（2）将待检测模板DNA用ddH2O稀释到10ng /uL ，贴上标签，放在4℃保存。（3）按照DNA样品的数量，计算每对引物各组分的体积。每个组分扩大的倍数，取决于模板DNA的数目（实际情况下的体系的体积倍数要比DNA的数量稍多，每个1.5mL 的ep管内各组分需要到达足够的体积，才能准确量取以及混合）。（4）取9个1.5mL的ep管，分别按照顺序，添加表1中除DNA模板外的组分。表1 16uL PCR反应体系 order Constituents Storage Volume Per PCR Tube × 1 ddH2O RT 11.85uL uL 2 PCR buffer 10× 4℃ 1.6uL uL 3 dNTP (25mM/uL) 4℃ 0.1uL (0.156mM) uL 4 Ordinary Primer (10uM) 4℃ 0.2uL (0.125uM) uL 5 With Dye Primer (10uM) 4℃ 0.2uL (0.125uM) uL 6 TopTaq (5 Unit/uL) －20℃ 0.05uL (0.25unit) uL 分装到各ep管，每管14uL 7 DNA template 2uL (10-20ng) 每个样品吸取2uL 模板DNA Total 16uL （5）将混合好的体系，按照行，分装到同一排管的小ep管中，每个14uL。（6）从稀释过的DNA（约10ng/uL），吸取2uL，按照列，添加到排管的小ep管中。（7）手动混合反应体系，离心。按照所需退火温度不同，分成三组：第一组 LOP1和SsrPt_ctg4363，touch down 温度为 64 – 54℃ 第二组 PtTx3107和PtTX4001，touch down 温度为55－45℃ 第三组PtTX2146，PtTX3025，PtTX3116，SsrPt_ctg1376, SPAC12.5，touch down为60－50℃。 ?（8）每个PCR反应耗时约2－2.5h。注意，PCR仪在最后的延伸完成后，会降到15℃，应该尽快将产物转移到4℃冰箱中，并尽快检测。 Table 2. Primers and PCR conditions for each locus (Part I) version 0.3 ID 1 2 3 4 5 Locus LOP1 PtTX2146 PtTX3025 PtTX3107 PtTX3116 Dye Cy5.5 green D2 Black D2 Black D2 Black Cy5 Blue Forward(5-3) GGCTAATGGCCGGCCAGTGCT CCTGGGGATTTGGATTGGGTATTTG CACGCTGTATAATAACAATCTA AAACAAGCCCACATCGTCAATC CCTCCCAAAGCCTAAAGAAT Reverse(5-3) GCGATTACAGGGTTGCAGCCT ATATTTTCCTTGCCCCTTCCAGACA TTCTATATTCGCTTTTAGTTTC TCCCCTGGATCTGAGGA CATACAAGGCCTTATCTTACAGAA Ta Touch down 64-54°C Touch down 60-50°C Touch down 60-50°C Touch down 55-45°C Touch down 60-50°C size range 153-189 176-264 211-305 150-174 115-169 PCR Conditions 1 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 18 cycles 2 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 3 30 S from 64 °C to 54 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 55°C to 45 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 4 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 25 cycles 5 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 6 54 °C 30s 50 °C 30s 50 °C 30s 45 °C 30s 50 °C 30s 7 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s Final extention 8 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min Preservation 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- Date: 2012-3-13 Jinlong Table 2. Primers and PCR conditions for each locus (Part II) version 0.3 ID 6 7 8 9 Locus PtTX4001 SsrPt_ctg1376 SsrPt_ctg4363 SPAC12.5 Dye Cy5 Blue Cy5.5 Green Cy5 Blue Cy5.5 Green Forward(5-3) CTATTTGAGTTAAGAAGGGAGTC CGATATTATGGATTTTGCTTGTGA TAATAATTCAAGCCACCCCG CTTCTTCACTAGTTTCCTTTGG Reverse(5-3) CTGTGGGTAGCATCATC AAATGCATGCCAAACTTAAATAC AGCAGGCTAATAACAACACGC TTGGTTATAGGCATAGATTGC Ta Touch down 55-45°C Touch down 60-50°C Touch down 64-54°C Touch down 60-50°C size range 198-229 88-124 95-106 118-184 PCR Conditions 1 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 18 cycles 2 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 3 30 S from 55°C to 45 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 64 °C to 54 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 4 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 25 cycles 5 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 6 45 °C 30s 50 °C 30s 54 °C 30s 50 °C 30s 7 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s Final extention 8 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min Preservation 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- Date: 2012-3-13 Jinlong 实验五 PCR产物的检测步骤：一治胶 1 在电子天平上称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶。 2 用量筒量取120mLTBE溶液，倒入锥形瓶。 3 将锥形瓶在微波炉中加热三分钟，在沸腾后，轻摇几次，使得琼脂糖全部溶化。 4 放在常温冷却，待65℃左右，（至外边仍然比较烫手，但没有蒸气散出时）。加入0.8μL EB（溴化乙锭），摇匀。 1 － 4 仅适用于首次做胶时参考。 5 将胶槽两端用不干胶封好，倒入30mL左右的溶液，插入胶孔成型用的梳子，待15到20min冷凝。将盛有剩余溶胶的锥形瓶用多层保鲜膜盖好，并用铝箔封口，放在65℃的烘箱中。二点样 6点 Loading Buffer。每一次取10μL的红色Loading Buffer，分成五份，每个约2μL，点在事先固定在tip盒盖的石蜡膜上。按照样品的数量，点出相应数量的Loading Buffer水珠。 7 点Ladder DNA标准样，5μL，若是两排胶孔，应该点Ladder DNA标准样。 8 吸取DNA样品，每个吸取4μL，为防止DNA样品的污染，每一次都要换枪头。按照次序点入Loading Buffer的水珠中。 9 将胶放置在电泳槽中，令电泳液将其浸入。注意，胶孔一端要放在负极（黑色电极）一端。 10 点样，先在最左侧的胶孔中点入lambda样，将移液器的量程调至4－5μL，按照顺序，吸取水珠，点入胶孔中，此时不必每一次都换枪头。三电泳 11 将电泳仪电压调到80－110V之间，电泳15分钟。四紫外光检测 12 取胶：先关闭电源，戴上蓝色在Techtum Lab AB凝胶成像系统中拍照。拍照时用MVPILOT软件，点击摄像机的图标，调整对比度和明暗效果，在左侧MITSUBISHI打印机上打印。保存图像时，点击照相机的图标。 13 完成拍照后，将凝胶丢弃，仪器擦拭干净，并保持Techtum Lab AB的门打开。实验六用96孔板提取Scots Pine种子DNA 准备： SP1 在使用前，每200μL加入1uL的RNAse，如研磨2×96材料，则取SP1 40mL，加入200uLRNAse。放在65℃烘箱预热。 Elution Buffer 65℃预热步骤： 1. 取96孔板，每个孔放1颗瓷珠，1粒Scots Pine种子，盖好。 2. 充分研磨破碎1min，在UPSC 6th floor。3700rpm离心1，使碎片落入管底，继续破碎1min。 3. 开盖加入200μL SP1，放65℃ 烘箱中10min，混匀两次，将壁上的液体离心到底部（2000rpm） 4 .加入70μL SP2，盖好，混匀，短离心， 5 .放入-20℃冰箱 10min 6. 3700rpm 离心10min 7. 将上清液移动到1.2mL管中（约200μL） 8. 加入1.5体积的SP3 （约300μL） 9. 盖好，混匀20s，短离心（到3000rpm） 10. 将柱子板放方孔底座上，每孔加入150μL Equilibration Buffer，混匀，静置4min， 3000rpm离心 2min 11. 每个管中取500μL样品移到 HiBind DNA柱子板上，置于方孔底座上。 12. 盖好尼龙膜，3700rpm离心 3min。 13. 去掉尼龙膜，倒掉方孔底座中的液体。 14. 加入800μL SPW Wash Buffer，盖好尼龙膜， 3700离心3min，倒掉方孔底座中的液体。 15. 加入800μL SPW Wash Buffer， 3700离心5min，倒掉方孔底座中的液体，再离心10min，以彻底去掉乙醇，倒掉方孔底座中的液体。放在通风厨10分钟，晾干。 16. 将柱子板放在1.2mL排管上，用100μL 65℃ 预热的Elution Buffer洗脱。在65℃温箱中静置5min。 3700rpm离心 5min。 17. 1.2mL排管盖好，保存在4℃冰箱中，其余丢弃。对DNA进行常规琼脂糖凝胶电泳检测， 2uLDNA， lambda标准样 2uL 20120329 实验七96孔板PCR 1 稀释模板DNA 将提取到的总 DNA 吸取到96孔板上，根据Nanodrop对DNA的测量结果，用ddH2O稀释到10-20ng/uL，需要根据PCR的次数和每次DNA样品量确定要吸取的DNA量，保证取样量至少多15uL以上。作为模板DNA，写清楚模板DNA的序号，日期，标签如下 Plate-I，放在4°C保存。 2 准备模板标签对于96孔板，每一格填写如下信息： 1 序号（1-96，一般按照列保存） 2 DNA序列号（如E4218） 3 树编号（UID，即每棵树所取的哪颗种子如 81-8，表示81号树的第8颗种子）。 3 模板DNA取样用排枪取2μL的模板DNA，加入到到96孔板管底部。由于不带有荧光，模板DNA的枪头可收集起来，可以作为毛细管电泳时混合样品用的枪头，但是要做好标记。 4 混合反应体系 Master Mix No. Conponent Volume per tube Concentration ×25 Storage 1 ddH2O 10.95 - 273.75 RT 2 10×PCR buffer 1.6 - 40 -4°C 3 2.5mM dNTP 1 0.15625 25 -4°C 4 Forward Primer 0.2 0.125 5 -4°C 5 Reverse Primer 0.2 0.125 5 -4°C 6 Top Taq 0.05 2.5U 1.25 -20°C 对于任意一板的PCR反应，需要准备4个1.5mL的ep管，先放在冰盒上，按照1-6的顺序添加各组分到ep管中。盖好盖子，短离心，涡旋，短离心，确保体系混合均匀。 5 用电子移液器（该移液器每次可吸取100μL，由于需要加入的反应体系是14μL，因此只能加7次，注意第一次吸取的液体要打掉，长音表明是最后一次），吸取反应体系，每管加入14μL。 6 在96孔板的边缘标记好Plate号，引物名称等，之后贴Bio-Rad的PCR厚膜，用手柄压实，确保每一管的封口都严密。 7 在振荡器上涡旋4-5下，确保反应体系和模板DNA充分混合。短离心，达到2000rpm以上。 8 按照如下条件，设定touch down PCR: Tab.1 LOP1 TD 64 to 54 Tab. 2 PtTX2146 TD 60 to 50 Tab.3 PtTX3025 TD 55 to 45 Tab. 4 PtTX3107 TD 55 to 45 Tab.5 PtTX3116 TD 60 to 50 Tab. 6 PtTX4001 TD 60 to 50 Tab.7 SsrPt_ctg1376 TD 60 to 50 Tab. 8 SsrPt_ctg4363 TD 64 to 54 Tab.9 SPAC12.5 TD 55 to 45 9 每个PCR需要耗时2.5h左右。反应结束后，将产物放到4°C冰箱中保存。 10. 对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，一般每板随机抽检16个样品，点样的量一般为： Loading Buffer 2.5 μL PCR产物 3μL Ladder DNA 5μL 实验七96孔板PCR 1 稀释模板DNA 将提取到的总 DNA 吸取到96孔板上，根据Nanodrop对DNA的测量结果，用ddH2O稀释到10-20ng/uL，需要根据PCR的次数和每次DNA样品量确定要吸取的DNA量，保证取样量至少多15uL以上。作为模板DNA，写清楚模板DNA的序号，日期，标签如下 Plate-I，放在4°C保存。 2 准备模板标签对于96孔板，每一格填写如下信息： 1 序号（1-96，一般按照列保存） 2 DNA序列号（如E4218） 3 树编号（UID，即每棵树所取的哪颗种子如 81-8，表示81号树的第8颗种子）。 3 模板DNA取样用排枪取2μL的模板DNA，加入到到96孔板管底部。由于不带有荧光，模板DNA的枪头可收集起来，可以作为毛细管电泳时混合样品用的枪头，但是要做好标记。 4 混合反应体系 Master Mix No. Conponent Volume per tube Concentration ×25 Storage 1 ddH2O 10.95 - 273.75 RT 2 10×PCR buffer 1.6 - 40 -4°C 3 2.5mM dNTP 1 0.15625 25 -4°C 4 Forward Primer 0.2 0.125 5 -4°C 5 Reverse Primer 0.2 0.125 5 -4°C 6 Top Taq 0.05 2.5U 1.25 -20°C 对于任意一板的PCR反应，需要准备4个1.5mL的ep管，先放在冰盒上，按照1-6的顺序添加各组分到ep管中。盖好盖子，短离心，涡旋，短离心，确保体系混合均匀。 5 用电子移液器（该移液器每次可吸取100μL，由于需要加入的反应体系是14μL，因此只能加7次，注意第一次吸取的液体要打掉，长音表明是最后一次），吸取反应体系，每管加入14μL。 6 在96孔板的边缘标记好Plate号，引物名称等，之后贴Bio-Rad的PCR厚膜，用手柄压实，确保每一管的封口都严密。 7 在振荡器上涡旋4-5下，确保反应体系和模板DNA充分混合。短离心，达到2000rpm以上。 8 按照如下条件，设定touch down PCR: Tab.1 LOP1 TD 64 to 54 Tab. 2 PtTX2146 TD 60 to 50 Tab.3 PtTX3025 TD 55 to 45 Tab. 4 PtTX3107 TD 55 to 45 Tab.5 PtTX3116 TD 60 to 50 Tab. 6 PtTX4001 TD 60 to 50 Tab.7 SsrPt_ctg1376 TD 60 to 50 Tab. 8 SsrPt_ctg4363 TD 64 to 54 Tab.9 SPAC12.5 TD 55 to 45 9 每个PCR需要耗时2.5h左右。反应结束后，将产物放到4°C冰箱中保存。 10. 对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，一般每板随机抽检16个样品，点样的量一般为： Loading Buffer 2.5 μL PCR产物 3μL Ladder DNA 5μL 实验八在CEQ 8000上进行毛细管电泳一准备Excel 作为样品的Label 每一板混合样的侧面，应该用记号笔标注清楚，例如2012-03-29-Plate-I-a 标签文件，应该保存在Excel中，待毛细管电泳时，直接拷贝到CEQ8000的界面中。表 2 96孔板标签的排列 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 69-1-a 69-2-a 69-3-a 69-4-a 69-5-a 69-6-a 69-7-a 69-8-a 69-9-a 69-10-a 69-11-a 143-4-a B 71-1-a 71-2-a 71-3-a 71-4-a 143-1-a 143-2-a 71-7-a 71-8-a 143-3-a 71-10-a 71-11-a 71-12-a C 73-1-a 73-2-a 73-3-a 73-4-a 73-5-a 73-6-a 73-7-a 73-8-a 73-9-a 73-10-a 73-11-a 73-12-a D 74-1-a 74-2-a 74-3-a 74-4-a 74-5-a 74-6-a 74-7-a 74-8-a 74-9-a 74-10-a 74-11-a 74-12-a E 81-1-a 81-2-a 81-3-a 81-4-a 81-5-a 81-6-a 81-7-a 81-8-a 81-9-a 81-10-a 81-11-a 81-12-a F 82-1-a 82-2-a 82-3-a 82-4-a 82-5-a 82-6-a 82-7-a 82-8-a 82-9-a 82-10-a 82-11-a 82-12-a G 84-1-a 84-2-a 84-3-a 84-4-a 84-5-a 84-6-a 84-7-a 84-8-a 84-9-a 84-10-a 84-11-a 84-12-a H 86-1-a 86-2-a 86-3-a 86-4-a 86-5-a 86-6-a 86-7-a 86-8-a 86-9-a 86-10-a 86-11-a 86-12-a 二待检样品的混合 1 取96孔上样板和PCR中吸取过DNA的10μL枪头。 2 按照顺序排好PCR产物，按照以下量, 用10uL排枪分组添加如下产物到管底部。注意，每个上样板都由三种产物混合，每次DNA吸取后，都要换枪头。 Table 1 Information for the labeld primers Primer Label PCR frag length Color Group Volume (uL) SsrPt_ctg1376 Cy5.5 88-124 Green 1 a 2 PtTX4001 Cy5 198-229 Blue 1 a 0.5 PtTX3107 D2 150-174 Black 1 a 4.5 SPAC12.5 Cy5.5 118-184 Green 2 b 2 SsrPt?_ctg4363 Cy5 95-106 Blue 2 b 0.5 PtTX3025 D2 211-305 Black 2 b 4.5 LOP1 Cy5.5 153-189 Green 3 c 2 PtTX3116 Cy5 115-169 Blue 3 c 0.5 PtTX2146 D2 176-264 Black 3 c 4.5 3取塑料纸盒，一般每板需要两个2mL ep管的HD，倒入纸盒内。取黄色枪头，每一管，加入30uL 已经混合好的Hi-Di (HD)，无需换枪头。 4 用新的黄枪头，将每一列孔的样品反复吸放几次，以混合均匀。贴96孔板塑料膜。 5 短离心到2000rpm。 6（如有必要，每个孔滴入染料包内附带的一滴矿物油，防止样品蒸发）。二准备Separation Buffer板地点：UPSC ，B3-28-48 1 取Buffer取样槽，倒入已经稀释好的Separation buffer，用电子排枪每个Separation buffer板孔中放入250uL的separation buffer。确认无误后，将剩余Separationbuffer倒回瓶内。用双蒸水冲洗Buffer取样槽，用吸水纸擦干，放回原处。 2 取PAGE胶（在4°C冰箱），形如注射器，注意要事先将包装剪开。三从CEQ 8000中拷贝上一次运行的数据 1 双击打开CEQ CEQ Main Database(屏幕正下方中央倒数第五个图标) 在新开启的窗口下的导航栏中，选择对应的文件夹(Jinlong), 点击右键，选择 set as working database. 2 回到Jinlong 用户下，选择Default Sample Data ，在右侧显示的窗口中，将文件按照时间排序。 3 选择要导出的文件，右键export，选择scf作为导出格式。 4 将导出的文件拷贝到桌面Jinlong 文件夹中，新建一个文件夹，命名按照如下规则例如: 2012-03-27-Plate-I-a （a表示第一组，即SsrPt_ctg1376, PtTX4001和PtTX3107的混合样） 2012-03-28-Plate-I-b （b 表示第二组，即SPAC12.5, SsrPt_ctg4363和PtTX3025的混合样） 2012-03-29-Plate-I-c （c表示第三组，即LOP1, PtTX3116 和PtTX2146的混合样） 2012-03-29 即日期 2012年3月29日 Plate-I 表示是第一板DNA的扩增产物。 5 将整个文件夹拷贝到USB Flash Disk中。五上样及运行：注意：一定要按照CEQ8000操作系统中的提示，换Separation Buffer， DNA sample 及 Wetting Tray， Gel Catridge。 1 打开CEQ CEQ Main Database (屏幕正下方工具栏的倒数第五个图标) 选择Jinlong右键 set as working database 2 洗Wetting tray。点击工具栏的Run图标，在新界面的菜单中，点击Replenish Replenish wetting tray，提示 Do you want to replesh the wetting tray? 点OK。当出现上面的对话框显示为绿色时，可以打开上盖，wetting tray两端的卡子，取下Wetting tray，打开后，倒掉里面的水及胶的混合液，用双蒸水冲洗。擦干后放回。 3 安装样品，在里面的支架上放样品，放好后再揭开贴膜，在外面的支架上放separation buffer，盖好separation buffer板的盖子, 点Done。 4 如果之前已经将胶卸载，并安装了黄色的Plug，则必须要从 Install gel catridge开始（Release gel catridge为灰色）。点击Install gel catridge，稍等几分钟后，“没有胶或者胶已经泄露”等信息，点击release gel。如果前面的胶未卸载，则直接点击Release gel catridge即可换下前面剩余的胶柱在注射器中。 5若提示 “Do you wish to release the gel cartridge?”,点OK。待出现“you may now open gel access and change gel catridge”的对话框，则可以打开下面的盖子，卸下已经安装好的黄色塞子（plug），将盛满胶的注射器的安装好。点击 ReplenishInstall gel catridge,等待新胶柱安装好。 6. 用Direct control打出一些胶，目的是防止胶柱前端的空气进入毛细管中。一般需挤出为0.2mL路径：菜单 Direct control Manifold Purge 输入0.2mL即可。 7. 在屏幕正下方的控制界面中，点击Sample setup（工具条第一个），选择Create a new sample，从excel中拷贝96孔板的样品标签。在出现的表格中，将96孔板的名称标签粘贴到两个view中（在页面最上面的check point）。第一个界面，每一列的最下方，都要选取Frag3，两个页面核对无误后保存，文件名参照统一命名格式如 2012-03-29-Plate-I-a。表格将从白色变成蓝色。 8. 点击右上角的Run sample Plate 若出现对话框 Capillary Array usage exceeded. Do you want to continue? 选择 Yes Select a sample plate to Run，选择刚刚保存的2012-03-29-Plate-I-a， 9 新弹出的屏幕左侧显示的是Buffer，右侧显示样品，高亮部分表明该板对应位置应该有样品和缓冲液。点击左下角的 Start开始进行毛细管电泳。 10 样品完成后的卸载和塞子安装。96孔板的毛细管电泳大约耗时10h，注意查看Log文件。全部结束后，冲洗wetting tray， Replesh Replesh wetting tray, 冲洗好后，放回。点击Replenish Release gel catridge , 提示 “Do you wish to release the gel catridge?” 点OK,等待1 – 2min，胶柱卸载。 11. 换下用过的多半管胶，塞入黄色的塞子（Plug In），关好门后，显示点击 ReplenishInstall Gel catridge 出现对话框，Install Plug In. 将没用用过的胶放回4°C冰箱保存。; 个人分类: 科研笔记|8130 次阅读|0 个评论

[转载]DNA测序仪： sanger: genesquared 2013-2-6 10:28; DNA测序仪 DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 dna序列分析的主流。美国pe abi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是abi prism 310型dna测序仪的测序原理和操作规程。原理　　abi prism 310型基因分析仪(即dna测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddntp(标记终止物法)，因此通过单引物pcr测序反应， DNA测序仪生成的pcr产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链dna混合物，使得四种荧光染料的测序 pcr产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的ccd (charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在ccd摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为dna序列，从而达到dna测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。　　它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定dna片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。pe公司还提供凝胶高分子聚合物，包括dna测序胶(pop 6)和genescan胶(pop 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的ccd摄影机检测器，使dna测序缩短至2.5h，pcr片段大小分析和定量分析为 10～40min。　　由于该仪器具有dna测序，pcr片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行dna测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(sscp)、微卫星序列分析、长片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析，临床上可除进行常规dna测序外，还可进行单核苷酸多态性(snp)分析、基因突变检测、hla配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。试剂与器材　　1．bigdye测序反应试剂盒主要试剂是bigdye mix，内含pe专利四色荧光标记的ddntp和普通dntp，amplitaq dna polymerase fs，反应缓冲液等。　　2．pgem-3zf (+) 双链dna对照模板 0.2g/l，试剂盒配套试剂。　　3．m13(-21)引物 tgtaaaacgacggccagt，3.2μmol/l，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。　　4．dna测序模板可以是pcr产物、单链dna和质粒dna等。模板浓度应调整在pcr反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒dna，浓度为0.2g/l，即200ng/μl。　　5．引物需根据所要测定的dna片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/l，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如m13(-21)引物，t7引物等。　　6．灭菌去离子水或三蒸水。　　7．0.2ml或和0.5ml的pcr管盖体分离，pe公司产品。　　8．3mol/l 醋酸钠(ph5.2) 称取40.8g naac•3h2o溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调ph至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。　　9．70%乙醇和无水乙醇。　　10．naac/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/l naac混匀，室温可保存1年。　　11．pop 6测序胶 abi产品。　　12．模板抑制试剂(tsr) abi产品。　　13．10×电泳缓冲液 abi产品。　　14．abi prism 310型全自动dna测序仪。　　15．2400型或9600型pcr仪。　　16．台式冷冻高速离心机。　　17．台式高速离心机或袖珍离心机。操作步骤 1．pcr测序反应　　(1) 取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：　　所加试剂测定模板管标准对照管　　bigdye mix 1μl 1μl 　　待测的质粒dna 1μl －　　pgem-3zf (+) 双链dna － 1μl 　　待测dna的正向引物 1μl －　　m13(-21)引物－ 1μl 　　灭菌去离子水 2μl 2μl 　　总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。　　(2) 将pcr管置于9600或2400型pcr仪上进行扩增。98℃变性2min后进行pcr循环，pcr循环参数为96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。 2．醋酸钠/乙醇法纯化pcr产物　　(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。　　(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。　　(3) 加70%(v/v)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。 3．电泳前测序pcr产物的处理。　　(1) 加入12μl的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。　　(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。　　(3) 在pcr仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，待上机。 4.分析或打印出彩色测序图谱　　上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kv预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kv，20min)，在7.5kv下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。 5．序列分析　　仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。 6.处理仪器测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。计算　　测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括n数)/650×100% 　　差异碱基即测定的dna序列与已知标准dna序列比较不同的碱基，n为仪器不能辨读的碱基。注意事项与评价　　1．abi prism 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。　　2．本实验测序pcr反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以pcr管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧pcr管盖外，最好选用pe公司的pcr管。如pcr结束后pcr液小于4～4.5μl，则此pcr反应可能失败，不必进行纯化和上样。　　3．作为测序用户来说，只需提供纯化好的dna样品和引物，一个测序pcr反应使用的模板不同，需要的dna量也就不同，pcr测序所需模板的量较少，一般pcr产物需30～90ng，单链dna需50～100ng，双链dna需200～500ng，dna的纯度一般是a260nm/a280nm为 1.6～2.0，最好用去离子水或三蒸水溶解dna，不用te缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。 4．本实验使用的测序试剂盒是bigdye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测dna长度为650bp左右。本仪器dna测序精确度为 (98.5±0.5) %，仪器不能辨读的碱基n＜2%，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于n碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对 DNA测序技术-发展历史　　70年代末，Walter Gilbert发明化学法、Frederick Sanger发明双脱氧终止法手动测序，同位素标记　　80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，计算机图象识别　　90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳　　2001年完成人类基因组框架图扩展阅读1http://www.kxqc.com/yp/product-list-1780.html; 个人分类: 3500|2959 次阅读|0 个评论

毛细管电泳指纹图谱的几何优化法: gxswmwys 2013-1-11 13:23; 三角形优化法、四面体优化法、正方形优化法、三棱柱优化法基本完成实验和发表论文，开始梯形优化法研究。开始纳米技术应用于中药指纹图谱研究！; 个人分类: 中药指纹图谱评价|246 次阅读|0 个评论

[转载]ZETA电位: linxubo 2013-1-6 22:30; ZETA电位是一个表征分散体系稳定性的重要指标。由于带电微粒吸引分散系中带相反电荷的粒子，离颗粒表面近的离子被强烈束缚着，而那些距离较远的离子形成一个松散的电子云，电子云的内外电位差就叫作Zeta电位。 Zeta电位又叫电动电位或电动电势（ζ-电位或ζ-电势），是指剪切面(Shear Plane)的电位，是表征胶体分散系稳定性的重要指标。由于分散粒子表面带有电荷而吸引周围的反号离子，这些反号离子在两相界面呈扩散状态分布而形成扩散双电层。根据Stern双电层理论可将双电层分为两部分，即Stern层和扩散层。当分散粒子在外电场的作用下，稳定层与扩散层发生相对移动时的滑动面即是剪切面，该处对远离界面的流体中的某点的电位称为Zeta电位或电动电位（ζ-电位）。即Zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差。它可以通过电动现象直接测定。目前测量Zeta 电位的方法主要有电泳法、电渗法、流动电位法以及超声波法,其中以电泳法应用最广。电泳法测定分散体系中微粒的荷电性质与Zeta电位.doc surpass固体zeta电位仪.pdf From百度; 个人分类: 共享|9912 次阅读|0 个评论

[转载]核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳: charles08 2012-5-7 11:01; 一、原理和用途丙烯酰胺是一单体结构，由过硫酸胺提供并被 TEMED （ N, N, N ′ , N ′－四甲基乙二胺）所稳定的自由基可以引发一个链式反应，使丙烯酰胺单体聚合成长链。同时双功能基团 N,N ′－亚甲基双丙烯酰胺参与聚合反应，使得链与链之间交联成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比，其制备和操作相对困难，需要在垂直电泳槽中进行；但聚丙烯酰胺凝胶在分离小片段 DNA 分子时效果很好，其分辨率极高，相差 1 bp 的 DNA 片段都能分开，而且在一个标准点样孔中可以容纳相对大量的 DNA 。常用的聚丙烯酰胺凝胶有两种：非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶，前者用于分离和纯化双链 DNA 片段，后者用于分离和纯化单链 DNA 片段。本实验仅仅介绍非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。该方法已广泛用于动、植物微卫星 DNA （ short tandem repeat ， STR ）的检测，以利于遗传图谱构建、数量性状基因定位、标记辅助选择、亲子鉴定及生物多样性研究等。二、实验材料分离纯化的核酸 (DNA 或 RNA) 。三、溶液与缓冲液 1. 10 ?/FONT TBE 缓冲液 2. 30% 丙烯酰胺凝胶溶液 3. 29 g 丙烯酰胺 N,N ′－亚甲基双丙烯酰胺 1 g 加水至 100 mL ， 37 ℃溶解，置于棕色瓶中 4 ℃保存。 4. 溴酚蓝电泳加样缓冲液。 5. 10% 过硫酸胺（ APS ）。 6. TEMED （ N, N, N ′ , N ′－四甲基乙二胺）。 7. DNA Marker 。 8. 银染溶液的组成：（ 1 ）固定液： 10% 乙醇。（ 2 ）氧化液： 1% 硝酸。（ 3 ）染色液： 0.1% AgNO 3 （ 4 ）显色液： 2% NaCO 3 。无水碳酸钠 6 g ，硫代硫酸钠 0.3 mg ，溶于 300 mL 纯水中，用时加入 37% 甲醛 0.4 mL 。（ 5 ）终止液： 4% 醋酸四、仪器设备及耗材电泳仪，垂直电泳槽，脱色摇床，胶梳子，微波炉，电子天平，凝胶成像仪，离心管架，吸头盒， 10 m L 微量注射器， 2 m L 、 10 m L , 、 100 m L 移液器， 10 m L 、 200 m L 吸头， 1.5 mL 离心管，胶带纸等。五、实验方法 1 ．聚丙烯酰胺凝胶的制备、点样与电泳（1）电泳装置的准备：将聚丙烯酰胺垂直电泳槽中的凝胶玻璃板充分洗净，凉干后小心装入胶框，再装在垂直电泳槽中，将螺丝拧紧，然后用 1% 琼脂糖凝胶封住胶框的下边以防漏胶。（2）聚丙烯酰胺凝胶的制作：（ 8% PAGE ） 30% 丙烯酰胺 9.5 mL （避光 4 ℃保存） 5 ?/SPAN TBE 6 mL 加水至 30 mL 10% APS 210 m L TEMED 18 m L 合计 30 mL 注意：根据垂直电泳槽的大小确定聚丙烯酰胺凝胶的体积。（3）灌胶、点样：将胶混匀后快速倒入玻璃板夹层中，插入梳子，待胶凝固后（ 1 h 以上），拔掉梳子，用水冲洗加样孔，然后用移液器或吸水纸吸取水分（目的是防止电泳后带不整齐），再点样，并加 DNA Marker 。（4）电泳：向胶槽中倒入电泳缓冲液（ 0.5 ?/SPAN TBE ）， 200 V ～ 300 V 电泳至溴酚蓝电泳加样缓冲液适当位置时（电泳 3 h 左右），停止电泳。（5）回收垂直电泳槽中的电泳缓冲液，卸下玻璃板，将其置于染色缸内，用薄钢勺或刀片小心地将上面的玻璃板从一角撬起，将上面的玻璃板平稳的拿开。有时候凝胶仍附着在下面的玻璃板上，可连同玻璃板进行染色，很快凝胶即从玻璃板上脱落。 2 ．聚丙烯酰胺凝胶中 DNA 的染色常用的染色方法两种，一种为溴化乙锭染色法，另一种为硝酸银溶液染色法本实验介绍常规的硝酸银溶液染色法。 (1) 将染缸中的凝胶，先用蒸馏水冲洗一遍。 (2) 固定：加入 10% 乙醇固定 10 min ，弃去固定液。 (3) 氧化：加入 1% 硝酸， 3 min ，弃去氧化液。用水漂洗 2 次，每次 10 s 。 (4) 染色：加入 0.1% AgNO 3 ，放在脱色摇床上 15 ～ 30 min 后，将硝酸银倒掉，用水冲洗 15 s 。 (5) 显色：用 2% NaCO 3 显色，待条带清晰后将溶液倒掉，然后加入 4% 的乙酸溶液停止显色。回收乙酸溶液待后用。胶浸泡水中至照相。; 个人分类: 科研资源|3983 次阅读|0 个评论

[转载]SDS PAGE 电泳常见问题分析: charles08 2012-5-7 10:58; 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的 Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统， TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。 5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7. 为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 8. 为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 9. 什么是“鬼带”，如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。 11. 为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压； 12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。处理办法：电泳槽正确装配即可。 13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。 14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 15. 电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。 1 胶的凝结不好，例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下，在分离胶的下部有波浪样的花纹，凝胶不均匀。解决方法：加大TEMED和过硫酸胺的量，使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板，防止有残留的胶干结在玻璃板上。 2 胶不凝，解决方法：温度较低时加大TEMED和过硫酸胺的量，过硫酸胺必须新鲜配制。如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。 3 胶易碎，例如浓度较高的胶在染色和脱色过程以及扫描过程中破裂。解决方法：首先在上述过程中一定要动作轻缓，其次在室温较高的情况下可以适当减少TEMED和过硫酸胺的量。 4 电泳完后胶上有很多长条纹的杂带，解决方法：建议电泳缓冲液不要回收利用。配制胶的溶液一定要纯。电泳中常出现的一些现象：︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果不正常现象和对策 1. 指示剂前沿呈现两边向上或向下的现象.向上的"微笑"现象说明凝胶的不均匀冷却,中间部分冷却不好,所以导致凝胶中分子有不同的迁移率所致.这种情况在用较厚的凝胶以及垂直电泳中时常发生.向下的"皱眉"现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的,特别是当凝胶和玻璃板组成的"三明治"底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象. 2."拖尾"现象是电泳中最常见的现象.这常常是由于样品溶解不佳引起的,克服的办法是在加样前离心,选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液,加增溶辅助试剂.另一方法是降低凝胶浓度. 3."纹理"现象常常是由于样品中不溶颗粒引起的,克服办法是增加溶解度和离心除去不溶性颗粒. 4. 蛋白带偏斜常常是由于滤纸条或电极放置不平行所引起的,或由于加样位置偏斜而引起. 5. 蛋白带过宽,与邻近蛋白泳道的蛋白带相连,这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的. 6. 蛋白带模糊不清和分辨不佳是由于多种原因引起的.虽然梯度凝胶可以提高分辨率,但与其他方法相比,常规聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率较低的方法.为了提高分辨率,不要加过多的样品,小体积样品可给出窄带.加样后应立即电泳,以防止扩散.选择合适的凝胶浓度,使组分得以充分的分离.通常靠近前沿的蛋白带分辨率不佳,所以应根据分子量与凝胶孔径的关系,灌制足够长度的凝胶,以使样品不会走出前沿.样品的蛋白水解作用也引起扩散而使分辨率降低.水解作用通常发生在样品准备的时候,系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白,如果在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可以减少这种情况的发生.; 个人分类: 科研资源|3356 次阅读|0 个评论

[转载]Western Blot 原理和操作方法（全）: charles08 2012-5-7 10:57; 工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用. SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) 104 20-30 1×104-4×104 15-20 4×104-1×105 10-15 1×105-5×105 5-10 5×105 2-5 ③分离胶: 电泳凝胶浓度试剂 10% 12% 15% 10% 12% 15% H2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.4 30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.5 1.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 2.5 2.5 2.5 3.8 3.8 3.8 10%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 10%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 TEMED(μl) 4 4 4 6 6 6 总体积(ml) 10 15 ④浓缩胶试剂浓度(5%) H2O(ml) 4 2 30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.5 1.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.5 10%SDS(μl) 80 40 10%AP(μl) 60 30 TEMED(μl) 8 4 总体积(ml) 6 3 蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题： 1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂） 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻融。一：准备工作：一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器二：需要的溶液：裂解液 Laemmli样品缓冲液三：操作步骤： 1)培养细胞蛋白质样品的制备： 1：胰酶酶解后裂解：　细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。 2：皿上直接裂解：细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后4℃25000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合），强力混匀，样品置100℃水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。（样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月） 2)组织样品的制备：手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。）加入Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。）蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题： 1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂） 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻融。一：准备工作：一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器二：需要的溶液：裂解液 Laemmli样品缓冲液三：操作步骤： 1)培养细胞蛋白质样品的制备： 1：胰酶酶解后裂解：　细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。 2：皿上直接裂解：细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后4℃25000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合），强力混匀，样品置100℃水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。（样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月） 2)组织样品的制备：手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。）加入Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。）附：一：裂解液的制备：组织裂解液（全细胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4：NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6： PMSF 1 mmoL/L 7： Aprotinin 1μg/ml 8: leupeptin 1μg/ml 9: pepstain 1μg/ml 其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。细胞裂解液：1：NP-40裂解体系：　150 mmoL/L Nacl 1.0%NP-40或Triton-x-100 50 mmoL/L Tris(PH8.0) 2：RIPA裂解体系：150 mmoL/L Nacl 1.0%NP-40或Triton-x-100 0.5%脱氧胆酸钠 0.1%SDS 50 mmoL/L Tris( ph8.0) 二：Laemmli 样品缓冲液配置（1*SDS样品缓冲液） 50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0） 100 mmoL/L DTT 2% SDS 0.1% 溴酚蓝 10% 甘油此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白浓度而定，40C长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中DTT应临时加入，以防降解。蛋白质定量 1)Bradford法: 检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等. ①Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4℃至少6个月保持稳定. ②标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20μg -150μg/100μl之间绘制标准曲线. ③将待测样本溶于100μl缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS) ④按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去. ⑤每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟. ⑥根据标准曲线计算待测样品的浓度.　 2)Lowry法: 检测原理: 是Cu2+与蛋白作用生成的Cu+与双缩脲试剂形成兰色络合物,菲林试剂增强兰色形成,750nm检测. ①首先,将20g碳酸钠溶于500ml水中;再将1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸钠溶于500ml蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存1年以上. ②Folin-ciocalteu酚试剂 ③按体积比1:2:1将铜/酒石酸/碳酸钠,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室温下储藏,可稳定保存2周,标明为试剂A ④按体积比1:5将Folin-ciocalteu酚试剂和H2O混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存1个月,表明为时机B ⑤用蒸馏水将样本(5-100μg)稀释为1ml,并准备100,50,25,12.5μg /ml,4个浓度的BSA作为标准蛋白. ⑥每个蛋白样品家1.0ml试剂A,混合均匀,在室温下孵育10分钟. ⑦加入0.5 ml试剂B并立即混合, 在室温下孵育30分钟. ⑧在750nm光波长下测定吸光度;根据标准曲线计算样本蛋白质的浓度. 3)紫外分光光度法: 检测原理:是因蛋白质样品在280nm波长下有最大吸光率,最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在. ①纯化蛋白质浓度的测定:在280nm波长下读取与适当对照相比较的吸光值. ②对于抗体和BSA,可按照下述标准计算其浓度,对其他蛋白质粗略地估计:1单位吸光值相当于1mg/ml 蛋白质 A280(1mg/ml) IgG 1.35 IgM 1.2 BSA 0.7 ③含有核苷酸的蛋白质溶液浓度的测定: 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260) 蛋白质浓度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205) 1)SDS-PAGE设备和材料 ①电泳装置（垂直板电泳槽）为北京六一仪器厂生产的DYCZ-24D型电泳装置。 ②电泳仪（电源）为北京六一仪器厂生产的DYY-8B型。 ③振荡器 2）试剂 ①丙烯酰胺（电泳级） ②N,N′-甲叉双丙烯酰胺（bis） ③SDS ④TEMED ⑤Tris ⑥过硫酸铵 ⑦α-巯基乙醇或DTT ⑧甘油 ⑨甘氨酸 ⑩溴酚蓝 (11)盐酸 3）聚胶前准备： ①配制凝胶储液： T%=30% C%=1% arc:bis=29:1　过滤后4℃避光保存。 ②配制浓缩胶缓冲液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 　过滤后4℃避光保存。 ③配制分离胶缓冲液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 　过滤后4℃避光保存。 ④配制10%SDS ⑤配制10%过硫酸铵（AP） ⑥TEMED原溶液 ⑦电泳缓冲液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,临用时稀释5倍至1×SDS电泳缓冲液加入电泳槽中。 4)制胶: 　制胶关键是聚合时间,最好是分离胶聚合控制在分离胶从加入10%AP和TEMED起至开始出现凝胶的时间为15-20分钟（并不是此时已凝聚完全）。对浓缩胶最佳聚合速度为8-10min开始可见聚合，可以通过调节AP和TEMED的加入量来控制，因液体中含有分子氧可抑制凝胶的聚合，故用时可在真空中抽气以排除液体中的分子氧，灌完分离胶后加水以封闭分离胶与外界氧气的结合，总之，要掌握一个原则：即用尽量少的催化剂在最佳时间聚合。 ①按比例配制分离胶，轻缓地摇动溶液（8-10下），使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置90min。 ②同前按比例配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制90min以上以保证完全聚合。 5)预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽电泳缓冲液后低电压短时间的预电泳（恒压10-20V,20-30min），清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。 6)加样：预电泳后依次加入标准品和待分析样品，注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。 7)电泳：加样完毕，盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在连续系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶，电泳时，应采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。 8)染色和脱色电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣.对凝胶中分离成不同条带的蛋白进行检测.此外,根据不同的研究目的,也可将凝胶电印迹 ①考马斯亮蓝染色: 将凝胶取出放入培养皿中到如少量的染色液,以浸没凝胶为宜,在摇床上震荡,直到凝胶上出现明显的条带为止,一般5-6小时或者4℃过夜;然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡,其间要不断换脱色液,直至脱色液颜色稍清亮.,凝胶背景清楚为止. ②染色液配制: 90ml甲醇和H20混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250用滤纸过滤染液以除去颗粒不溶性物质. ③脱色液的配制: 90mL(甲醇):H20(1:1 V/V)和10ml冰乙酸溶液. 附：一、蛋白标准品的选择凝胶电泳中一个关键的指示系统，即蛋白标准品（Molecular Weight Marker），电泳的分离效率，转膜效率以及电泳泳动情况等，皆需通过蛋白标准品来显示，目前普遍采用的几种蛋白标准品有： ① Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix ② Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix 以上两种Marker均为PIERCE公司的产品，货号为：①prod# 26681; ②prod# 26691;该标准蛋白不需染色，在电泳凝胶中随着蛋白质的迁移，各种分子质量的标准蛋白逐渐分开，而显示出非常漂亮的多色条带，可通过电泳槽直接肉眼观察各电泳带的凝胶中的泳动情况，当相对于目的蛋白大小的标准蛋白与相邻两条标准蛋白达到所需分辨距离时，即可停止电泳，取出凝胶做进一步的转膜工作。 ③ Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein Molecular Weight Marker Mix 以上也为PIERCE产品，货号为：prod# 26651，该标准蛋白同上也具有以上作用外，同时在使用化学发光时，和样品一起显色经胶片曝光后，在胶片上可出现漂亮的条带。 ④ Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix 以上为Sigma公司产品，货号为B2787,作用效果同③ 二、对照的设置一般需要设立: 内参照, 提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白阳性对照, 即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量阴性对照: 即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞.在实验中根据你的需要选择免疫印迹蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后,分离为不同条带,其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白),将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting,以利于随后的检测能够的进行,随后,将NC膜与抗血清一起孵育,使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带),再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量. 一、设备和材料转移电泳槽和转移电泳仪(电源) 震荡器冰箱滤纸 NC膜胶片暗室二、试剂封闭液:5%的脱脂牛奶粉TBS-T 第一抗体(Ab1) 第二抗体(标记的Ab2) 底物以及显色指示剂漂洗液(TBS-T) 转印缓冲液抗体稀释液丽春红S 显影液定影液三、试剂的配制封闭液: 5g的脱脂牛奶+100ml的TBS-T 漂洗液(TBS-T): 0.01M TBS-T为Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O用HCl调节PH到7.5,假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml 转印缓冲液: 同5×SDS电泳缓冲液,不含SDS,如果采用PVD干膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也可以 Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需调节PH值 ,用时稀释5倍到1×转印缓冲液. 显影液：H2O--750ml 米土尔--3g 无水亚硫酸钠---100g 对苯二酚---3g 溴化钾---3g 无水碳酸钠：先加5gPH10.0不够时再加5g 注：以上配定加H2o定容至1000ml 定影液：起始水温：60℃ H2o 700ml 硫代硫酸钠：240g 无水亚硫酸钠：25g 冰醋酸：48ml 注：加H2o至1000ml 四、　电印迹蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物具有牢固结合蛋白又不影响蛋白质Ag活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性等特点，常用的支持物有：硝酸纤维膜（NC膜）或PVDF膜。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分为半干式和湿式转印两种模式。一．半干式电转印 1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部弃去，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，取一10ml注射器注满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开,边推边进,反复多次注水,直至凝胶从玻璃板上滑落下来。 2. 将NC膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5-10min. 3. 按照以下顺序放置滤纸，凝胶和NC膜到半干槽中。 4. 每层之间的气泡要全部去除。可以用10ml吸管轻轻在上一层滚动去除气泡，然后用一绝缘的塑料片中间挖空与凝胶一样大小或略小一点，以防电流直接从没有凝胶处通过造成短路，盖好加上阳极电极板。二．湿式电转印 1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取出凝胶方法同半干式电转印。 2. 打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。 3. 电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内（电转印液之前要放入冰箱内预冷），连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。五、印迹膜上总蛋白的染色在确定印迹中是否存在总蛋白之前,通过对硝酸纤维素膜染色可以了解转印至膜上的总蛋白质的组成情况,并可确定蛋白质分子质量标记物的位置和确定转印成功,同时,该方法也清楚地显示出转印蛋白质的复杂性. 丽春红S印迹膜染色法：丽春红S适用于酸性水溶液,染色但是不持久,在后续的处理中红色染料易被洗去,由于与蛋白质的结合是可逆性的,该染色方法适用于所有显示抗原的饿技术, 丽春红S带负电荷,可以与带正电贺的氨基酸残基结合,同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合,从而形成红色条带. 1)丽春红溶液的配制: 储存液(10×)： 0.1g丽春红溶于5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,临用前稀释10倍为应用液. 2)操作步骤 ①转印结束后取出印迹膜至于丽春红S应用液中,并在室温下搅动5-10分钟 ②将膜放入PBS洗数次,每次1-2分钟,并且更换PBS ③根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记至此膜可以用于封闭和加入抗体六、膜的封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%马血清以及5% No-fat milk等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异着色背静浅，封闭液以20%BSA效果较好，其次是5%N-fat milk. 封闭过程： 1) 洗转印膜：室温漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。 2) 取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也可在4度过夜。 3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min. 七、抗体杂交抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体（Ab1）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（Ab2）进行杂交检测，标记Ab2 物质有放射性核素，酶，以及生物素等。杂交过程：１）封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的Ab1浓度为1ug/ml，封口，4℃孵育过夜或室温（22-25℃）摇动孵育2h. ２）液洗膜3次x10min ３）标记的Ab2（羊抗兔-HRP）室温1h，洗膜3x10min 八、检测根据标记Ab2的标记物不同,其杂交的结果检测方法也不同,较常用的检测系统有HRP标记 Ab2的的增强化学发光(ECL)和DAB检测系统. 1) 辣根过氧化物酶-DAB法: ①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀. ②显色:将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带 ③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应. 2) 辣根过氧化物酶-ECL法: 增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用X线胶片感光原理,将结果记录下来: ECM显色剂配制:按mlH2O加显色剂A、B各1滴,混匀. 在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的显色液,月1-5分钟用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,并确定干的表面与胶片接触. 将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5分钟,冲洗胶片以确定所测抗原的正确暴光时间,暴光时间可短至几秒也可以长到数小时. 冲洗胶片步骤:先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止,在放入定影液中漂洗,十秒即可. 注意事项: 1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关.因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如,透析. 2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度.因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合. 3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内. 4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min) 5. 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象 6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液 7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数,,但是反复冻融会使蛋白质降解 8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印. 9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔 10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系. 11. 转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC膜对应正极.; 个人分类: 科研资源|2036 次阅读|0 个评论

[转载]质粒DNA电泳的三条带: charles08 2012-5-7 10:55; 质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤： 1、培养细菌使质粒扩增 2、收集和裂解细菌 3、分离和纯化质粒DNA 碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6的碱溶液使DNA发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开；而后者完全变性分，甚至出现断裂。因此，当加入中和液时，溶液Ph值恢复较低的近中性水平，此时，质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体DNA则无法复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图 (a)松弛线性的DNA； (b)松弛开环的OC构型； (c)超螺旋的SC构型由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 (a)道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边； (b)道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间三、材料、试剂及器具 1、材料 E.coliDH 5α（pUC 19 vector） 2、试剂 1)LB培养基 2)TE缓冲液 3)裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ 4)酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 5)无水乙醇 6)70%乙醇 7)氨苄青霉素50mg/mL 器具离心机、离心管、吸嘴四、操作步骤以1%比例把E.coliDH5α(含PUC18)接种于含氨苄青霉素（Amp）100μg/ml)的LB培养基中37℃振摇过夜（12-18h） ↓ 取1.5ml培养物置离心管中 ↓ 10000rpm,离心1min，或4000rpm，离心5-10min ↓ 去上清，倒扣干净吸收纸上吸干 ↓ 沉淀+100μL溶液Ⅰ ↓ 加或不加入少量溶菌酶粉末；混匀，室温放置10min ↓ +加200μL溶液Ⅱ（新鲜配置） ↓ 温和颠倒数次，混匀，冰上放置5min ↓ +150μl溶液Ⅲ→颠倒混匀，冰上放置15min ↓ 离心12000rpm,15min ↓ 上清液+等体积酚：氯仿：异戊醇振匀，12000rpm,离心5min ↓ 小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质 ↓ 上清液+2倍体积无水乙醇混匀，室温5min-10min ↓ 12000rpm,5min-15min ↓弃上清沉淀+1mL70%乙醇 ↓ 12000rpm离心5min-15min ↓ 弃上清；并倒扣离心管使液体流干 ↓+ 自然干燥或真空抽干（看不到液滴为宜） ↓ 加50μlTE缓冲液（20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗取物 ↓ -20℃保存六、实验报告检查、保存提取的质粒，要求记录实验现象并说明原因。七、思考题分析以下试剂的作用原理：溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖 5mmol/Ltris HCL (Ph 8.0) 10mmol/L EDTA(PH8.0) 溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH 2% SDS 使用前新鲜配制溶液Ⅲ：5mol/L Kac 60 mL 冰醋酸11.5 mL 水28.5 mL RNase A酶：将粉末溶于10mmol/L tris HCL (Ph7.5)、15mmol/L NACL中，配成10 mg/mL 浓度的酶液，于100℃水浴加热15 min，缓慢冷却至室温，-20℃保存氯仿无水乙醇; 个人分类: 科研资源|3078 次阅读|0 个评论

[转载]琼脂糖凝胶电泳实验技巧-入门: charles08 2012-5-7 10:51; 琼脂糖凝胶电泳实验技巧核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液 ( pH8.0-8.3 ) 中，基其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要多海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分了，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速、通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多实验的要求。因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。一、操作过程中要注意以下一些问题。 1 、凝胶制作 1.1 凝胶浓度凝胶的浓度据实验需要而变，一般在 1.8%-2.0% 之间，没有用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定。补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充水分到原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的办法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值，以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。如果条带要回收最好不要用回收胶。 1.2 梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板。梳齿宽厚，形成的点样孔容积较大，用于 DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孔容积就较小，用于 PCR 产物、酶切产物鉴定等。回收的话还可以将几个齿用透明胶带粘起来，形成一个窄而长的大孔以加大点样量提高回收率。梳板的选择主要是看上样量的多少而定。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要 1mm ，否则，拔梳板时易损坏凝胶孔底层，导致点样后样品渗漏。当然，点样孔的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却 30min 以上方可拔出梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块入 4 度冰箱中冷却 15min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孔。 2 、点样在样品加入上样缓冲液中含有甘油或蔗糖以增加密度，使样品沉入孔底；上样缓冲液中一般还含有两种指示剂，溴酚兰和二甲苯菁，用于指示样吕的迁移过程。上样缓冲液储存液一般为 6 倍（ 10 倍），表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液枪基本垂直对准点样孔，用另一只手帮助固定移液枪下端，移液枪的枪头尖端进入点样孔即可将样品注入孔内。上样量的多少根据跑胶的目的而不同，一般直接跑 DNA 时量最少，跑一般的分子标记适中，回收时可以都加进去。最后根据扩增条带的大小点上适合的 DNA Maker 。 3 、电泳将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连，每次电泳时都要检查一下电极方向，以免白干（新手来做时可能就有这样的情况发生）。核酸带负电荷，从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好浸过胶为好。电泳缓冲液浓度太大则电流加大，凝胶发热，易使 DNA 降解。电泳早所加电压一般不超过 5v/cm （正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度）。电泳时间一般为 30-60min ，根据实验需要也可作适当调整。电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，电压降低，电泳时间较长，条带会相对的清晰。另外，如果电泳后样品泳支很慢或者没移动可能是由于挡板没有拿开。附 EB 作用原理：观察琼脂糖凝胶中 DNA 最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入 DNA 堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与 DNA 的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每 2.5 个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与 DNA 结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。 DNA 吸收 254nm 处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收 302nm 和 366nm 的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的 590nm 处重新发射出来。由于溴化乙锭 -DNA 复合物的荧光产率比没有结合 DNA 的染料高出 20-30 倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（ 0.5ug/ml ）时，可以检测到少至 10ng 的 NDA 条带。; 个人分类: 科研资源|1894 次阅读|0 个评论

[转载]SDS－PAGE电泳的原理及浓缩胶浓缩样品的原理【转】: ellina 2012-4-10 17:20; SDS－PAGE电泳的原理及浓缩胶浓缩样品的原理（甘氨酸的作用）这是以前从网上下到的关于SDS－PAGE电泳的讲解，个人觉得非常好，正好这几天有人问到这个东东，所以就拿出来贴到实验台里。在此声明该内容为转载。 SDS－PAGE电泳的原理及浓缩胶浓缩样品的原理（甘氨酸的作用） SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术。下面就SDS-PAGE的基本原理做简单介绍。 SDS－PAGE电泳的基本原理？ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS-PAGE电泳成功的关键是什么？ ①溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在，能与蛋白质分子结合的是单体。为了保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1∶4 或1∶3。 ②样品缓冲液的离子强度因为SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SDS单体的浓度，不是总浓度，而只有在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。所以，SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10-100 mM。 ③二硫键是否完全被还原只有二硫键被完全还原以后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。Sample buffer中的β-巯基乙醇的浓度常为4-5%，二硫苏糖醇的浓度常为2-3%。前者有挥发性，最好使用前加入。 SDS-PAGE缓冲液系统的选择，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸盐或者其他？一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键的。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15 kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。积层胶（或称浓缩胶）的作用原理？在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7时很少解离，其有效泳动速率很低，而氯离子却有很高的泳动速率，蛋白质的泳动速率介于两者之间。加上电压以后，作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，加速甘氨酸离子的泳动，使其赶上氯离子，建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积相等的稳定态（我不太明白这句话），使这些带电颗粒以相同的速度泳动，两种离子之间有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低，因此氯离子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动速率比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，形成一条狭窄的区带。蛋白质在移动界面中的浓度作用仅取决于样品和浓缩胶中Tris-HCl的浓度（为什么？），而与样品中蛋白质的最初浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对蛋白样品没有分子筛作用。当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶的pH明显增加，导致甘氨酸大量解离。此时，甘氨酸的有效泳动速率明显增加，超越蛋白分子，直接在氯离子后移动。由于凝胶孔径变小，蛋白质分子的迁移速率降低，落在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和pH环境中泳动，并根据其固有的电荷与分子大小进行分离。可见，甘氨酸并非作为缓冲成分参与，而是作为尾随离子来参与电泳过程。以上内容主要摘自《蛋白质电泳实验技术》第二版（郭尧君编著)。需要进一步了解相关内容的同学可以查阅该书。 SDS-page电泳小问答　　　　　　Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？　　A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。　　　　Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？　　A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。　　所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。　　　　Q：样品如何处理？　　A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。　　1、还原SDS处理：在还原剂中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。　　2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。　　3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。　　　　Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？　　A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；　　制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，具体作用后面介绍；　　TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；　　十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。　　　　Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？　　A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。　　2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。　　　　Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？　　A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。　　处理办法：待其充分凝固再作后续实验。　　　　Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？　　A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。　　处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。　　　　Q：为什么带出现拖尾现象？　　A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。　　处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。　　　　Q：为什么带出现纹理现象？　　A：主要是样品不溶性颗粒引起的。　　处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。　　　　Q：什么是“鬼带”，如何处理？　　A：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。　　处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。　　　　Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？　　A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。　　处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。　　　　Q：为什么电泳的条带很粗？　　A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。　　处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；　　　　Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？　　A：这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。　　处理办法：电泳槽正确装配即可。　　　　Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？　　A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。　　处理办法：按正确的操作方法操作。; 个人分类: 肿瘤|8363 次阅读|0 个评论

[转载]DNA电泳基本参数: hsm 2010-5-7 15:18; 1．琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA迁移率（线性DNA分离建议凝胶浓度）分离范围(bp) 琼脂糖浓度分离范围(bp) PAGE浓度 1,000~30,000 0.5% 100~1,000 3.5% 800~12,000 0.7% 80~500 5.0% 500~10,000 1.0% 60~400 8.0% 400~7,000 1.2% 40~200 12.0% 200~4,000 1.5% 5~100 20.0% 50~2,000 2.0% 2．变性、非变性PAGE胶中染料迁移率 PAGE浓度（相当核苷酸片段大小，bp）溴酚蓝二甲苯青 3.5% 100 460 5.0% 65 260 8.0% 45 160 12.0% 20 70 15.0% 15 60 20.0% 12 45; 个人分类: 未分类|2719 次阅读|0 个评论

量子点凝胶电泳: zbb 2009-8-24 20:01; 以前利用双亲性改性的水溶性量子点跑凝胶电泳，结果出来很不尽人意，有很长的拖尾。现在改用silica包裹的量子点跑电泳，很漂亮！图片等以后分享！; 个人分类: 科研|4335 次阅读|1 个评论

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标签: 电泳

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