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分子生物学技术PCR在石油勘探开发中的应用
热度 1 jiangkaixi 2014-5-11 15:44
自 1985 年诺贝尔奖获得者 K.Mullis 发明多聚酶链反应 (PCR) 后，这一技术成为生命科学研究各领域和地质微生物学一个强有力的手段，可在短时间内扩增极微量的 DNA 。 PCR 技术的极高灵敏度可用来研究地质体中微生物的种群数量、分布与迁移等。 Inagakid 等在 2005 年报道从 100Ma 前的白垩纪黑色页岩样品中成功提取并扩增古 DNA ，通过研究保留在沉积岩中的古微生物 DNA ，可以重建地史时期的微生物群结构和古环境条件。 经过近 30 年的发展，当前由 PCR 技术发展起来的实时定量 PCR 技术 (RT-PCR) ，多重 PCR 技术 ( mPCR ) 结合高通量、高精度基因测序 (NGS) 使分子生物学研究更加简单、高效和精确。当前油气勘探开发难度日益加大，不断涌现出新问题，迫切需要新的思路、新的技术和新的方法。近几年引入的全二维气相色谱 - 飞行时间质谱仪，成倍挖掘了蕴藏在原油中的地质 - 地化信息；氩离子抛光扫面电镜则使页岩气储层纳米级孔隙表征和演化规律研究成为可能。因此分子生物学技术 PCR 及其衍生技术吸引了石油科技工作者的极大兴趣，在石油微生物学上，其应用范围不断扩大和深入，获得了一批重要的新发现和新应用。 石油微生物学研究在石油勘探开发领域主要集中于以下几个方向 ( 图 1) ：微生物油气勘探、油藏原油微生物降解、微生物提高油气采收率、原油污染和油田污水处理等。在微生物油气勘探中，利用油气指示菌 ( 如甲烷氧化菌、丁烷氧化菌、中链烷烃氧化菌和长链烷烃氧化菌 ) 功能基因的定量 PCR 方法，高效检测陆地表层土壤和洋底淤泥中油气指示菌的数量、分布和种群，预测地下是否具有油气藏响应，结合地质 - 地震 - 地化研究成果，优选有利油气勘探区，在岩性油气藏勘探和生物点礁气藏勘探中已有很多成功案例。 图 1 PCR 技术在石油勘探开发中的应用 另外利用 PCR 技术分离嗜油细菌样本中的 16SrRNA( 细菌鉴定的可靠分子指标 — 细菌的 “ 身份证 ” ) ，通过基因测序并与 16SrRNA 数据库的系列数据进行比较，鉴定微生物种类，从而筛选出适应目标油藏特殊温度、盐度和酸碱度的高效烃类降解细菌，并利用基因组学和蛋白组学研究其对烃类的降解机理，使微生物采油研究上升一个新的层次，为开发常规水驱、化学驱等难以动用的剩余油和重质油提供强有力手段，同时也可应用于陆地土壤原油污染和海洋石油污染的生物修复和油田污水处理。 加拿大卡尔加里大学 Steve Larter 教授领导的石油研究组是研究油藏生物降解和稠油开发的世界级顶尖团队。该团队于 2013 年报道了利用定量 PCR 技术计算并分析生物降解油藏内不同深度岩芯样品的 SrRNA 拷贝数和差异性，揭示了不同岩芯样品微生物的丰度特征。研究结果表明，油水过渡带微生物总数最大，沿油柱顶部方向微生物丰度递减，正构烷烃完整性递增。首次用分子生物学手段观测了油藏内微生物对烃类的降解模式，即降解首先从油水界面开始 → 油水过渡带 → 油柱顶部 → 油层顶部，随降解程度的增强，各级界面不断推进和变化。 可预见 PCR 相关 技术的发展和引入将大大加快发现油藏内不同深度和不同物理化学环境下微生物种群数量发育规律、活动和迁移规律，可准确评估微生物对油藏的降解速率，认识其降解机理等至今仍不甚了解和未知的问题。上述问题的解决将帮助建立更加精确的油藏生物降解模型，在钻前准确预测生物降解的等级和分布，有效评价勘探风险，特别在高投入、高风险的海洋石油勘探中。 随着常规油气勘探开发形式越来越严峻，走向海洋、走向西部，开发深层油气藏和非常规油气资源成为当前国内油气勘探主方向。 PCR 及其衍生技术的发展和应用必将为石油勘探开发提供新的手段和思路，特别在以 “ 三高 ” 为特点的海洋石油勘探开发中，可为海上勘探有利区优选、油藏生物降解风险评估、海上稠油油藏的高效开发提供新的研究手段。
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瑞典纪事: 实验记录DNA提取/PCR/毛细管电泳
zjlcas 2013-2-7 22:30
以下是在瑞典的实验记录, 之前, 操作都是靠口授心传, 加上自己操作. 我将这些步骤详细记录下来. 共分为: DNA提取(离心柱法), 浓度测定, DNA提取的电泳检验, PCR, PCR产物的凝胶电泳检验,毛细管电泳, 96孔板进行DNA提取以及检验等. 全部内容, 均根据自己所做实验整理而成. 实验一 用试剂盒提取植物的全DNA 目的： 从针叶或种子提取裸子植物全DNA，用于SSR，Barcoding等进一步分析。 准备： 1. 取冰。冰在UPSC 二楼049房间。 2. 将Elution buffer 在65℃烘箱中预热。 操作步骤： 1. 每个待提取DNA样品取2枚针叶，在实验记录本上按照统一编号记录，并誊写样品标签上的所有信息。将2 mL圆底离心管按顺序编号，放在32孔板上。取约60mg针叶（Pinus sylvestris两针），剪碎（长宽不超过3mm），放入圆底离心管中。 2. 加入600μL SP1溶液，加入1μL RNase（在4℃冰箱中） 和 2粒瓷珠。 3. 在mixer mill上充分破碎，一般2min即可，若未打碎，继续破碎2min。 4. 将圆底离心管放在65℃ 金属浴，10min － 15min ，中间混合1－2次。 5. 加入210μL SP2，放冰上5min。 6. 14000rpm离心，5min。 *7. 取上清液到绿柱子，12000rpm，1min （对于种子，步骤可以省略） 8. 将上清液移到2mL新的圆底离心管，加入1.5倍体积的SP3（一般为500 － 700μL），混合均匀。 9. 将700μL上清液转移到蓝柱子（放在新的无盖离心管中，注意柱子和离心管都要标号）， 12000rpm， 1min，倒掉离心管下的液体。 10. 将第8步剩余的上清液继续转移到蓝柱子，12000rpm，1min，倒掉离心管下的液体。 11. 加入500μL的Washing Buffer到蓝柱子，12000rpm，1min，倒掉离心管下的液体。 12. 重复第11步。 13. 将蓝柱子放回原离心管离心，14000rpm，2min。 14. 取干净的EP管，标号。将蓝柱子放入干净的EP 管中，加入90μL 65℃ Elution Buffer洗脱，等候约4min， 12000rpm， 离心1min。 15. 丢弃蓝柱子，将EP管（下面的溶液即为提好的DNA）贴好标签，写上实验纪录上的编号，放入4℃冰箱保存。 如果为种子： 发芽至外露1－2cm，除去种皮， 整粒种子放入2mL圆底离心管。以下程序同。 最后洗脱用100μL Elution Buffer。若需要洗脱完全，则考虑用50μL进行第二次洗脱。 实验二 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳检测 目的： 用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取是否成功 准备：烘箱65℃，打开 操作步骤： 1 在电子天平上称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶。 2 用量筒量取120mLTBE溶液，倒入锥形瓶。 3 将锥形瓶在微波炉中加热三分钟，在沸腾后，轻摇几次，使得琼脂糖全部溶化。 4 放在常温冷却，待65℃左右，（至外边仍然比较烫手，但没有蒸气散出时）。加入8μL EB（溴化乙锭），摇匀。 5 将胶槽两端用不干胶封好，倒入30mL左右的溶液，插入胶孔成型用的梳子，待15到20分钟冷凝。将锥形瓶用多层保鲜膜盖好，并用铝箔封口，放在65℃的烘箱中。 6点 Loading Buffer。每一次取10μL的红色Loading Buffer，分成五份，每个约两μL，点在事先固定在tip盒盖的石蜡膜上。按照样品的数量，点出相应数量的Loading Buffer水珠。 7 点Lambda标准样（试剂公司合成的特定浓度的DNA样品），2μL，若是两排胶孔，应该点两个Lambda标准样。 8 吸取DNA样品，每个吸取2μL，为防止DNA样品的污染，每一次都要换枪头。按照次序点入Loading Buffer水珠中。 9 将胶放置在电泳槽中，令电泳液将其浸入。注意，胶孔一端要放在负极（黑色电极）一端。 10 点样，先在最左侧的胶孔中点入lambda样，将移液器的量程调至4－5μL，按照顺序，吸取水珠，点入胶孔中，此时不必每一次都换枪头。 11 将电泳仪电压调到80－110V之间，电泳15分钟。 12 取胶：先关闭电源，戴上蓝色在Techtum Lab AB凝胶成像系统中拍照。拍照时用MVPILOT软件，点击摄像机的图标，调整对比度和明暗效果，在左侧MITSUBISHI打印机上打印。保存图像时，点击照相机的图标。 13 完成拍照后，将凝胶丢弃，仪器擦拭干净，并保持Techtum Lab AB的门打开。 实验三 用Nanodrop检测DNA浓度 目的： Nanodrop分光光度计测量提取的DNA浓度 操作步骤： 1. 双击打开Nanodrop管理界面，点击Nucleic Acid Measurement。将Nanodrop的探测器旋臂抬起，用蒸馏水擦拭干净。 2. 用移液器吸取1μL 双蒸水（量程可调至1.2μL），点在探头上，盖好，点击Initialize按钮。 3. 打开探测器旋臂，用移液器点一滴Elution Buffer（这是由于之前用的是Elution Buffer，待测的DNA溶于什么溶液，就应该用相应的溶液作为本底对照），点击Blank按钮 4. 抬起旋臂，擦拭干净，换枪头，吸取1.2μL的待测样品，点Measure按钮，记录右下角的DNA浓度。 5． 依次重复步骤4，直至所有样品的浓度都测定完。 实验四 PCR 反应 步骤： （1） 将引物成对摆放，9对引物一定要两两放在一起，并排号。在冰板上，放置9个 ep排管，用以9个不同的引物体系。因每排管由8个小ep管组成，每个96孔板上只能做8个DNA样品（8 *9 ＝ 72组合）。 （2） 将待检测模板DNA用ddH2O稀释到10ng /uL ，贴上标签，放在4℃保存。 （3） 按照DNA样品的数量，计算每对引物各组分的体积。每个组分扩大的倍数，取决于模板DNA的数目（实际情况下的体系的体积倍数要比DNA的数量稍多，每个1.5mL 的ep管内各组分需要到达足够的体积，才能准确量取以及混合）。 （4）取9个1.5mL的ep管，分别按照顺序，添加表1中除DNA模板外的组分。 表1 16uL PCR反应体系 order Constituents Storage Volume Per PCR Tube × 1 ddH2O RT 11.85uL uL 2 PCR buffer 10× 4℃ 1.6uL uL 3 dNTP (25mM/uL) 4℃ 0.1uL (0.156mM) uL 4 Ordinary Primer (10uM) 4℃ 0.2uL (0.125uM) uL 5 With Dye Primer (10uM) 4℃ 0.2uL (0.125uM) uL 6 TopTaq (5 Unit/uL) －20℃ 0.05uL (0.25unit) uL 分装到各ep管，每管14uL 7 DNA template 2uL (10-20ng) 每个样品吸取2uL 模板DNA Total 16uL （5） 将混合好的体系，按照行，分装到同一排管的小ep管中，每个14uL。 （6） 从稀释过的DNA（约10ng/uL），吸取2uL，按照列，添加到排管的小ep管中。 （7） 手动混合反应体系，离心。 按照所需退火温度不同，分成三组： 第一组 LOP1和SsrPt_ctg4363，touch down 温度为 64 – 54℃ 第二组 PtTx3107和PtTX4001，touch down 温度为55－45℃ 第三组PtTX2146，PtTX3025，PtTX3116，SsrPt_ctg1376, SPAC12.5，touch down为60－50℃。 ?（8）每个PCR反应耗时约2－2.5h。注意，PCR仪在最后的延伸完成后，会降到15℃，应该尽快将产物转移到4℃冰箱中， 并尽快检测。 Table 2. Primers and PCR conditions for each locus (Part I) version 0.3 ID 1 2 3 4 5 Locus LOP1 PtTX2146 PtTX3025 PtTX3107 PtTX3116 Dye Cy5.5 green D2 Black D2 Black D2 Black Cy5 Blue Forward(5-3) GGCTAATGGCCGGCCAGTGCT CCTGGGGATTTGGATTGGGTATTTG CACGCTGTATAATAACAATCTA AAACAAGCCCACATCGTCAATC CCTCCCAAAGCCTAAAGAAT Reverse(5-3) GCGATTACAGGGTTGCAGCCT ATATTTTCCTTGCCCCTTCCAGACA TTCTATATTCGCTTTTAGTTTC TCCCCTGGATCTGAGGA CATACAAGGCCTTATCTTACAGAA Ta Touch down 64-54°C Touch down 60-50°C Touch down 60-50°C Touch down 55-45°C Touch down 60-50°C size range 153-189 176-264 211-305 150-174 115-169 PCR Conditions 1 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 18 cycles 2 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 3 30 S from 64 °C to 54 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 55°C to 45 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 4 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 25 cycles 5 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 6 54 °C 30s 50 °C 30s 50 °C 30s 45 °C 30s 50 °C 30s 7 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s Final extention 8 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min Preservation 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- Date: 2012-3-13 Jinlong Table 2. Primers and PCR conditions for each locus (Part II) version 0.3 ID 6 7 8 9 Locus PtTX4001 SsrPt_ctg1376 SsrPt_ctg4363 SPAC12.5 Dye Cy5 Blue Cy5.5 Green Cy5 Blue Cy5.5 Green Forward(5-3) CTATTTGAGTTAAGAAGGGAGTC CGATATTATGGATTTTGCTTGTGA TAATAATTCAAGCCACCCCG CTTCTTCACTAGTTTCCTTTGG Reverse(5-3) CTGTGGGTAGCATCATC AAATGCATGCCAAACTTAAATAC AGCAGGCTAATAACAACACGC TTGGTTATAGGCATAGATTGC Ta Touch down 55-45°C Touch down 60-50°C Touch down 64-54°C Touch down 60-50°C size range 198-229 88-124 95-106 118-184 PCR Conditions 1 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 18 cycles 2 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 3 30 S from 55°C to 45 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 64 °C to 54 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 4 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 25 cycles 5 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 6 45 °C 30s 50 °C 30s 54 °C 30s 50 °C 30s 7 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s Final extention 8 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min Preservation 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- Date: 2012-3-13 Jinlong 实验五 PCR产物的检测 步骤： 一 治胶 1 在电子天平上称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶。 2 用量筒量取120mLTBE溶液，倒入锥形瓶。 3 将锥形瓶在微波炉中加热三分钟，在沸腾后，轻摇几次，使得琼脂糖全部溶化。 4 放在常温冷却，待65℃左右，（至外边仍然比较烫手，但没有蒸气散出时）。加入0.8μL EB（溴化乙锭），摇匀。 1 － 4 仅适用于首次做胶时参考。 5 将胶槽两端用不干胶封好，倒入30mL左右的溶液，插入胶孔成型用的梳子，待15到20min冷凝。将盛有剩余溶胶的锥形瓶用多层保鲜膜盖好，并用铝箔封口，放在65℃的烘箱中。 二 点样 6点 Loading Buffer。每一次取10μL的红色Loading Buffer，分成五份，每个约2μL，点在事先固定在tip盒盖的石蜡膜上。按照样品的数量，点出相应数量的Loading Buffer水珠。 7 点Ladder DNA标准样，5μL，若是两排胶孔，应该点Ladder DNA标准样。 8 吸取DNA样品，每个吸取4μL，为防止DNA样品的污染，每一次都要换枪头。按照次序点入Loading Buffer的水珠中。 9 将胶放置在电泳槽中，令电泳液将其浸入。注意，胶孔一端要放在负极（黑色电极）一端。 10 点样，先在最左侧的胶孔中点入lambda样，将移液器的量程调至4－5μL，按照顺序，吸取水珠，点入胶孔中，此时不必每一次都换枪头。 三 电泳 11 将电泳仪电压调到80－110V之间，电泳15分钟。 四 紫外光检测 12 取胶：先关闭电源，戴上蓝色在Techtum Lab AB凝胶成像系统中拍照。拍照时用MVPILOT软件，点击摄像机的图标，调整对比度和明暗效果，在左侧MITSUBISHI打印机上打印。保存图像时，点击照相机的图标。 13 完成拍照后，将凝胶丢弃，仪器擦拭干净，并保持Techtum Lab AB的门打开。 实验六 用96孔板提取Scots Pine种子DNA 准备： SP1 在使用前，每200μL加入1uL的RNAse， 如研磨2×96材料，则取SP1 40mL，加入200uLRNAse。 放在65℃烘箱预热。 Elution Buffer 65℃预热 步骤： 1. 取96孔板，每个孔放1颗瓷珠，1粒Scots Pine种子，盖好。 2. 充分研磨破碎1min，在UPSC 6th floor。3700rpm离心1，使碎片落入管底，继续破碎1min。 3. 开盖加入200μL SP1，放65℃ 烘箱中10min，混匀两次，将壁上的液体离心到底部（2000rpm） 4 .加入70μL SP2，盖好，混匀，短离心， 5 .放入-20℃冰箱 10min 6. 3700rpm 离心10min 7. 将上清液移动到1.2mL管中（约200μL） 8. 加入1.5体积的SP3 （约300μL） 9. 盖好，混匀20s， 短离心（到3000rpm） 10. 将柱子板放方孔底座上，每孔加入150μL Equilibration Buffer， 混匀，静置4min， 3000rpm离心 2min 11. 每个管中取500μL样品移到 HiBind DNA柱子板上，置于方孔底座上。 12. 盖好尼龙膜，3700rpm离心 3min。 13. 去掉尼龙膜，倒掉方孔底座中的液体。 14. 加入800μL SPW Wash Buffer， 盖好尼龙膜， 3700离心3min，倒掉方孔底座中的液体。 15. 加入800μL SPW Wash Buffer， 3700离心5min，倒掉方孔底座中的液体，再离心10min，以彻底去掉乙醇，倒掉方孔底座中的液体。放在通风厨10分钟，晾干。 16. 将柱子板放在1.2mL排管上，用100μL 65℃ 预热的Elution Buffer洗脱。在65℃温箱中静置5min。 3700rpm离心 5min。 17. 1.2mL排管盖好，保存在4℃冰箱中，其余丢弃。 对DNA进行常规琼脂糖凝胶电泳检测， 2uLDNA， lambda标准样 2uL 20120329 实验七96孔板PCR 1 稀释模板DNA 将提取到的总 DNA 吸取到96孔板上，根据Nanodrop对DNA的测量结果，用ddH2O稀释到10-20ng/uL，需要根据PCR的次数和每次DNA样品量确定要吸 取的DNA量，保证取样量至少多15uL以上。作为模板DNA，写清楚模板DNA的序号，日期，标签如下 Plate-I，放在4°C保存。 2 准备模板标签 对于96孔板，每一格填写如下信息： 1 序号（1-96，一般按照列保存） 2 DNA序列号（如E4218） 3 树编号 （UID，即每棵树所取的哪颗种子 如 81-8，表示81号树的第8颗种子）。 3 模板DNA取样 用排枪取2μL的模板DNA，加入到到96孔板管底部。由于不带有荧光，模板DNA的枪头可收集起来，可以作为毛细管电泳时混合样品用的枪头，但是要做好标记。 4 混合反应体系 Master Mix No. Conponent Volume per tube Concentration ×25 Storage 1 ddH2O 10.95 - 273.75 RT 2 10×PCR buffer 1.6 - 40 -4°C 3 2.5mM dNTP 1 0.15625 25 -4°C 4 Forward Primer 0.2 0.125 5 -4°C 5 Reverse Primer 0.2 0.125 5 -4°C 6 Top Taq 0.05 2.5U 1.25 -20°C 对于任意一板的PCR反应，需要准备4个1.5mL的ep管，先放在冰盒上，按照1-6的顺序添加各组分到ep管中。盖好盖子，短离心，涡旋，短离心，确保体系混合均匀。 5 用电子移液器（该移液器每次可吸取100μL，由于需要加入的反应体系是14μL，因此只能加7次，注意第一次吸取的液体要打掉，长音表明是最后一次），吸取反应体系，每管加入14μL。 6 在96孔板的边缘标记好Plate号，引物名称等，之后贴Bio-Rad的PCR厚膜，用手柄压实，确保每一管的封口都严密。 7 在振荡器上涡旋4-5下，确保反应体系和模板DNA充分混合。短离心，达到2000rpm以上。 8 按照如下条件，设定touch down PCR: Tab.1 LOP1 TD 64 to 54 Tab. 2 PtTX2146 TD 60 to 50 Tab.3 PtTX3025 TD 55 to 45 Tab. 4 PtTX3107 TD 55 to 45 Tab.5 PtTX3116 TD 60 to 50 Tab. 6 PtTX4001 TD 60 to 50 Tab.7 SsrPt_ctg1376 TD 60 to 50 Tab. 8 SsrPt_ctg4363 TD 64 to 54 Tab.9 SPAC12.5 TD 55 to 45 9 每个PCR需要耗时2.5h左右。反应结束后，将产物放到4°C冰箱中保存。 10. 对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，一般每板随机抽检16个样品，点样的量一般为： Loading Buffer 2.5 μL PCR产物 3μL Ladder DNA 5μL 实验七96孔板PCR 1 稀释模板DNA 将提取到的总 DNA 吸取到96孔板上，根据Nanodrop对DNA的测量结果，用ddH2O稀释到10-20ng/uL，需要根据PCR的次数和每次DNA样品量确定要吸 取的DNA量，保证取样量至少多15uL以上。作为模板DNA，写清楚模板DNA的序号，日期，标签如下 Plate-I，放在4°C保存。 2 准备模板标签 对于96孔板，每一格填写如下信息： 1 序号（1-96，一般按照列保存） 2 DNA序列号（如E4218） 3 树编号 （UID，即每棵树所取的哪颗种子 如 81-8，表示81号树的第8颗种子）。 3 模板DNA取样 用排枪取2μL的模板DNA，加入到到96孔板管底部。由于不带有荧光，模板DNA的枪头可收集起来，可以作为毛细管电泳时混合样品用的枪头，但是要做好标记。 4 混合反应体系 Master Mix No. Conponent Volume per tube Concentration ×25 Storage 1 ddH2O 10.95 - 273.75 RT 2 10×PCR buffer 1.6 - 40 -4°C 3 2.5mM dNTP 1 0.15625 25 -4°C 4 Forward Primer 0.2 0.125 5 -4°C 5 Reverse Primer 0.2 0.125 5 -4°C 6 Top Taq 0.05 2.5U 1.25 -20°C 对于任意一板的PCR反应，需要准备4个1.5mL的ep管，先放在冰盒上，按照1-6的顺序添加各组分到ep管中。盖好盖子，短离心，涡旋，短离心，确保体系混合均匀。 5 用电子移液器（该移液器每次可吸取100μL，由于需要加入的反应体系是14μL，因此只能加7次，注意第一次吸取的液体要打掉，长音表明是最后一次），吸取反应体系，每管加入14μL。 6 在96孔板的边缘标记好Plate号，引物名称等，之后贴Bio-Rad的PCR厚膜，用手柄压实，确保每一管的封口都严密。 7 在振荡器上涡旋4-5下，确保反应体系和模板DNA充分混合。短离心，达到2000rpm以上。 8 按照如下条件，设定touch down PCR: Tab.1 LOP1 TD 64 to 54 Tab. 2 PtTX2146 TD 60 to 50 Tab.3 PtTX3025 TD 55 to 45 Tab. 4 PtTX3107 TD 55 to 45 Tab.5 PtTX3116 TD 60 to 50 Tab. 6 PtTX4001 TD 60 to 50 Tab.7 SsrPt_ctg1376 TD 60 to 50 Tab. 8 SsrPt_ctg4363 TD 64 to 54 Tab.9 SPAC12.5 TD 55 to 45 9 每个PCR需要耗时2.5h左右。反应结束后，将产物放到4°C冰箱中保存。 10. 对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，一般每板随机抽检16个样品，点样的量一般为： Loading Buffer 2.5 μL PCR产物 3μL Ladder DNA 5μL 实验八在CEQ 8000上进行毛细管电泳 一 准备Excel 作为样品的Label 每一板混合样的侧面，应该用记号笔标注清楚 ，例如2012-03-29-Plate-I-a 标签 文件，应该保存在Excel中，待毛细管电泳时，直接拷贝到CEQ8000的界面中。 表 2 96孔板标签的排列 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 69-1-a 69-2-a 69-3-a 69-4-a 69-5-a 69-6-a 69-7-a 69-8-a 69-9-a 69-10-a 69-11-a 143-4-a B 71-1-a 71-2-a 71-3-a 71-4-a 143-1-a 143-2-a 71-7-a 71-8-a 143-3-a 71-10-a 71-11-a 71-12-a C 73-1-a 73-2-a 73-3-a 73-4-a 73-5-a 73-6-a 73-7-a 73-8-a 73-9-a 73-10-a 73-11-a 73-12-a D 74-1-a 74-2-a 74-3-a 74-4-a 74-5-a 74-6-a 74-7-a 74-8-a 74-9-a 74-10-a 74-11-a 74-12-a E 81-1-a 81-2-a 81-3-a 81-4-a 81-5-a 81-6-a 81-7-a 81-8-a 81-9-a 81-10-a 81-11-a 81-12-a F 82-1-a 82-2-a 82-3-a 82-4-a 82-5-a 82-6-a 82-7-a 82-8-a 82-9-a 82-10-a 82-11-a 82-12-a G 84-1-a 84-2-a 84-3-a 84-4-a 84-5-a 84-6-a 84-7-a 84-8-a 84-9-a 84-10-a 84-11-a 84-12-a H 86-1-a 86-2-a 86-3-a 86-4-a 86-5-a 86-6-a 86-7-a 86-8-a 86-9-a 86-10-a 86-11-a 86-12-a 二 待检 样品的混合 1 取96孔上样板和PCR中吸取过DNA的10μL枪头。 2 按照顺序排好PCR产物，按照以下量, 用10uL排枪分组添加如下产物到管底部。 注意，每个上样板都由三种产物混合，每次DNA吸取后，都要换枪头。 Table 1 Information for the labeld primers Primer Label PCR frag length Color Group Volume (uL) SsrPt_ctg1376 Cy5.5 88-124 Green 1 a 2 PtTX4001 Cy5 198-229 Blue 1 a 0.5 PtTX3107 D2 150-174 Black 1 a 4.5 SPAC12.5 Cy5.5 118-184 Green 2 b 2 SsrPt?_ctg4363 Cy5 95-106 Blue 2 b 0.5 PtTX3025 D2 211-305 Black 2 b 4.5 LOP1 Cy5.5 153-189 Green 3 c 2 PtTX3116 Cy5 115-169 Blue 3 c 0.5 PtTX2146 D2 176-264 Black 3 c 4.5 3取塑料纸盒，一般每板需要两个2mL ep管的HD，倒入纸盒内。取黄色枪头，每一管，加入30uL 已经混合好的Hi-Di (HD)，无需换枪头。 4 用新的黄枪头，将每一列孔的样品反复吸放几次，以混合均匀。 贴96孔板塑料膜。 5 短离心到2000rpm。 6（如有必要，每个孔滴入染料包内附带的一滴矿物油，防止样品蒸发）。 二 准备Separation Buffer板 地点：UPSC ，B3-28-48 1 取Buffer取样槽，倒入已经稀释好的Separation buffer，用电子排枪每个Separation buffer板孔中放入250uL的separation buffer。 确认无误后，将剩余Separationbuffer倒回瓶内。用双蒸水冲洗Buffer取样槽，用吸水纸擦干，放回原处。 2 取PAGE胶（在4°C冰箱），形如注射器，注意要事先将包装剪开。 三 从CEQ 8000中拷贝上一次运行的数据 1 双击打开CEQ CEQ Main Database(屏幕正下方中央倒数第五个图标) 在新开启的窗口下的导航栏中，选择对应的文件夹(Jinlong), 点击右键，选择 set as working database. 2 回到Jinlong 用户下，选择Default Sample Data ，在右侧显示的窗口中，将文件按照时间排序。 3 选择要导出的文件，右键export，选择scf作为导出格式。 4 将导出的文件拷贝到桌面Jinlong 文件夹中，新建一个文件夹，命名按照如下规则 例如: 2012-03-27-Plate-I-a （a表示第一组， 即SsrPt_ctg1376, PtTX4001和PtTX3107的混合样） 2012-03-28-Plate-I-b （b 表示第二组， 即SPAC12.5, SsrPt_ctg4363和PtTX3025的混合样） 2012-03-29-Plate-I-c （c表示第三组，即LOP1, PtTX3116 和PtTX2146的混合样） 2012-03-29 即日期 2012年3月29日 Plate-I 表示是第一板DNA的扩增产物。 5 将整个文件夹拷贝到USB Flash Disk中。 五 上样及运行： 注意： 一定要按照CEQ8000操作系统中的提示，换Separation Buffer， DNA sample 及 Wetting Tray， Gel Catridge。 1 打开CEQ CEQ Main Database (屏幕正下方工具栏的倒数第五个图标) 选择Jinlong右键 set as working database 2 洗Wetting tray。点击工具栏的Run图标，在新界面的菜单中，点击Replenish Replenish wetting tray，提示 Do you want to replesh the wetting tray? 点OK。当出现上面的对话框显示为绿色时，可以打开上盖，wetting tray两端的卡子，取下Wetting tray， 打开后，倒掉里面的水及胶的混合液，用双蒸水冲洗。擦干后放回。 3 安装样品，在里面的支架上放样品，放好后再揭开贴膜，在外面的支架上放separation buffer，盖好separation buffer板的盖子, 点Done。 4 如果之前已经将胶卸载，并安装了黄色的Plug，则必须要从 Install gel catridge开始（Release gel catridge为灰色）。点击Install gel catridge，稍等几分钟后，“没有胶或者胶已经泄露”等信息，点击release gel。如果前面的胶未卸载，则直接点击Release gel catridge即可换下前面剩余的胶柱在注射器中。 5若提示 “Do you wish to release the gel cartridge?”,点OK。待出现“you may now open gel access and change gel catridge”的对话框，则可以打开下面的盖子，卸下已经安装好的黄色塞子（plug），将盛满胶的注射器的安装好。点击 ReplenishInstall gel catridge,等待新胶柱安装好。 6. 用Direct control打出一些胶，目的是防止胶柱前端的空气进入毛细管中。一般需挤出为0.2mL路径： 菜单 Direct control Manifold Purge 输入0.2mL即可。 7. 在屏幕正下方的控制界面中，点击Sample setup（工具条第一个），选择Create a new sample，从excel中拷贝96孔板的样品标签。 在出现的表格中，将96孔板的名称标签粘贴到两个view中（在页面最上面的check point）。第一个界面，每一列的最下方，都要选取Frag3，两个页面核对无误后保存，文件名参照统一命名格式 如 2012-03-29-Plate-I-a。表格将从白色变成蓝色。 8. 点击右上角的Run sample Plate 若出现对话框 Capillary Array usage exceeded. Do you want to continue? 选择 Yes Select a sample plate to Run，选择刚刚保存的2012-03-29-Plate-I-a， 9 新弹出的屏幕左侧显示的是Buffer，右侧显示样品，高亮部分表明该板对应位置应该有样品和缓冲液。点击左下角的 Start开始进行毛细管电泳。 10 样品完成后的卸载和塞子安装。96孔板的毛细管电泳大约耗时10h，注意查看Log文件。全部结束后，冲洗wetting tray， Replesh Replesh wetting tray, 冲洗好后，放回。点击Replenish Release gel catridge , 提示 “Do you wish to release the gel catridge?” 点OK,等待1 – 2min， 胶柱卸载。 11. 换下用过的多半管胶，塞入黄色的塞子（Plug In），关好门后，显示点击 ReplenishInstall Gel catridge 出现对话框，Install Plug In. 将没用用过的胶放回4°C冰箱保存。
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[转载]PCR的小女孩——原著安徒生
热度 1 pkucarer4300 2012-12-16 12:53
实验室里冷极了，没有窗户，不知道是白天还是黑夜。这是一周的最后一天——周 末。在这又冷又黑的晚上，一个蓬头散发的小女孩在试验台前坐着。她从家里出来的时候 还穿着一件外套，但是有什么用呢？那是一件很大的外套──那么大，不知是哪一年买 的。她工作的时候的，就穿上白大褂了，实验室的师弟嘲笑说，何必穿实验服呢，你的破大衣都可以当抹布了。 小女孩只好一个人做实验，一双小手被PE手套捂得苍白。她的面前的胶板上有一串点样孔，还有好几管菌落pcr产物。这一整天，目的基因还是没连上质粒，谁也没帮过她。 可怜的小女孩！她又冷又饿，哆哆嗦嗦地点样。灯光落在她的干枯的长头 发上，那头发卷曲着披在肩上，看上去很久没梳，不过她没注意这些。每个桌上都堆满 了文献，实验室飘着一股LB培养基的香味，因为这是老板催要结果的时间——她可忘不了这 个。 她在上完出某个样后停了下来，蜷着趴在桌子上。她觉得更冷了。她不敢跟老板说，因 为她试了所有的taq酶，试剂盒，质粒，没p出阳性的菌落，老板一定会骂她的。再说，换做别的题目跟这个一样难。她们头上只有paper，虽然网上有好多类似的文献，但到她这里就是不work。 她的头脑几乎绝望了。啊，哪怕一次小小的成功，对她也是有好处的！她敢把上万 块钱的酶全丢进去连接载体，能够把基因转进去吗？她终于又拿出一块跑完的胶。紫外光照上去了！一个一个样点在胶板上出现了！她把小手拢在紫外灯下。多么温暖多么明亮的小点啊，简直像一支小小的蜡烛。这是一道奇异的火光！小女孩觉得自己好像坐在一台测序仪的显示器前面，显示器还是全新锃亮的，颜色鲜艳，字迹清晰，上边的显示的序列明明就是目的基因，多么舒服啊！哎，这是怎么回事呢？她刚把头伸过去，想看的仔细一些，她坐在那儿，眼前的胶板上显出一行刺眼的阴性、引物二聚体、模板，就是没有阳性菌落。 她又上了一遍样。用150v跑完又用100v再跑。紫外灯的光落在桌子上，那儿忽然变得像打印出来的paper那样洁白工整，她可以一直看到paper上的字迹。Nature的logo，Abstract和Instroduction。更妙的是这篇paper的一作，赫然署着自己的名字！看上去那么诱惑，一直向这个穷苦的小女孩走来。这时候，新跑完的胶板上还是只有阴性的样点，她面前只剩一张又硬又旧的桌子。 她p了十几个菌落，又跑了一块胶。这一回，她感觉自己坐在布置整齐的会议室里。条幅上写着“毕业答辩”，比她去年师姐毕业时用的条幅还要大，还要美。红色的条幅上贴着那几 个白色的黑体字，投影仪屏幕上许多幅美丽的彩色画片，跟顶级会议里的presentation一个样，在向她眨眼睛。小女孩向画片伸出手去。这时候，板子又爬好了，不出意外，没新点。只见ppt上的图片越升越高，最后成了在天空中闪烁的星星。有一颗星星落下来了，在天空中划出了一道细长的红光。 “有一个什么人快要死了。”小女孩说。唯一疼她的师姐毕业前的时候告诉过她：一颗星星落下来，就有一个灵魂要到沃森和克里克那儿去了。 她又连接了一管载体。这一回，她把所有的酶的量都加大了。师姐出现在灯光里，是 那么温和，那么慈爱。 “师姐！”小女孩叫起来，“啊！请把我带走吧！我知道，反应一结束，您就会不见的，像那漂亮的跑胶，发表的paper，布置好的答辩会议室一个样，就会不见的！” 她赶紧拿出所有的胶板，放在紫外灯下，要把师姐留住。一大堆胶板在紫外灯下放出明亮的光，把实验室照得跟白天一样明亮。师姐从来没有像现在这样高大，这样美丽。师姐把小女孩抱起来，搂在怀里。她们俩在光明和快乐中飞走了，越飞越高，飞到那没有PCR，没有论文，也没有毕业的地方去了。 第二天清晨，这个小女孩坐在实验台前上，两腮通红，嘴上带着微笑。她死了，在周末 的实验室累死了。新一周的太阳升起来了，照在她小小的尸体上。小女孩坐在那儿，手 还握着正要上样的EP管。 “她想自己转一个基因……”人们说。谁也不知道她曾经看到过多么美丽的东西 ，她曾经多么幸福，跟着她师姐一起走向新世界的幸福中去。
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屈武斌 设计的第二代PCR引物质量评估软件MFEprimer-2.0已可用
热度 3 zcgweb 2012-9-6 01:07
第二代PCR引物质量评估软件：MFEprimer-2.0，可以针对全基因组数据库在1-3s内预测任意PCR引物对的特异扩增产物和非特异扩增产物： http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/MFEprimer-2.0/ 该工作已发表在今年6月份的核酸研究(NAR)上，欢迎大家使用该工具，论文参考信息如下： Qu W, Zhou Y, Zhang Y, Lu Y, Wang X, Zhao D, Yang Y, Zhang C* . MFEprimer-2.0: a fast thermodynamics-based program for checking PCR primer specificity. Nucleic Acids Res . 2012 Jul;40(Web Server issue):W205-8. Epub 2012 Jun 11. QuWB 2012 MFEprimer-2.0 NAR.pdf 第一代MFEprimer于2009年发表在Bioinformatics上： Wubin Qu, Zhiyong Shen, Dongsheng Zhao, Yi Yang*, and Chenggang Zhang* . MFEprimer: multiple factor evaluation of the specificity of PCR primers, Bioinformatics , 2009, 25(2):276-278 QuWB 2009 MFEprimer Bioinformatics.pdf 这两篇论文都是由我们实验室 屈武斌 完成的，两篇论文PDF版本均见附件。
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生态学文献9：用蚂蟥来探究动物多样性
热度 1 mengchanghe 2012-5-23 16:39
Baerholm Schnell et al 2012- leech blood screening mammals .pdf 很多珍稀的，害羞乃至神秘的物种用常规的手段都很难检测（如人工调查、摄像头拍摄），以至于他们极其难以评估。而蚂蟥血提供了很好的依据！一个蚂蟥体内的血通常20 days到几个月都有，而且一般都很单一，即消化了再去吸取新的血，而且血本身也会降解。由此，本研究测量了25个蚂蟥体内的血，发现21个含有6个珍稀物种的血，技术用的是PCR技术，由此，本研究充分证明了蚂蟥血可以作为一个很好的指标。 这文章很短，2页，但是观点确实新颖，当然不足之处是 数据真实性很难判定，21个就有6个珍稀动物，F表示impossible,然后样本量确实有待提高，杀蚂蟥的方法还有两种不统一，总之，本文是观点很好，可以被推广~
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pcr product length calculation by primer premier
graceguan9 2012-3-30 22:29
How to find the pcr product length, when the primer pairs are known by primer premier 1 F primer Ctrl V as is to get the seq NO 2 R primer Ctrl V reverse complement to get the seq NO and the length 3 the length of pcr product is seq NO(R primer)+ the length(R primer)-seq NO(F primer)
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PCR protocol
热度 1 qin13696 2011-10-3 15:57
先把标题写出来 空了来补充 哈哈
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用PCR板建造我的“中华世博馆”
热度 17 Macrofungi 2011-6-3 15:35
PCR板建造我的“中华世博馆” 材料： PCR 板 300 块左右，大剪刀一把， 502 胶水三瓶共 15mL ，尺子一把。 工时： 8 小时。 作品：中华世博馆，以上海世博会中国馆为模型。 大小：与世博馆的比例为2000：1左右，实际高33cm左右，底座33×33cm。顶层56×56cm。 工作现场， 8个小时，两个人的努力下，终于初见成效 俯视图 仰视图 臭美一个，O(∩_∩)O哈哈~ 这张也是我答辩ppt的致谢图片， 好搭档，我的！ 三年的PCR实验材料，300块左右的96孔板。
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[转载]用叶片直接PCR（非试剂盒）
edisonlou 2011-4-28 15:55
LEAF PCR PROTOCOL (Klimyuk et al., 1993, TPJ 3: 493-494) 1) Samples are harvested in 1.5 ml tubes and stored on ice. 2) 40ul of 0.25N NaOH was added and the samples boiled for 30 sec. 3) 40ul of 0.25N HCl then 20ul Tris mix was added and the samples boiled for another 2 min. -tissue samples can then be used immediatly or stored at 4 C for several weeks. -The amount of tissue used in each PCR reaction should not exceed 2mm2 or the reaction will not work. A small amount of treated material can be excised for use in a PCR reaction with a sterile Gilson tip. PCR reaction conditions are as follows: total volume= 50ul for 5.5 reactions 10X buffer 5ul 27.5uls 10mM dNTPs 1.25uls 6.875uls primer A 2.5uls 13.75uls primer B 2.5uls 13.75uls dH2O 38.75uls 213.1uls taq poly 1.0ul 5.5uls 95 C 10min 1X 95 C 30sec 55 C 30sec 72 C 45sec 30X 72 C 10min 1X run 15ul on a 2% agarose gel note: 2.5 times more primer is used and 2 times more taq polymerase in the leaf PCR protocol. If you could get by with less, Jonathan Jones would have done so! Stocks 0.25N HCl 0.25N NaOH Tris buffer: 0.5M Tris pH 8.0 0.25% Nonidet P-40 LEAF PCR ON ARABIDOPSIS TISSUE WITHOUT ALKALINE TREATMENT Preparation of Master mix: 1 x Taq-buffer 1.5 mM MgCl2 200 mM of each dNTP 1 mM each primer 0.5 ml 20 x Taq polymerase The mix is stored on ice until use. Preparation of leaf tissue: Put the leaf in a small Petri-dish. Make a hole in a leaf with the narrow end of the Pasteur pipette (a forceps might be helpful) and place the leaf in a PCR-tube, if necessary by blowing. On ice, add 50 ml the Master mix. Running the cycles: Transfer the tubes directly from ice to the prewarmed 94 C block on the Robocycler and run the following cycles: 94 C for 3 min 1 x 94 C for 30 s; Tann.* for 1 min; 72 C for 1 min-1 min 30 s 35 x 72 C for 10 min (optional) 1 x Appropriate controls: Positive Negative For screening transgenics: plasmid ColO ColO with endogenous primer-set g DNA gDNA with endogenous primer-set - DNA *The annealing temperature (Tann.) should be 2-3 C below the calculated Tann..
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LAMP技术的优缺点
热度 3 SNPs 2011-1-19 01:10
我最早知道LAMP技术还是在2003年非典期间。当初我们做了一个多重PCR分子鉴别诊断，同时检测十多个呼吸道细菌和病毒病原体（包括非典病毒），而和我们合作在国内做临床报批的单位，因为手头有较多的病人标本，也在给日本的那家公司做LAMP非典诊断的临床。 这几年，LAMP技术在国内推广得很好。我走到那里都有人跟我讲LAMP的应用。的确，LAMP技术有许多明显的优点： （1）恒温扩增，扩增阶段对仪器的要求低。 （2）视觉直观检测，不需要检测仪。 （3）反应速度快，敏感性高。 （4）用多个引物，特异性好。 （5）价格便宜。 这么多优点，就是该技术能“热”起来的根本原因。 不过，仔细分析这个技术，你就会发现它的一些问题： 首先，一个最突出的问题就是它 没有办法做多重扩增 ，两三个靶点可以，再多难度就非常大了。 其次，它在敏感性上，定量能力上,封闭系统等方面不如实时PCR。 还有，说是恒温扩增不需要仪器，可是大多数人做LAMP都用PCR仪器保温。 对那些不需要多重检测的应用，LAMP不失为一种可行的方法。但是，（因为没有封闭系统）避免污染造成的假阳性是一个问题。（因为没有多重）如何设立反应体系的内外对照，也是问题。还有就是和上游的标本处理，核酸提取步骤如何整合的问题。 如果LAMP技术出现早10年，出现在九十年代初，而不是00年代初，那它的市场前景一定很好。毕竟，它是对传统PCR专利的一个挑战。可是现在，常规PCR的专利已经过期，LAMP技术既要和常规PCR竞争，又要和实时PCR竞争。仅靠“恒温”来竞争就显得比较单薄了。 价格便宜也是相对的，因为现在常规PCR试剂已经很便宜了，常规PCR仪器也便宜到不能再便宜了。还有，便宜，对用户是好消息，可是对厂家就是悲歌了。没有相应的利润率，如何把前期的研发费用赚回来？如何给厂家和投资人换得应有的回报？如何成为一个可持续发展的公司？ 对那些在LAMP“平台”上开发产品的公司来说，和当初PCR技术一样，一个主要的问题就是如何建立竞争壁垒？太容易做的东西，你能做，他人也能做，你如何胜出？尤其对那些跟大流后期参与进来的公司和开发者来说就更难：能开发的人家都已经开发完了。又晚了一步。 核酸扩增技术有许多种（如Rolling circle, branched DNA, NASBA等），许多方法都是研究人员想出来去绕开原始的PCR专利的。所以我们在选择技术平台以前，一定要问问自己：“这个平台比现有的标准PCR技术到底好在那里？我是否值得在这个技术上投入我的精力？这个技术是否是我的机会？如果我在这个技术平台上做研发，结果是一个论文？还是一个产品？一系列产 品？这些产品能赚钱吗？有多大的市场？能支撑一个公司吗？” 选择技术平台有点象寻找有潜力的股票，选好了大有益处，选不好可能满盘全输。科研人员这一辈子能“赌”几回？所以我们在全身心投入进去以前，最好是多问几个为什么。
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【转载】PCR防污染方法大全
han5 2010-12-3 18:44
一． 污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。 （一）划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求 实验 操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： 1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备； 2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增； 3. 产物分析区，凝胶 电泳 分析，产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备PCR扩增产物分析产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 （二）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的 DNA 和其他来源的DNA： 1． PCR用水应为高压的双蒸水； 2． 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制； 3． 引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 (三) 实验操作 注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： 1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； 7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 8. 重复实验，验证结果，慎下结论。 二． 追踪污染源 如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。 （一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等） 检测 阴性的标本中检测出极微量的靶 分子 。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。 （二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。 +^,z}( Ak 环境污染中常见的污染源主要有： 1. 模板提取时真空抽干装置； 2. 凝胶电泳 加样器； 3. 电泳装置； 4. 紫外分析仪； 5. 切胶用刀或手术刀片； 6. 离心机； 7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等； 此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。 8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。 三．污染处理 （一）环境污染 1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤； 2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。 （二）反应液污染 可采用下列方法之一处理： 1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列； 2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR；  3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法； 4. g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。 （三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。 1. 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对 RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。 2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。 3. dU引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR产物中仅5ˊ端带dU。UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。 4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。 5. 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。 （四） 固相捕获法 用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一 生物 素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。 （五）RS-PCR法（RNA-specific PCR） 也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A区）有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0个核苷酸（C区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使 cDNA与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。 （六）抗污染引物法 该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。 转载自： http://bbs.biogo.net/read.php?tid=168253
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管理好PCR实验室
qwangbio 2010-11-30 16:32
最近学习的过程中总是能碰到Y. M. Dennis Lo! 可能是人家的影响太大了，也可能是我这些天就一直在人家精通的领域里瞎溜达。 前几天同事张晶遇到PCR污染的问题，这个问题确实让人郁闷。头儿组织大家学习PCR实验室的管理，认识PCR污染的严重性......我最后的体会就是由于我这边平台的一些特殊条件和限制，整个实验室里我这边重蹈覆辙的可能性最大！ 唉，突然感觉PCR就像媳妇听话时，你先想让她干什么，她就干什么；不听话时，你不想让她干什么，她就越干什么，还整天和你干仗！但所有人都会告诉你，责任不在她，是你这个男人平时对她不够好...... 这么多年来积累了一个思维惯势复杂问题简单化，简单问题复杂化！ 今天看到Lo编著的第二版 Clinical Applications of PCR 里面关于建立PCR实验室的章节 Setting up a polymerase chain reaction laboratory ，就顺便学习一下，以后肯定用得着！ PCR的最重要优势就是极度敏感，同时最大的弱点也是极度敏感（这里不能再说媳妇了，其实研究表明男人比女人更容易敏感......），因外来污染容易造成假阳性的出现（这里用男女关系来比喻再恰当不过了，哈哈）！所以建立PCR实验室时，首先就要考虑防止污染，尤其在临床诊断实验室里，人命关天啊。 PCR污染主要来源有样品交叉污染；实验室环境的重组质粒污染；还有先前PCR引物和产物的携带污染(carry-over contamination)；最后是在DNA提取和PCR的过程中从个人和试剂过程中导致的DNA模板在实验室中无所不在。其中样品污染的波及范围毕竟有限，携带污染和模板污染的影响就很严重了。列举个数字看看，即便一管含有2个分子模板的50 l 的PCR反应体系经历40个循环扩增后，理论上靶分子数可达到 1 099 511 627 776 个,即10 12 个分子。其中0.05 l 里也含有10 9 个分子，足以引起下一个相同PCR反应的大混乱...... 那么这0.05 l 的体积又是从什么途径传播的呢？我们熟悉的试剂、移液器、实验室表面，甚至还在某个 操作人员的脸部上皮细胞上 ...... Lo在文中提出了防止PCR污染的原则 1.严格的物理分离 建议将PCR间分成3个区域：样品制备去 (sample preparation stage)、 PCR配制区 (PCR setup stage)、 后PCR区 (post-PCR stage) 。无论多么小的仪器都必须限制在所在区域内，包括实验记录本也不能在不同区域内携带。如果必须要传送，方向也必须是从 pre-PCR 至 post-PCR， 决不能反方向传送。 a.样品制备区是用来处理样品原料的，例如DNA和RNA的提取。PCR产物是不允许进入此区域的。包括移液器和实验服在内，用于样品制备的仪器和试剂也要单独存放。进入人员必须佩戴手套，并要时常更换。总之，样品处理过程越简单，引入污染的可能性就越小。冰箱等储藏设备要单独放置，仅用于样品准备。 b. 建议PCR配制区是用来在洁净工作台中配制PCR反应的，必须保持此区域的洁净。仪器和储藏设备应放在靠近PCR配制区的位置。向PCR试剂中添加样品（模板）必须在一个单独的区域，DNA或RNA样品决不允许进入PCR配制区。 c. PCR仪的位置取决于详细的扩增需求。包括单轮PCR和不需要中间取样分析的PCR反应来说PCR仪可以放在 post-PCR 区域。对于必须开盖的 PCR ，如 nested PCR，PCR 仪应放在除这三个区域以外的第四个单独隔离区域。移液管等也随之单独分配。 d. 后PCR区域是用于分析PCR产物的，包括电泳、酶切和质谱分析。后PCR区域的物品不允许回到前面提到的区域，包括实验记录本和笔。 2. 制定PCR实验室规定，是污染的风险降到最低。 a. 所有的PCR试剂都要小量分装。可以高压灭菌的试剂都要做灭菌处理。 b. 经常更换手套，建议使用帽子和口罩，因为某些个体更容易造成污染。 c. 建议使用防气溶胶移液管。 d. 当配制多个反应时，配制 Master Mix 有助于减少加样的次数，也就减少了污染的可能性。 e. PCR 的循环数保持尽量最少，因为过度敏感的试验更容易污染。 f. 假如有的选择，最好使用一次性耗材。 g. 如果有可能，不同的人员分配到项目的不同区域中。如不可行，最好安排项目时间表或工作周，如 pre-PCR 和 post-PCR 在不在同一天操作。 h. 采用封闭PCR体系，如Taq man体系用荧光信号检测PCR产物，不必开盖处理PCR后样品处理。所以这种体系的携带污染比传统体系少很多。这一点对临床诊断特别重要。 3. 专门的防污染方法 a. 在加入DNA模板前，紫外照射可以破坏任何污染的DNA。因为这个方法是基于邻近胸腺嘧啶的交联，所以PCR的序列对去污然的效率有部分影响。某些引物对紫外的破坏作用更加敏感，就需辐射后再添加。干粉DNA对紫外有更强的抵抗力。这就意味着紫外去除实验室表面的DNA污染的能力是有限的！总之，洁净室的实验室和物理分区才是最有效的防污染方法，紫外照射只能提供一个额外的保护。 b. 限制酶切处理 在加入模板DNA之前，加入限制性内切酶抑制任何污染。排除污染之后，添加模板之前热变性破坏酶活性。 c. Dnase I处理 d. 掺入dUTP，用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)处理 由于先前的PCR扩增实验中的携带PCR产物是PCR污染的首要来源，所以应先减少PCR产物污染，而不是DNA模板污染。Longo在PCR期间用dUTP替代dTTP，含有dU的携带PCR产物在以后的扩增实验之前就被UNG孵育破坏了。需要注意的是，dUTP替换dTTP时，经常需要重新调整MgCl 2 的浓度，一般情况下，600mM dUTP使用3mM MgCl 2 。在起初开始热变性后，UNG活性被破坏，所以新合成的PCR产物不会被降解。然而当温度低于50度时，UNG会复性，所以必须用50度以上温度退火。
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[转载]PCR的小女孩
oyjenvol 2010-11-20 09:43
实验室里冷极了，没有窗户，不知道是白天还是黑夜。这是一周的最后一天 周末。在这又冷又黑的晚上，一个蓬头散发的小女孩在试验台前坐着。她从家里出来的时候还穿着一件外套，但是有什么用呢？那是一件很大的外套 ── 那么大，不知是哪一年买的。她工作的时候的，就穿上白大褂了，实验室的师弟嘲笑说，何必穿实验服呢，你的破大衣都可以当抹布了。 小女孩只好一个人做实验，一双小手被 PE 手套捂得苍白。她的面前的胶板上有一串点样孔，还有好几管菌落 pcr 产物。这一整天，目的基因还是没连上质粒，谁也没帮过她。 可怜的小女孩！她又冷又饿，哆哆嗦嗦地点样。灯光落在她的干枯的长头发上，那头发卷曲着披在肩上，看上去很久没梳，不过她没注意这些。每个桌上都堆满了文献，实验室飘着一股 LB 培养基的香味，因为这是老板催要结果的时间 她可忘不了这个。 她在上完出某个样后停了下来，蜷着趴在桌子上。她觉得更冷了。她不敢跟老板说，因为她试了所有的 taq 酶，试剂盒，质粒，没 p 出阳性的菌落，老板一定会骂她的。再说，换做别的题目跟这个一样难。她们头上只有 paper ，虽然网上有好多类似的文献，但到她这里就是不 work 。 她的头脑几乎绝望了。啊，哪怕一次小小的成功，对她也是有好处的！她敢把上万块钱的酶全丢进去连接载体，能够把基因转进去吗？她终于又拿出一块跑完的胶。紫外光照上去了！一个一个样点在胶板上出现了！她把小手拢在紫外灯下。多么温暖多么明亮的小点啊，简直像一支小小的蜡烛。这是一道奇异的火光！小女孩觉得自己好像坐在一台测序仪的显示器前面，显示器还是全新锃亮的，颜色鲜艳，字迹清晰，上边的显示的序列明明就是目的基因，多么舒服啊！哎，这是怎么回事呢？她刚把头伸过去，想看的仔细一些，她坐在那儿，眼前的胶板上显出一行刺眼的阴性、引物二聚体、模板，就是没有阳性菌落。 她又上了一遍样。用 150v 跑完又用 100v 再跑。紫外灯的光落在桌子上，那儿忽然变得像打印出来的 paper 那样洁白工整，她可以一直看到 paper 上的字迹。 Nature 的 logo ， Abstract 和 Instroduction 。更妙的是这篇 paper 的一作，赫然署着自己的名字！看上去那么诱惑，一直向这个穷苦的小女孩走来。这时候，新跑完的胶板上还是只有阴性的样点，她面前只剩一张又硬又旧的桌子。 她 p 了十几个菌落，又跑了一块胶。这一回，她感觉自己坐在布置整齐的会议室里。条幅上写着 毕业答辩 ，比她去年师姐毕业时用的条幅还要大，还要美。红色的条幅上贴着那几个白色的黑体字，投影仪屏幕上许多幅美丽的彩色画片，跟顶级会议里的 presentation 一个样，在向她眨眼睛。小女孩向画片伸出手去。这时候，板子又爬好了，不出意外，没新点。只见 ppt 上的图片越升越高，最后成了在天空中闪烁的星星。有一颗星星落下来了，在天空中划出了一道细长的红光。 有一个什么人快要死了。 小女孩说。唯一疼她的师姐毕业前的时候告诉过她：一颗星星落下来，就有一个灵魂要到沃森和克里克那儿去了。 她又连接了一管载体。这一回，她把所有的酶的量都加大了。师姐出现在灯光里，是那么温和，那么慈爱。 师姐！ 小女孩叫起来， 啊！请把我带走吧！我知道，反应一结束，您就会不见的，像那漂亮的跑胶，发表的 paper ，布置好的答辩会议室一个样，就会不见的！ 她赶紧拿出所有的胶板，放在紫外灯下，要把师姐留住。一大堆胶板在紫外灯下放出明亮的光，把实验室照得跟白天一样明亮。师姐从来没有像现在这样高大，这样美丽。师姐把小女孩抱起来，搂在怀里。她们俩在光明和快乐中飞走了，越飞越高，飞到那没有 PCR ，没有论文，也没有毕业的地方去了。 第二天清晨，这个小女孩坐在实验台前上，两腮通红，嘴上带着微笑。她死了，在周末的实验室累死了。新一周的太阳升起来了，照在她小小的尸体上。小女孩坐在那儿，手 还握着正要上样的 EP 管。 她想自己转一个基因 人们说。谁也不知道她曾经看到过多么美丽的东西，她曾经多么幸福，跟着她师姐一起走向新世界的幸福中去。 （Quoted from:http://bbs.bioon.net/bbs/home.php?mod=spaceuid=658238do=blogid=13001)
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A very good Real-Time PCR manual for beginners
jones 2010-6-24 20:35
这两本手册是美国Applied Biosystems公司7300-7500型实时定量PCR仪的使用说明书，对于Real-time PCR新手入门很有帮助。很不容易在网上找到pdf版，并稍做修正，需要做这方面的朋友可以参考一下。 手册包括相对定量与绝对定量两部分，下载地址如下： 点击这里下载
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多重PCR用户的福音：MPprimer and MFEprimer
zcgweb 2010-4-17 23:59
最近我们实验室在BMC Bioinformatics上发表了多重PCR引物设计程序MPprimer，对于提高PCR实验的效率具有一定帮助，有兴趣的朋友可以看看： http://www.biomedcentral.com/1471-2105/11/143/abstract Software MPprimer: a program for reliable multiplex PCR primer design Zhiyong Shen , Wubin Qu , Wen Wang , Yiming Lu , Yonghong Wu , Zhifeng Li , Xingyi Hang , Xiaolei Wang , Dongsheng Zhao and Chenggang Zhang BMC Bioinformatics 2010, 11 : 143 doi:10.1186/1471-2105-11-143 Published: 18March2010 Abstract (provisional) Background Multiplex PCR, defined as the simultaneous amplification of multiple regions of a DNA template or multiple DNA templates using more than one primer set (comprising a forward primer and a reverse primer) in one tube, has been widely used in diagnostic applications of clinical and environmental microbiology studies. However, primer design for multiplex PCR is still a challenging problem and several factors need to be considered. These problems include mis-priming due to nonspecific binding to non-target DNA templates, primer dimerization, and the inability to separate and purify DNA amplicons with similar electrophoretic mobility. Results A program named MPprimer was developed to help users for reliable multiplex PCR primer design. It employs the widely used primer design program Primer3 and the primer specificity evaluation program MFEprimer to design and evaluate the candidate primers based on genomic or transcript DNA database, followed by careful examination to avoid primer dimerization. The graph-expanding algorithm derived from the greedy algorithm was used to determine the optimal primer set combinations (PSCs) for multiplex PCR assay. In addition, MPprimer provides a virtual electrophotogram to help users choose the best PSC. The experimental validation from 2x to 5x plex PCR demonstrates the reliability of MPprimer. As another example, MPprimer is able to design the multiplex PCR primers for DMD (dystrophin gene which caused Duchenne Muscular Dystrophy), which has 79 exons, for 20x, 20x, 20x, 14x, and 5x plex PCR reactions in five tubes to detect underlying exon deletions. Conclusions MPprimer is a valuable tool for designing specific, non-dimerizing primer set combinations with constrained amplicons size for multiplex PCR assays.
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MgCl2 vs MgSO4 for PCR
jones 2009-5-19 16:28
(Text adoptedfrom www.protocol-online.org ) I often wondered, why some companies supply their PCR Ingredients with MgCl2 and some with MgSO4. Is there ANY difference between them ? -Fedex- Not much difference, won't affect normal PCR, where the key is the amount of available Mg2+. I think that SO42- might be useeful in methylation PCR, but I am not sure. -bob1- Recipes using Tris-HCl tend to use MgCl2, while recipes employing Tris-SO4/(NH4)2SO4 tend to use MgSO4. -tfitzwater-
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PCR常用优化策略
热度 1 jones 2009-5-2 12:33
(Collected from the INTERNET) PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时改变已知对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。 1、降落PCR（Touch Down PCR) 降落PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法，它不是用许多反应管和每管用不同的试剂浓度和循环参数，而是用一个反应管或一小组反应管，在适合于扩增目的产物而不得到人为产物或引物二聚体的循环条件下反应；设计多循环反应的程序，使相连循环的退火温度越来越低、由于开始时的退火温度选择高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平。这个策略有利于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中一直处于主导地位。由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在降落PCR中必需应用热启动技术。 当引物和模板的同源性未知时，降落PCR尤其有价值，当引物是根据氨基酸序列设计的简并引物时，或者扩增多基因家族成员时，或者想进行进化PCR时经常会碰到这种情况。编设降落PCR程序的目的是要设定一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃左右。目前大多数的PCR仪上都可以很方便地进行降落PCR。 2、加入增强剂 一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲胺酰（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100g/mL）等都可以作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。 3、Mg2＋浓度调整 Mg2＋浓度是一个最容易控制的参数，因为所有的浓度变化都可以在不同的反应管中同时进行。Taq DNA聚合酶的供应商现在除了提供标准缓冲液外还单独提供MgCl2溶液，以简化Mg2＋浓度的调节。一个典型的两步优化过程可以首先包括Mg2＋浓度增幅为0.5mmol/L的从0.5mmol/L到5mmol/L的一系列反应；当Mg2＋浓度范围缩小以后再做第二轮优化，采用几个增幅为0.2或0.3mmol/L的Mg2＋浓度。 4、优化退火温度 退火温度的优化首先要采用几种方法中的一种来计算引物－模板对的Tm值，其中最简单的方法是Tm＝4（G+C）+2（A+T），一个单一碱基的错配大约降低Tm值5℃。也可以采用更加复杂的公式，但实践中由于Tm值受缓冲液中各个成分甚至引物和模板浓度的不同影响，所以任何计算的Tm值都应该看作是大致值。进行退火温度的摸索时有一定间隔（2～5℃），从高到低直到低于Tm值5℃的一系列反应可以大致估计出给定条件下的最佳退火温度。 5、循环数和再扩增 增加循环数可以增强反应物的不足时的反应，但这样会导致产生假带以及富含单链DNA的高分子量成片产物。对于再扩增，总的原则是，如果第一次PCR反应在凝胶上见到条带，再扩增时只能用1l第一次PCR产物的1：104到1：105稀释物。 6、热启动PCR (Hot start PCR) 把PCR混合物在显著低于Tm值的温度下，哪怕是作简短的保温，也可能产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR方法则可以大大减少这些麻烦。其目标是在第一个循环中等温度升到超过反应物的Tm值以后才允许反应中的一或两种关键成分进入反应。例如在覆盖有矿物油的小实验中，所有反应管中的一种公用成分（如Taq DNA聚合酶）可以先不加，而到第一个循环的变性阶段温度超过80℃以后再加。 For more information, please visit: http://www.pcrstation.com/pcr-types/
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“每千美元测定一个人的基因组”——您有妙计吗？
biotrader 2008-10-5 11:52
目标：每千美元测定一个人的基因组 一、DNA测序发展综述 1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型以来，随着各种新技术和新理论的不断诞生，人类开始在分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，并由被动适应自然界转向主动改造和重组自然界。尤其是自1990年人类基因组计划正式启动，在美国、英国、日本、法国、德国和中国科学家的共同努力下，这项工作在新世纪到来之际提前完成，得到人类全基因组序列，标志着人类已从基因组时代步入后基因组时代。由于人类基因组计划的顺利进行，使得DNA序列数据库的容量呈指数增长，提供了以往不可想象的巨大的生物学信息量。在这些巨量的序列信息基础上，就可以在分子层面上探索人类健康和重大疾病的防治，开展生物技术在各个领域的应用，使人类生存的健康质量和预防疾病的能力发生革命性的飞跃。在这段时期生命科学的迅速进步得益于许多分子生物学新技术的不断涌现，而且很快就被广泛地应用。包括1975年Southern杂交方法的创立；1977年Sanger和Maxam、Gilbert先后发明了两种DNA序列的快速测定法；1980年基因合成仪的发明使核酸的化学合成从手工发展到全自动合成；1985年Cetus公司Mullis等发明的聚合酶链式反应（PCR）的特定核酸序列扩增技术；1992年Affymatrix公司Fodor小组原位合成制备了世界上第一块基因芯片；1995年第一台全自动核酸序列测定仪在ABI公司问世，这些里程碑性质的新技术对分子生物学的发展起到了重大的推动作用。 基因组学的迅速发展加快了DNA分析仪器的系统化和模块化进程，使多层次的基于DNA技术的综合生物学分析成为科研和临床工作的常用工具。尽管目前DNA分析仪器采用的技术原理基本相同，但存在主要设备功能单一，高水平仪器、配套试剂和软件等均来源于进口且费用高于市场平均价数倍等严峻问题。DNA分析平台包括寡核苷酸原位合成、PCR实时定量分析、DNA杂交和DNA测序等基本模块，既可单一模块应用，又可以组合使用。 近年来，随着电子科学与技术的不断进步，生命科学分析仪器也得以飞速的发展。最普遍应用的PCR技术从单一的定性PCR衍生出半定量、定量和实时定量等新的应用技术，相应开发成功了一系列用于高通量、高速的PCR仪以及自动化进行的实时定量PCR仪，而且实验周期从数个小时缩短至20～30分钟，极大提高了工作效率。基因芯片技术由于其高通量的先天优势，被广泛应用于科研工作的前期筛选，特别是原位合成技术的发展使早期仅能在芯片上制备20个碱基长的寡核苷酸发展到可以达到100个碱基长的寡核苷酸，有效的提高了芯片应用上的灵敏度和特异性指标，从而实现更高效的研究目的。DNA序列测定技术发展的更为广阔，Sanger技术的局限性（主要是对电泳分离的依赖和无法再进一步地并行和微量化）造成对高等生物基因组进行序列测定的规模限制和代价高昂，而新的利用酶促扩增和原位监测的基于合成法测序（Sequence by synthesis）的新技术单次运行已经可以达到4Gb的序列读取数量，且单位成本大大降低。以美国科学界和企业界为引领的研发活动有一个既定目标，那就是每千美元测定一个人的基因组。由于总体的技术门槛不高，目前已经有四种新型仪器投放市场，数个不同原理的技术和设备都在研发之中。 国内对于仪器设备的总体研究活动和实力相对偏弱。目前仅在PCR相关和芯片设备方面有所建树，但仍不能达到国际流行先进设备的技术水平。但是，从技术本质考察此类貌似迥异的设备仪器可以发现，其所涉及的技术方向不外乎温度循环控制、微量液流控制、光学信号探测、表面化学工艺、DNA相关的酶促反应以及高容量数据分析处理等几方面。 二、商业测序仪市场比较 国际市场主要为Roche公司（454/ Genome Sequencer FLX System）、Applied Biosystems公司（SOLiD System）和Illmina公司（SOLEXA/Genome Analyzer System）所垄断，加之2008年3月问世的Helicos BioSciences公司的HeliScope单分子测序仪，代表了国际先进的大规模DNA测序系统的技术水平和发展趋势，以下对其功能技术参数和预期成果做一比较。 GS 454 SOLiD SOLEXA HeliScope 单运数据产量 0.1Gb 1.5～3Gb 1.3Gb 7.5Gb 覆盖人基因组 0.1 1 0.5 2.5 平均读长（bp） 250～310 35 32 20～35 样品准备 2天 7天 11小时 未知 2天 运行时间 7.5小时 8天 3天 14天 精确度 99.5％ 99.94％ 98.5％ 99.4％ 设备价格 350万元 413万元 301万元 945万元 单次运行价格 14万元 2.38万元 2.1万元 12.6万元 日本滨松光子学株式会社 EMCCD 制造商 500张/秒 http://www.hamamatsu.com/ 三、基于De Bruijn 图的基因拼接 http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/velvet/ GPL下的自由基因拼接软件 http://genome.cshlp.org/cgi/content/short/18/5/821 原理文献 四、著名公司 https://www.celera.com/ 测序公司 Knome公司 个人基因组测序 https://www.23andme.com/ google创始人布林的妻子开的测序公司 欢迎各位读者发表能够降低个人DNA测序成本的奇思妙想，或和作者联系, 您的智慧将为全人类的健康做出贡献！ MSN：z_yubin AT hotmail DOT com
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PCR技术的发现历史
lifei 2008-7-6 00:00
PCR技术是体外大量扩增核酸序列的技术。人类基因组大约为30亿个碱基对，假设某基因A为2万个碱基对，在PCR技术发现之前，所有针对基因A的研究工作都同时对30亿个碱基对进行操作，因此研究工作举步维艰。PCR技术帮助研究人员特异性地大量获取基因A的2万个碱基对，研究工作变得简单，可操作性强。 发现PCR技术的穆利斯是化学家，获诺贝尔化学奖，但却是对分子生物学产生革命性影响。PCR技术有多么重要？两件事情说明，一是发明人被授予Nobel奖外，二是霍夫曼－拉夫什公司出资3亿美元购买PCR技术。 来看一下PCR技术发现的有趣历史，这些事情注定不会发生在中国。 1983年4月或5月，七叶树花开的季节， 穆利斯想到PCR原理的原型。当时他很奇怪，为什么这么简单的想法没有人想过？他问了许多人和在图书馆查了许多资料，确证这一想法的确没有人做过 1983年8月，穆利斯在西斯特公司正式作一个关PCR原理的学术报告，几乎没有人相信。仅几个实验技术人员有些兴趣 1983年9月8日，利用人体基因DNA作为模板，采用撞大运的方式进行了世界上第一次PCR实验，编号PCR 01，没有成功 1983年10月，进行了PCR 02号实验， 1983年圣诞节后，重复了PCR，改用简单的pBR 322质粒，后改用噬菌体（一种细菌病毒）系统为模板 1984年1月，用自己合成的长寡核苷酸做模板 1984年春，扩增人beta珠蛋白基因的58个碱基对，自己认为获得了成功 1984年6月，西斯特公司在加利福尼亚的蒙特雷举行科技年会，穆利斯与一个名为麦格根的科学家吵架，最后两人互相推搡和谩骂。凌晨1－3点，穆利斯打电话骚扰公司总载怀特，怀特让警卫强行带穆利斯去海边散步。 几周后，西斯特公司开会讨论是否开除穆利斯。原因，他的创新性想法几乎没有实现，在公司制造混乱，与实验室其他雇员发生性关系，拿枪威胁与他女朋友约会的同事，等等。最终决定，留下穆利斯，成立PCR组，给他一年时间完成PCR技术开发任务 1984年11月15日，PCR实验获得了成功 1985年3月28日，申请有关PCR的第一个专利 1985年9月20日，一篇关于PCR应用的文章关交《科学》杂志，11月15日接受发表。 1985年12月，一篇正式介绍PCR的原理的论文送到《自然》杂志，拒稿。所有作者都感到震惊。重投给《科学》，仍拒稿。他们认为只是技术革新类的东西。只好改投吴瑞为主编的《酶学方法》杂志。 1986年5月，穆利斯去冷泉港实验室举行的人类分子生物学专题研讨会上介绍PCR技术 1986年9月，穆利斯离开西斯特公司，得到1万美元奖金 1991年12月12日，霍夫曼－拉夫什公司出资3亿美元购买PCR技术。西斯特公司倒闭 1993年10月13日，穆利斯因发明PCR技术获诺贝尔化学奖。
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