在前面的讲解中，我们介绍了乙烯信号转导通路中的两大组分：乙烯受体家族和CTR1。和大多数植物激素信号通路不同，乙烯信号中起始的这两大组分“狼狈为奸”，共同把持着乙烯信号通路的命脉，抑制信号向下游的传递。 不过，“天理昭昭，报应不爽，邪恶终归抵不过正义”。大自然这位伟大的编剧，巧妙地安排了一位“少年英雄”替天行道、除恶扬善，把邪恶消亡，让正义永存。这位英雄就是我们今天的主角，“伟光正”的EIN2 。 在《乙烯反应突变体的筛选》一文中，我们曾提到过，1990年Ecker课题组在 The Plant Cell 上发表的系统阐述以拟南芥三重反应为模式，进行乙烯反应突变体筛选的文章中，筛选到了一个乙烯不敏感突变体，在高浓度乙烯存在的情况下仍然不出现三重反应，这就是第一个EIN2（Ethylene Insensitive 2）等位突变体ein2-1。 1999年，Ecker实验室在 Science 上发表题为 EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis 的文章。文章中总结，在后续的遗传筛选中，陆续筛选出了25个ein2等位突变体。在这些突变体中，除了ein2-9，其他24个突变体在形态学、生理学以及分子水平都对乙烯处理不敏感。此外，它们除了对外源乙烯处理不敏感外，对内源乙烯也完全不敏感，并且在拟南芥的各个生长时期都有表型，这就说明了 EIN2在乙烯信号通路中起到非常关键的作用 。 有意思的是，除了在筛选乙烯不敏感突变体的过程中筛选到ein2等位突变外，在筛选生长素转运抑制剂、细胞分裂素和ABA不敏感突变体，以及衰老延缓突变体的过程中，也都筛选到了ein2等位突变，但是并没有筛选到其他乙烯信号通路的组分，这说明 EIN2可能特异地介导了乙烯和其他激素的互作 。 ein2突变体对乙烯不敏感【2】 通过图位克隆将EIN2定位在5号染色体的头部，并进一步克隆到EIN2基因。通过杂交实验发现EIN2在拟南芥基因组中为单拷贝，这可在一定程度上解释为什么唯独EIN2突变会导致拟南芥对乙烯完全不敏感。Northern blot发现EIN2在拟南芥的根、茎、叶以及花中都有表达，但是mRNA水平不受乙烯的影响。对25个ein2等位突变体中的EIN2进行测序后发现，它们中的EIN2基因都存在不同的突变。将野生型的EIN2转化至ein2-5中，可以互补突变体的表型，说明突变体的乙烯不敏感表型确实是由于EIN2基因的突变导致，并且 EIN2在乙烯的信号转导中发挥正调控作用 ，这是我们迄今为止讲到的第一个在乙烯信号通路中起正向作用的组分。 EIN2的图位克隆及等位突变【2】 将EIN2基因组和cDNA序列比对后发现，EIN2含有7个内含子。EIN2基因编码1294个氨基酸，蛋白大小约为141kD。N端的461个氨基酸具有非常强的疏水性，而C端的833个氨基酸却具有非常高的亲水性。蛋白结构预测发现EIN2蛋白具有12个跨膜结构域，全部位于N端。进一步通过体外实验证明，EIN2蛋白确实具有完整的膜定位。蛋白序列比对后发现EIN2的N端和Nramp家族蛋白具有较高的序列相似性（21% identity）。Nramp家族蛋白在细菌到人类的所有生物中都有发现，主要起到转运二价金属离子的作用。但是，将EIN2蛋白在爪蟾卵母细胞、酵母等系统中表达，并没检测到离子转运的活性，说明 EIN2并不具有离子转运的功能，可能通过其他的机制行使功能 。 EIN2 N端与Nramp蛋白序列比对（箭头所示为12个跨膜结构域）【2】 按照一般的理解，既然EIN2在乙烯的信号转导中起正调控的作用，如果将EIN2过表达，拟南芥应该会表现出组成型乙烯反应或者乙烯过敏感的表型。可是，将EIN2的N端和全长过表达，并没有出现上述表型。但是将EIN2的C端（CEND）在ein2-5中过表达，却可导致光下生长的幼苗出现组成型乙烯反应，并可持续激活乙烯响应基因的表达。以上结果说明， EIN2的Nramp-like domain可能通过某种机制调控CEND的功能 。 将EIN2 CEND在ein2-5中过表达，导致光下生长幼苗出现组成型乙烯反应【2】 2009年， Georg GROTH实验室在 Biochemical Journal 上发表题为 EIN2, the central regulator of ethylene signalling, is localized at the ER membrane where it interacts with the ethylene receptor ETR 1的文章。他们将EIN2-GFP融合蛋白在烟草叶片中瞬时表达，并通过激光共聚焦显微镜观察，发现EIN2-GFP和ER的marker蛋白共定位，并在细胞核周围表现出典型的ER网状结构，证明 EIN2定位在ER上 。 EIN2定位在内质网上【3】 我们在乙烯受体系列文章中介绍过，乙烯受体家族的5个成员，都在内质网有定位。那么，EIN2和受体之间有什么关系呢？ Groth组的科研人员通过FRET分析，证明乙烯受体ETR1和EIN2可以互作。随后又通过荧光滴定法（Fluorescence titration studies）进一步从体外证明了ETR1和EIN2的互作。 FRET分析证明ETR1和EIN2互作【3】 既然EIN2在乙烯的信号通路中起到关键性的作用，而它在mRNA水平上对乙烯又没有响应，那么它受什么调控，又是如何发挥作用的呢？ 欲知后事如何，请听下回分解：《乙烯信号简史 | 成也EIN2，败也EIN2》。 【参考文献】 【1】Guzman, P., Ecker, J. R. (1990). Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. The Plant Cell, 2(6), 513-523. 【2】Alonso, J. M., Hirayama, T., Roman, G., Nourizadeh, S., Ecker, J. R. (1999). EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science, 284(5423), 2148-2152. 【3】Bisson, M. M., Bleckmann, A., Allekotte, S., Groth, G. (2009). EIN2, the central regulator of ethylene signalling, is localized at the ER membrane where it interacts with the ethylene receptor ETR1. Biochemical Journal, 424(1), 1-6. 欢迎关注 BioArt植物 微信公众号
俗话说： “ 好兄弟高打墙，亲戚朋友远离乡。 ” 意思是说，如果想兄弟之间和睦相处，就必须在两家之间打一堵墙隔离，如果想亲戚朋友之间的关系好，那就必须要离得远一点。正所谓，距离产生美。 我们在上一讲中提到，乙烯受体家族一共有 “ 五兄弟 ” 。和我们人类一样，乙烯受体家族成员一多，肯定就不可避免地惹出许多麻烦，生出许多事端。那么， 这些成员之间有没有什么远近亲疏呢？植物为什么要进化出这么多受体，它们之间的功能又有什么分化呢？下面，让我们一起来看一下乙烯受体家族里的那些“爱恨情仇”。 1. 乙烯受体家族的分类 首先，我们来看一看乙烯受体家族的分类。总体来看，乙烯受体家族主要包括以下几个保守的结构域：一个负责和乙烯结合的 N 端，一个 GAF 结构域以及一个蛋白激酶结构域。另外，其中的三个受体（ ETR1 、 ETR2 和 EIN4 ）的 C 端还有一个接收结构域（ receiver domain ）。根据乙烯结合结构域的蛋白序列相似性，可将乙烯受体分为两个亚家族。亚家族 I 包括 ETR1 和 ERS1 ，它们具有组氨酸激酶活性所必需的氨基酸残基，具有组氨酸激酶的活性。亚家族 II 包括 ETR2 、 ERS2 和 EIN4 ，它们的组氨酸激酶结构域退化，具有丝 / 苏激酶的活性。另外，亚家族 II 的 N 端还多了一段氨基酸序列，可能具有信号肽的作用。非常有意思的一点是， ERS1 既有组氨酸激酶的活性，又有丝 / 苏激酶的活性。由此可见，和其他植物激素比，乙烯受体具有更强的结构和功能的复杂性。 乙烯受体的分类（ Lacey等，2014） 2. 乙烯受体的功能分化 正如我们人类讲究长幼尊卑，许多生物学过程也是要讲究次序的。既然乙烯受体家族有这么多成员，那么这五个成员在乙烯信号转导中是起到同等重要的作用，还是也有一定的主次之分呢？ 2003 年， Anthony B. Bleecker 实验室在 The Plant Cell 上发表一篇题为 Analysis of combinatorial loss-of-function mutants in the Arabidopsis ethylene receptors reveals that the ers1 etr1 double mutant has severe developmental defects that are EIN2 dependent 的文章。文章中对乙烯受体 loss of function 突变体进行不同的组合，构建了多种组合的双突和多突。对这些突变体表型进行观察后发现，对于拟南芥黄化苗，所有的乙烯受体突变体组合都表现出部分的组成型乙烯反应，但对外源乙烯处理仍有反应，这也在此说明了乙烯受体家族存在功能冗余。而对于生长在光照下的幼苗， ers1etr1 双突的生长发育受到更加明显的影响，比如莲座叶变小，晚花以及不育，说明乙烯受体亚家族 I 在光下拟南芥的生长发育过程中具有更重要的作用。 ers1etr1双突的表型（Hall等，2003） 2007 年， Schaller, G. E 实验室在 BMC Plant Biology 上发表题为 A strong constitutive ethylene-response phenotype conferred on Arabidopsis plants containing null mutations in the ethylene receptors ETR1 and ERS1 的文章，对乙烯受体亚家族 I 的功能进行了详细的研究。研究发现， etr1ers1 loss of function 双突表现出非常严重的组成型乙烯反应表型，说明亚家族 I 可能在乙烯信号转导通路中发挥更重要的作用。同时，将 ETR1 转化到双突中即可完全回复突变体的乙烯反应表型。另外， etr1ers1 仍然具有一定的乙烯反应，说明乙烯受体亚家族 II 可以独立行使部分乙烯受体的功能。 etr1ers1双突的组成型乙烯反应（Qu等，2007） 2010 年，中科院上海植生所文啟光课题组在 BMC Plant Biology 上发表文章 Genetic and transformation studies reveal negative regulation of ERS1 ethylene receptor signaling in Arabidopsis 。研究发现，在含有野生型 ETR1 的乙烯受体突变体中引入 ers1 突变，反而会减轻其组成型乙烯反应表型，而过表达 ERS1 则增强对植物生长的抑制，说明在调控乙烯反应方面， ERS1 具有双重作用：抑制乙烯反应，以及依赖于 ETR1 的促进乙烯反应。关于这一双重功能是如何实现以及如何调控的，仍需进一步研究。 ERS1的双重作用（Liu等，2010） 2012 年，上海植生所文啟光课题组一鼓作气，在 Plant Physiology 上发表文章 Arabidopsis ETR1 and ERS1 differentially repress the ethylene response in combination with other ethylene receptor genes ，创新性地将 ETR1 和 ERS1 显性突变导入乙烯受体 loss of function 五突（ 5LOF ）中，观察显性突变对五突乙烯反应的恢复情况，研究基因的功能。研究发现，将 etr1-1 显性突变导入 5LOF 中，杂交后代表现出乙烯不敏感的表型，说明 etr1-1 可独立于其他乙烯受体，抑制拟南芥的乙烯反应。而 ers1-1 显性突变对乙烯反应的抑制依赖于 ETR1 和 EIN4 。以上结果说明，不同的乙烯受体之间可能发生互作，共同调控植物复杂的乙烯反应。 etr1-1显性突变可独立地抑制拟南芥乙烯反应（Liu等，2012） 3. 乙烯受体多样化的意义 除了拟南芥，在其他植物中（比如番茄）也发现了乙烯受体家族，这说明乙烯受体家族并不是拟南芥所特有的，更不是拟南芥基因组复制造成的。那么， 乙烯受体家族的存在有什么意义呢？ 对于这一问题，科学家们有许多假设： (1) 不同受体对乙烯的亲和性可能不同，它们分工合作，共同感知不同浓度的乙烯； (2) 在转录水平，不同的受体对乙烯的反应不同，受体特异的乙烯响应模式，可能会引起不同的乙烯反应； (3) 受体在植物中的表达模式不同，这可能和植物在不同生长发育时期，各个组织和器官不同的乙烯反应有关； (4) 不同的受体，可能和不同的下游因子互作，或者和同一因子具有不同的亲和性； (5) 受体之间可能存在复杂的互作模式，相互影响，共同调控乙烯反应。 总之，由于乙烯在生物的生长发育以及响应外界环境的过程中具有非常重要的作用。 乙烯受体的复杂性，可能是乙烯功能复杂性和重要性的结果。 【参考文献】 Lacey, R. F., Binder, B. M. (2014). How plants sense ethylene gas—The ethylene receptors.Journal of inorganic biochemistry,133, 58-62. Gallie, D. R. (2015). Ethylene receptors in plants-why so much complexity?.F1000prime reports,7. Hall, A. E., Bleecker, A. B. (2003). Analysis of combinatorial loss-of-function mutants in the Arabidopsis ethylene receptors reveals that the ers1 etr1 double mutant has severe developmental defects that are EIN2 dependent.The Plant Cell,15(9), 2032-2041. Qu, X., Hall, B. P., Gao, Z., Schaller, G. E. (2007). A strong constitutive ethylene-response phenotype conferred on Arabidopsis plants containing null mutations in the ethylene receptors ETR1 and ERS1.BMC Plant Biology,7(1), 3. Liu, Q., Xu, C., Wen, C. K. (2010). Genetic and transformation studies reveal negative regulation of ERS1 ethylene receptor signaling in Arabidopsis.BMC plant biology,10(1), 60. Liu, Q., Wen, C. K. (2012). Arabidopsis ETR1 and ERS1 differentially repress the ethylene response in combination with other ethylene receptor genes.Plant Physiology, pp-111. Hua, J., Meyerowitz, E. M. (1998). Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana. Cell, 94(2), 261-271. 欢迎关注 BioArt植物 微信公众号
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