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简便、快捷、廉价的新冠病毒检测方法

yanjx45 2020-8-8 15:12

简便、快捷、廉价的 新冠病毒检测方法： 美国当前急需尽快推广。 截至 ８月７日 ， SARS-CoV-2 （新冠病毒）在全球 已经感染了 1 , 935 万人，并造成 7 1.7 万人死亡。 其中美国累计感染 509 万 人，死亡 16.4 万 人，是疫情最严重的国家。 快速遏制新冠病毒传播的最现实的方法是， 及时（最好是每天） 识别和隔离具有传染性的个人 。目前 这一过程因繁琐的采样和检测 程序 以及 漫长 的 结果报告 时间而导致 实际上收效甚微 。 诊断 新冠病毒 感染的 主要 检测方法 是一种 高度敏感试验 : 实时 定量逆转录 -聚合酶链反应(qRT-PCR) 。 为了进行 新冠病毒 的 qRT-PCR检测， 需要 对粘液样本进行病毒颗粒 灭活 并提取病毒 RNA。RNA 经 逆转录 步骤 被转化为 DNA，然后 经 聚合酶链反应 （ PCR ） 以 指数方式 快速扩增。 为了进行 扩增，一小段 DNA(引物)结合到 新冠病毒 DNA中的一个互补的目标序列上，而另一段DNA(探针)连接到引物结合位点下游的序列上。引物的结合启动了 目标 DNA的扩增 ：在 一种 名为 聚合酶 （ polymerase ） 的 DNA 酶 的作用下 向探针方向 拷贝 DNA。一旦聚合酶到达探针，它就会裂解探针，从而激活附着在探针上的荧光标记。使用这种荧光探针可以实时定量地监测荧光信号，而不只是检测积累的最终产品。 虽然 qRT-PCR检测非常 敏感 ，但也存在诸多 局限性 。它需要昂贵的实验室仪器和训练有素的技术人员，每次测试的 成本 估计约为 100美元 ，这意味着大多数人可能只 能 做一次测试。目前的检测能力有限，结果往往需要几天或几周才能 回复结果 ，这意味着在此期间，不知道自己已感染的人可能会传播病毒。 qRT-PCR的 高灵敏度 也可能是一个缺点而不是优势，因为该测试经常能检测到 的 RNA小片段 并非来自完整的病毒颗粒 ，因此 不代表可传播病毒 。这种 RNA片段可以在人体内存留数周或数月。 如图 1所示，感染 新冠病毒 通常会导致病毒复制的初始水平很高，在几天内达到顶峰并开始下降。症状通常在高峰出现之前不会出现，而且，由于大多数人在出现症状之前不会进行检测， 到检测时 他们很可能已经处于病毒复制的下行斜坡上， 在检测时 已 不再具有传染性 。与此同时，他们已经在不知情的情况下将病毒传染给他人好几天了。显然，这些人在高传染性期间 本来更 需要被识别和隔离。 图１ . 　新冠病毒感染时间与检测到的病毒 RNA 含量的关系 6月27日， 哈佛大学流行病学家 Michael Mina 在 预印本 杂志 《 m edRxiv 》上 发表了一 篇论文 ，评估了当前 新冠病毒 监测措施在减少传播方面的有效性，同时考虑到检测频率和结果报告的延迟。 Mina和合著者得出的结论是，使用qRT-PCR等 超敏感检测 的 次数有限的 检测常常导致对不再具有传染性的个体进行不必要的隔离 。特别 值得注意的是，它还导致处于感染初期、因此具有高度传染性的未发病或无症状个体 被遗漏 ，使他们能够照常生活并感染他人。 在预印本 出版几天后 的７月３日 ， Mina在《纽约时报》上与人合写了一篇 表达 观点 的 文章 ，题目是《 A Cheap, Simple Way to Control the Coronavirus （ 一种廉价、简单的控制冠状病毒的方法） 》 。 在文中他讨论了广泛使用 快速的家庭诊断测试 来控制 新冠病毒 大流行的可能性。通过易于使用的测试，每个人都可以每天检查自己。 这种诊断测试的一个例子是 侧流装置 （ lateral flow device ） ，它是一种类似于妊娠测试的 试 纸条 。 条带的一端有一个样本垫， 其中 含有识别 新冠病毒 抗原 的抗体。将样品垫部分的试纸浸入唾液样本中，并允许唾液 浸湿 试纸。 如唾液中存在新冠病毒 抗原 ，检测的结果 显示 除了 控制线 还会有 测试线 出现 ,而 阴性结果 只会显示 控制线 (图2)。 每次测试需时 10 - 15分钟,费用约为1 - 2美元,不需要任何额外的设备。阳性结果表明需要自我隔离并 咨询 医生确认检测结果。 图 2.　检测新冠病毒抗原的试纸条，上条结果为阳性，下条结果为阴性。 虽然 此类 快速检测的 灵敏度 只有 qRT-PCR检测的 一半 左右，但 在 实际 的 传播窗口 期 ，来自病人的唾液样品中 病毒水平非常高 ，这些灵敏度稍逊的检测方法足以 发现病毒抗原的存在。高灵敏度的 qRT-PCR检测在患者不再传播病毒数周后仍可检测 到 病毒 RNA，这与检疫/隔离 的 目的无关，也无助于遏制传播。 一种不那么敏感的、每天都 可 做并且能立即得到结果的测试将会更有价值，因为它能识别出实际上具有传染性的个体。 这也将减 少 对昂贵的接触者追踪措施的需要，因为大多数感染者将了解自己的状况，并在传播期间保持隔离。 在美国，类似的 快速 新冠病毒 诊断测试 有多种已研究成功， 希望 能得到媒体 足够的关注 。 一旦纸条的功效得到了明确的证明，它们也 将 得到了 FDA( 食品和药物管理局 ) 的批准 。 FDA、CDC和NIH将认识到这些测试的价值，并将它们广泛地提供给公众。 在美国，国会可以迅速授权生产并免费向所有美国人分发。 这可能是 近期重开 学校和工作场所以及重建经济的最终解决方案。 此类诊断检测试剂的推广也将有助于全球 迅速控制和结束这场可怕的瘟疫。 参考文献： 1.　 Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 surveillance ， medRxiv ， PostedJune 27, 2020. doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.22.20136309 　 2.　 https://www.virology.ws/2020/08/06/how-to-end-this-pandemic/

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科学随笔：核酸体外扩增及核酸检测那些事儿

热度 4 cherrylu1960 2020-6-18 13:39

在大自然这个天然实验室里，病毒无处不在，并不断进化，不知什么时候就会跳出来危害一下人类。人类对付病毒，首先要识别它，抓住它。 相比于细菌等微生物，病毒要小的多，一般只有50-100纳米，高倍的电子显微镜，也不容易看请它们的真面貌。但借助于分子生物学的检测手段，对它们进行寻踪早已不是难事。 严格来讲，病毒并不算是真正的生命，它们没有细胞结构，离开生命体不能自我复制，但具有复制生命所必须的核酸。人类不仅搞清了核酸这种特殊生命大分子的结构，及其在体内的作用方式，也掌握了在体外对核酸进行复制增殖操作的一些高超本领。 每种生命都包含不一样的遗传大分子，即核酸，或DNA, 或RNA，抓住了特异的核酸，就抓住了病毒。微量核酸抓着费劲，但借助复制它的神器，问题就容易解决了。 COVID-19疫情爆发，伴随核酸检测这个反复出现的名词和实际发生的事实，RT-PCR、qPCR这些专业术语也更多出现在公众的视野中。可能有必要稍微作些了解，消除一些误解。 学过相关专业知识的，PCR（聚合酶链式扩增反应）都不陌生，但对于普通人肯定不好理解，听名字就够难记的。其实也没有必要了解太多，记住扩增两个字就可以了，还有，这个过程需要一些特殊条件和酶的参与。 提起PCR这个技术，脑海中就会闪现“变性、退火、延伸”这些名词，以及相关画面。变性-退火-延伸也正是描述核酸体外扩增的基本过程。双链的DNA高温（93摄氏度）下变性，解链成单链，目的是让其与互补的引物DNA结合，退火（温度降到55摄氏度）后，模板DNA与引物根据碱基配对原则进行杂交。后边的延伸过程简单来说，就是在DNA聚合酶和中间反应原料（dNTP）的参与和稍高温度下，实现DNA连续的半保留复制。整个温度和酶控的过程，现在都可以由仪器自动完成，操作起来比较方便。 新冠病毒属于单链RNA病毒，不稳定，需要通过逆转录酶，以RNA为模板合成cDNA（从RNA到DNA反向转录的DNA），然后以其为模板，扩增合成目的片段，这就是人们所说的RT-PCR核酸检测技术（逆转录核酸扩增），这个技术在RNA病毒检测上应用比较广泛，扩增后结合探针（一段人工合成的碱基序列）荧光标记（qPCR）等，就可以准确识别靶标。 应该说，PCR技术已经不算什么新玩意儿，从上世纪八九十年代开始，技术已逐渐成熟，更好用的工具酶的不断发现和筛选，加上技术的不断改进，大面积应用也有几十年时间。我们熟悉的亲子鉴定，通过DNA比对锁定罪犯，还有DNA考古，等等，都离不开PCR这个超级神器。抓个病毒更不在话下了。 基于PCR的核酸检测也不是什么很新鲜的技术。但的确，只有在这次不同寻常的疫情爆发后，它才真正进入大众的视野。 涉及大量人群的病毒病源学检测，使得核酸检测这几个字不断深入人心。病毒核酸，阴性还是阳性，希望和失望，从来没有像今天这样牵动着人们的神经。记得2003年SARS时，媒体并没怎么提到需要通过核酸检测作为确诊依据，主要原因是SARS的症状比较典型，通过临床症状和影像学检查，基本就可以定性，不需要借助病源学检测这个武器。关键是，SARS没有这么多隐形感染者。 追踪病毒的还有另一种方式，即血清免疫学检查，需要采血测抗体，主要看以往感染的情况，结果的不确定性相对复杂，抗体产生的滞后，也需要发病后一段时间才能检测到。核酸检测看起来相对单纯，只要能搞到含有病毒核酸的微量样本，只要是合格的试剂，规范的操作，抓住病毒的概率就应该比较高，所以，利用RT-PCR技术进行病毒核酸检测，特异性应该没有大问题（不需要整个的核酸，只需要其中一个片段，即靶标，就可以了）。至于灵敏性保证，看具体情况。 人们普遍关心假阴性的产生，一方面与样品受限有关（没有取到有病毒或者病毒载量过低的组织样本），或者试剂不太合格，灵敏度低，如造成逆转录的起始DNA含量太低。还有人提出，如果病毒变异了，正好涉及那段靶标，也可能检测不出来，但我觉得这种可能性不大。据知情人讲，我们的检测试剂有很多种，大多数是靠得住的。不合格的试剂能随便上市应用吗？估计很快被淘汰了。 当然，通过核酸检测可以确认病毒的存在，至于它是不是活着（具有感染力），还无法判断。所以要结合临床症状和其他检查来确定。 COVID-19，较多的无症状和不典型症状人群的存在，真的让核酸检测在疫情防控和患者确诊中发挥了史无前例的作用。如果没有核酸检测这个武器，无法及时筛查到感染人群，不能采取有效干预手段，结果可想而知。 人类科技的进步，总会在对抗疾病，对抗自然界敌人入侵中发挥越来越重要的作用。相信科学，依靠科学，我们一定可以找到更多与大自然抗衡的有力武器，当然，我发自内心的想法是，最好，我们能找到更多方法，与大自然和谐相处，不要有太多的杀戮。我们能做到吗？

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PCR小传

fuleiucas 2020-5-29 13:09

对于新冠肺炎疑似患者，要想检测从患者身上提取的组织里是否含有新型冠状病毒的核酸序列，我们需要借助于核酸测序技术。除了疾病诊断之外，核酸测序还有很多用途，比如亲子鉴定、犯罪嫌疑人的身份识别等。不过，从被检测者身上获取的组织中，经过提取以后留下来的核酸数量往往很少，不敷使用。人们想，要是能不必重复从被检测者身上获取核酸、只是在实验室里就能合成其核酸拷贝就好了！上个世纪的分子生物学家们早就想到了这个问题。 20 世纪下半叶，随着脱氧核糖核酸 DNA 双螺旋结构的发现与遗传密码的破译，分子生物学的大厦逐渐建立起来，而 DNA 在生命科学研究中的作用日益凸显。如果想对 DNA 进行分析，单靠原始拷贝是不够的，量太少，一旦实验了就没有了，所以需要对 DNA 样本进行体外复制，高效、大量的复制想要研究的 DNA 成为制约 DNA 分析的瓶颈。美国生物化学家穆利斯创造性地发明了体外高效扩增 DNA 的 PCR 技术，使得只用微量 DNA 获得大量拷贝成为可能。 图 1 凯利·穆利斯（ Kary Banks Mullis ） （图片来源： https://www.latimes.com/obituaries/story/2019-08-13/kary-mullis-dna-nobel-prize ） 凯利·穆利斯（ Kary Banks Mullis ） 1944 年出生于美国北卡罗来纳州的勒诺，在南卡罗来纳州度过了童年时光。学生时代的穆利斯就对科学非常感兴趣， 1962 年进入佐治亚州理工学院学习化学，毕业后转入加州大学伯克利分校攻读生物化学博士学位，随后在堪萨斯大学医学院和加州大学旧金山分校从事博士后研究。 1979 年入职西特斯公司（ Cetus ），这是世界上最早的靠重组 DNA 技术起家的企业，是世界上最早的生物技术公司之一，正是在这家公司，穆利斯发明了 PCR 技术。 1986 年 ~1988 年，在 Xytronyx 公司短暂工作后，他从 1987 年开始成为加州 PCR 技术与核酸化学的非官方顾问，后来在加州奥克兰儿童医院工作，并担任多家公司的科学顾问。 图 2 PCR 原理示意图 （图片来源： https://toptipbio.com/polymerase-chain-reaction-pcr/ ） 在穆利斯之前，科学家已经开始研究 DNA 的体外分离技术，并且已经发现了合成 DNA 所必需的 DNA 聚合酶。不过早期的实验效率比较低，而且错误率较高。当穆利斯进入西特斯公司之后，从事合成寡聚核苷酸的工作，他也对重复而低效的工作产生了厌倦，总想着如何提高效率。新想法的产生完全是偶然的。 1983 年 4 月一个周末的晚上，他驾车与同事去往乡间别墅，他突然想到如果 DNA 片段的复制是循环往复的不就可以了吗？只要提供 DNA 复制所需要的模板、原料、酶和引物， DNA 的复制就可以是自动完成的。这就是 PCR 技术，全称是聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ）。这个想法看上去也很简单啊！后来他查阅资料，竟然发现没有人想到类似的想法，而他的同事也多少对此表示怀疑。经过几个月的思考和准备之后，穆利斯开始了实验，经过对 DNA 复制的模板、双螺旋解开后再次变成双螺旋（复性）的反应温度、 DNA 聚合酶的量等因素的多次调试，终于在 1984 年的 11 月获得了成功！他们的工作马不停蹄，第二年春天就公布了研究数据、申请了专利、发表了研究论文。 回头来看，穆利斯的发明虽然有偶然因素，但也是在相关理论与技术发展到一定阶段才能实现的。科学家已经发现了 DNA 合成所需要的聚合酶，了解了 DNA 解开螺旋（退火）、引物在链上延伸的热动力学过程，还有早期 DNA 体外复制实验的成功，等等。这些理论与技术为 PCR 技术的实现奠定了基础。 同时，我们还可以看到 PCR 技术也是需要发展和改进的。当时穆利斯使用的 DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 Klenow 片段，这种酶不耐高温，且复制的时候错配率较高； 1988 年，科学家改用了 T4 DNA 聚合酶，准确率提高了，但是需要不断加酶；直到西特斯公司从一种水生嗜热菌中分离到 Taq DNA 聚合酶，才实现了 DNA 体外扩增的高效与高特异性，这就为 PCR 技术的广泛应用扫清了障碍。后来， PCR 技术又被科学家不断改进，产生出各种变体的 PCR 技术。 最开始的 PCR 技术，是把 DNA 进行体外扩增。但是像今年的新冠病毒，就不能简单地应用这种 PCR 技术，因为这种病毒携带的核酸不是脱氧核糖核酸 DNA ，而是核糖核酸 RNA 。通常 DNA 有两条互补的链，构成 DNA 的四种碱基是 A T GC ；而新冠病毒的核酸是单链的 RNA ，构成 RNA 的四种碱基是 A U GC ，原料和最终产品都不一样，体外扩增的策略也要不一样了。针对核酸是 RNA 的生物，人类发明了 RT-PCR （ Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ）技术，或者称为逆转录 PCR 。具体原理是，以病毒的 RNA 为模板，合成出与之配对的单链 DNA ，这条单链 DNA 被称为互补 DNA （ cDNA ） , 然后再采用通常的 PCR 技术，对这段互补 DNA 进行体外扩增。不仅对于新冠病毒核酸的体外扩增要应用 RT-PCR 技术，想要在体外扩增艾滋病病毒 HIV 等逆转录病毒的核酸，也要应用 RT-PCR 技术。 图 3 RT- PCR 原理示意图 （图片来源： https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction.svg ） PCR 技术的发明具有重要意义，使得应用微量的 DNA 样品实现体外的大量高效扩增成为可能，从而在生物学、医学、法医学等领域获得广泛应用。而穆利斯也由于发明了 PCR 技术而获得 1993 年诺贝尔化学奖。 注：本文2020-5-29首发于“京师生物圈”微信公众号.

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数字PCR简介

jhsbj 2019-6-15 12:58

1985年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法以后，PCR已经成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。PCR是用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点，是能将微量DNA大量扩增。 最传统的一代PCR采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析，操作繁琐、难于做定量分析。为使PCR技术能对基因水平进行定量分析，1992年开发了荧光实时定量PCR（二代PCR）。实时定量PCR（qPCR）通常在DNA扩增时对反应体系中的荧光信号进行实时收集，通过三个参数间（荧光信号-Cq值（罗氏公司）或Ct值（ABI公司）-靶基因的起始浓度）的关系，能以相对定量的方式确定靶基因的拷贝数或推断基因表达水平。由于荧光定量PCR的分析是相对定量的方式，这也是目前荧光定量PCR的最大技术缺点。在低拷贝靶分子、模板浓度差异的条件下，其检测灵敏度、精确度都受到了限制。 1999年霍普金斯大学的Vogelstein教授首先提出了第三代的Digital PCR（数字PCR）的概念。此后数字PCR技术得到迅速的发展。数字PCR是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR相比，数字PCR增加了一步分隔(partitioning)的操作，将几十微升的反应体系分隔成了众多微小独立反应体系。核酸模板在这种分割过程中被充分稀释，理想状态下每个微反应体系中至多含有1个分子的核酸模板。和qPCR不同，数字PCR不对扩增过程进行实时监测，而是检测end-point的荧光信号。扩增完成后所有液滴的荧光将逐个被识别并进行计数，不需要构建标准曲线，就可以得到绝对定量的结果。 目前数字PCR的主要产品有： 1. QX200 QX200目前已经是Bio-Rad的产品。Bio-Rad的技术主要来源于QuantaLife公司，QuantaLife 利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字ddPCR，这是最早出现的相对成熟的数字PCR平台，在运行成本和实验结果稳定性方面都基本达到了商品化的标准。 2011年QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100，继续在市场上销售，2013年该公司又推出了升级型号QX200。 2. Raindrop Raindrop数字PCR是美国RainDance Technologies公司于2012年推出的产品。能够提供更高的检测范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品，这个设备将其原有的二代测序文库制备平台技术也整合进入数字PCR技术平台，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成100万至1000万个P升级微滴反应乳液，这种超高的微滴数目可以为用户“提供更高的检测动态范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品。在2017年Bio-Rad完成了对RainDance公司的收购。 3. Quant Studio 3D Applied Biosystems公司2013年也推出了Quant Studio 3D数字PCR系统，是目前数字PCR市场上新型号产品之一。采用高密度流控芯片技术，使样本均匀分配至20,000个单独的反应孔中。在整个测定流程中，样本之间保持完全隔离，防止样品交叉污染。移液过程和操作步骤减少。芯片式设计避免了微滴式系统可能出现的管路堵塞问题。Applied Biosystems在OpenArray芯片平台之外推出的全新的芯片式数字PCR系统，这个全新系统在设计上综合考虑了系统稳定性与运行成本因素。 2013年Thermo Fisher公司收购了Applied Biosystems。 Quant Studio 3D 数字PCR可用于分子标准品定量；原体检测和定量测定；罕见癌症基因突变检测；拷贝数变异分析；GMO检测和污染评估；mRNA 和miRNA表达低倍变化的确定等。 4. Naica TM crystal Naica ™ crystal数字PCR系统是由法国Stilla Technologies公司推出的产品。将微滴均匀性和芯片可视化以及相同PCR反应条件创新性集成在同一系统中，使用微流体创新型Sapphire芯片，样品通过毛细通道网格以30,000个Crystal微滴的形式进入发布在2D芯片中。 这种方法在满足实验室对数据精准性、重复性要求的同时，让数字PCR分子检测变得更加简单快捷。PCR扩增过程在芯片上实现。最终对阳性微滴计数从而得到精准的核酸绝对数量。作为首款三个荧光通道检测的数字PCR平台，Naica ™ crystal数字PCR系统可在2小时内实现多达36个目标基因的检测。Naica ™ Crystal系统由Geode微滴生成；扩增仪和Prism3微滴阅读分析系统组成，仅需唯一耗材——Sapphire芯片，即可完成从加样、微滴生成和扩增，直到采集数据获得结果。　 Naica ™ crystal数字PCR可用于：基因表达差异检测；拷贝数变异(CNV)；低丰度及稀有序列的精确定量；甲基化含量鉴定；肿瘤治疗的伴随诊断；无创产前筛查；病原微生物的检测(病毒、细菌等)；二代测序辅助建库；肿瘤治疗的实时监控 (ctDNA检测)等。 ReaserchGate 论坛对digital PCR不同品牌比较的讨论： David Otaegui Biodonostia Institute 6th Jun, 2014 ：Digital PCR, Qx200 vs Quantstudio 3D; Which one you think is the best? Eric Ouellet University of British Columbia – Vancouver 7th Jul, 2014：Hi David, Our lab uses a QX100 ddPCR platform from Bio-Rad (now QX200). At the time it was the only available option. However, I can offer some advice on its usability. As you may know, bio-rad uses droplets to perform ddPCR, a process on which they are continuously improving upon. The new cartridge designs can, in our experience, reliably and reproducibly partition samples. Although the process is more labor-intensive (and to some extent, more prone to user error), we did welcome the added flexibility of using such a system. The Quantstudio 3D instrument is a bit reminiscent of the platform pioneered by Fluidigm. In these case, the partition is done geographically. In many cases, the yes/no readouts are sufficient, but in cases where samples would need to be recovered, these platforms would have great difficulty in achieving this, compared to emulsion-based systems. However, for most clinical applications, these instruments are often very useful. Raindance is also another promising company that is currently trying to enter the market of droplet-based digital PCR detection, although they currently offer fee-per-service options rather than instruments themselves. However, according to their documentation, they can achieve partition levels that dwarf the other platforms, providing there is a need for such high levels. The other aspects to consider are not only the capabilities of these various systems, but perhaps more importantly, the cost of the consumables and reagents, especially when compared to NGS platforms that are constantly becoming more affordable. Ultimately, the balance between flexibility and ease-of-use would have to be weighed for any particular application. In our case, we required the flexibility, albeit a steeper learning curve. Giovanni Lopez Universidad Peruana Cayetano Heredia 2nd Feb, 2015：Here in South America QX200 this $180456....Includes only: A reader Droplet oil (1863004), a droplet generation oil (186305)，Buffer 2X Control Kit (1863052)，ddPCR Supermix 2X (1863010). What is it that more is spent? Rupesh Deshmukh Laval University 12th Dec, 2016：Can anyone provide me cost comparison between QX200 and Quantstudio 3D.Thanks Kevin Kelly Thermo Fisher Scientific 7th Jul, 2017：Hi Rupesh, The QS3D costs around half of what the Bio-Rad system costs. If you'd like more info send me a message at kevin.f.kelly@thermofisher.com, and I'd be happy to connect you with your local sales rep for additional information. Thanks, Kevin David Dobnik Nacionalni inštitut za biologijo 9th Sept, 2017：Hi David, In our lab we have two Bio-Rad's machines (QX100 and 200) a Fluidigm Biomark HD and have also had the chance to test Quantstudio 3D and Stilla's Naica platform. Overall, regarding the usability and throughput, the Bio-Rad's system is the one I prefer. We have tested duplex assays on QX100 and QS3D side by side and separation of clusters on QS3D was rather poor. However, if you do not plan to run a lot of samples per run, even QS3D might be a good choice looking from the cost perspective. Oliver Schultz Stilla Technologies 4th Apr, 2018：Dear network, if you′re interested in an innovative new approach to digital droplet PCR, please check out the NAICA system from STILLA Technologies. It′s the fastest system on the market, including a 3-color detection and the capability of recovering the droplets after read-out for downstream applications. Learn more at www.stillatechnologies.com Best wishes, Oliver Minka Kova č Omega 8th Aug, 2018：Dear all, in our lab we have a Quantstudio3D. We know also other platforms like BioRad, Stilla, Fluidigm and QuantStudio 12 Flex with Open Array. Honestly speaking if you have a small number of samples per day, less than 96 per day the platform for you is QST3D. Price performance for small amount of samples is strongly on QST3d side (price of the instrument, price per reaction). Second majority of assay's from ABI now Thermo Fisher Scientific works well with no additional optimization, like 90 -95 %. But yes, sometimes for some assays additional optimization is a MUST. So regarding the Quality of the data from results between QST3D and BioRad (others as well) I have to say that data is dependent on the fine optimization. You can even find the scientific articles which showed that systems on the digital market are more or less comparable. The entering price of the QST3D instrument is more than half lower compared to the BioRad droplet platform. If you have more than 96 samples per day or ca 10000 samples yearly you have to think about bigger systems (Stilla, BioRad, OpenArray) Best wishes, Minka

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[转载]什么是多重PCR？复合PCR原理操作步骤注意事项详细介绍

a2381889653 2018-8-30 10:28

一、引言 多重PCR( multiplex polymerase chain reaction,MPCR)也称复合PCR,是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术,即可在一个反应体系中加入两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段,由 Chambehian'于1988年首次提出,其反应原理、反应试剂和操作过程与常规PCR相同。多重PCR既有单个PCR的特异性和敏感性,又较之快捷和经济,在引物和PCR反应条件的设计方面表现出很大的灵活性。多重PCR还能提供内部对照,指示模板的相对数量和质量 当前临床上对感染性疾病的诊断主要依靠传统的微生物学方法以及血清学方法。经典的微生物学方法不仅繁琐、费时,并受诸多因素影响,容易漏检自然变异株,并且不能检测难培养或不可培养的致病微生物。血清学方法虽然发展较快,灵敏度也较高,但只能做追溯性诊断或提供间接的诊断依据,不能进行快速鉴定,并且有些细菌之间有交叉凝集现象。因此,这些传统的方法在鉴定方面日益显现出不足。过去10年间,分子生物学的发展为微生物的基因型检测和鉴定打开了一扇大门,这些发展开始影响到患者治疗的很多方面。DNA杂交研究首先应用于确证细菌间的关系,对核酸杂交化学的认识,使发展核酸探针技术成为可能。但类似于表型指标,在某些情况下,杂交的方法也可能受到微生物能被分离和生长的限制。核酸扩增技术又为临床微生物实验室的病原体的检测和鉴定铺设了道路。体外能够生长,一般来说不再是鉴定微生物所必须满足的条件。之所以能够如此,从根本上说是由于这些技术以特异核酸序列的酶学扩增代替了生物学扩增一培养生长。虽然任何PCR依赖的技术都不能区分活的和死的细胞,但由于具有其它方法不可替代的优势,PCR还是成为分子生物学中不可缺少的技术和方法。在过去20多年间, PCR技术 和其它DNA信号与靶标扩增技术的发展已经使这些分子诊断技术成为临床上快速敏感诊断的关键性技术。一般PCR仅应用一对引物,通过PCR扩增产生一个核酸片段,主要用于单一致病因子等的鉴定。在诊断实验室中,PCR技术的应用主要受成本的限制,有时是因不能获得足够的待测样本体积。为了克服以上缺点,同时增加PCR技术的诊断能力,多重PCR的技术应运而生 自1988年 Chamberlin等首次提出这一概念起,多重PCR技术已被广泛应用于核酸诊断的许多领域,包括基因敲除分析、突变和多态性分析、定量分析1以及RNA检测等,在感染性疾病领域,多重PCR技术已经显示出它的价值,成为识别病毒、细菌、真菌和寄生虫的有效方法。利用一次多重PCR反应,可同时检测、鉴别出多种病原体,在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的实用价值 二、原理 多重PCR基本原理与常规PCR相同,区别是在同一个反应体系中加入一对以上的引物,如果存在与各对引物互补的模板,则它们分别结合在模板相对应的部位,同时在同一反应体系中扩增出一条以上的目的DNA片段。多重PCR反应体系的组成和PCR循环的条件需要经过优化以确保同时扩增几个片段。理论上只要PCR扩增的条件合适,引物对的数量可以不限,但由于各种条件的限制,实际能够扩增的引物对数量是有限的。 PR结果的分析方法有以下几种,包括:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸杂限制性酶切分析、核酸测序等,其中琼脂糖凝胶电泳是最简单、最快速的方法,但是与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比分辨率比较低。限制性酶切分析需要将PCR产物回收酶切后再次电泳,耗时费力,难以推广应用。核酸测序是鉴定PCR产物最可靠的方法,但需要专门的测序仪器,并且需要花费的时间也比较长。如果要将鉴定感染性疾病病原的多重PR方法用于临床及现场流行病学调查,琼脂糖凝胶电泳是最佳的选择 三、材料 1.常规的PCR反应体系所需试剂 高压过的超纯水(高压的目的是使其中的 DNase失活,以免降解模板DNA); PCR缓冲液(选用与所用聚合酶对应的缓冲液) 4种dNTP混合物(每种dNTP的浓度为2.5mmol/L); 引物(引物合成后,用超纯水稀释为10mmol/L); 热稳定的DNA聚合酶(不同厂家、不同批次的酶可能会有差异); DNA模板(尽量使用纯化后的核酸作为模板)。 2.实验仪器 PCR热循环仪、核酸电泳仪、凝胶成像设备、离心机等 四、方法 多重PCR实验设计远比单个PCR复杂,并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系,其反应体系的组成和反应条件需要根据实验结果反复调整,以适应同时扩增多个片段的需要。设计多重PCR反应体系时必须仔细考虑其扩增的区域、扩增片段的大小、引物的动力学及PCR循环条件的最优化等。 一）选择目标基因 由于多重PCR在同一个反应体系中需要加入多对引物,而模板直接影响扩增的结果分析,这就导致了扩增模板的选择至关重要。同时,扩增区域的选择必须符合分析的目的,如通常对于致病微生物,需要选择其保守序列,如16sRNA,或者毒力基因、毒力相关基因,以防止检测到非致病突变体而无法解释结果;对于需要分型的对象来说,需要选择它们之间有差异的保守序列进行扩增;对于高度同源的序列来说,可以用相同的引物进行扩增,但获得的阳性结果需要利用特异探针杂交或限制性酶切进行进一步确定;缺失分析选择扩增外显子;法医学鉴定个体差异选择扩增高度多态性标志;转基因检测则选择转入的动植物基因座;性别鉴定一般选择X或Y性染色体上特有的基因座 对于含有多个外显子的基因缺失分析来说,可选择缺失热点较广区域或缺失密集区域。相邻近的外显子可用跨越这两个外显子的引物进行扩增。 二)引物设计 引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸序列,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与灵敏度。要确定引物的位置,首先需要知道所选择的基因引物与模板结合部位的详细DNA序列信息。在多重PCR中,为了保证扩增效率,所有的引物对必须优化到相近的扩增条件。因此,多重PCR的引物设计除了要满足一般PCR引物设计的原则外,还要注意以下几个问题:各引物之间不能互补,尤其避免3的互补,以免形成二聚体,引物设计好以后进行PCR扩增,以检验引物之间是否配对形成二聚体;各引物与其它扩增片段和模板不能存在较大的互补性,扩增片段之间也不能有较大的同源性;对于引物的长 度、(G+C)含量、T值要求尽量一致;各引物扩增产物的片段大小要有一定的差别,以便于用电泳的方法进行区分。一般来说,产物片段越大,其长度的差别也应该越大。这就给多重PCR引物的设计带来了一定的难度 (三)核酸提取 核酸依赖的检测方法受目标核酸纯化的影响,核酸的纯化程度决定了核酸方法的应用。多重PCR的优势在于快速、系统,主要用于临床标本的检测,包括血液、组织、粪便等,同时多重PR对核酸模板的要求比较高,所以核酸的提取纯化显得尤为重要,直接与扩增结果 一般来说,通过煮沸裂解细菌制备模板可以满足普通PCR反应,但是用于多重PCR反应会存在很多问题。在条件允许的情况下,多重PCR需要以纯化的DNA为模板,可以确保多重PCR的顺利进行。 (四)单位点PCR(也叫单引物PCR) 在进行多重PCR之前,必须先对每对引物进行单位点PCR。确定每对引物进行单位点PCR时条件如表14-1所列 反应完成后比较扩增结果,确保在相同的循环条件下所有的引物都能扩增出对应的产物条带,以确保引物能够特异性扩增对应的目标序列 (五)多重PCR(引物等浓度混合) 反应体系中各对引物等浓度混合,体系中其它各成分的浓度不变,应用与单位点PCR相同的反应条件进行多位点同时扩增,根据扩增结果对多重PCR反应体系及反应条件进行调整,具体操作如下面所述 (六)优化多重PCR反应体系及反应条件 多重PCR的反应体系和反应条件基本与单位点PCR相同,但也不能一蹴而就,必须使多重PCR反应中每对引物对应的靶点都能获得足够的扩增量,并且扩增产物之间的产量应该基本影响多重PCR扩增效果的因素可以分为反应体系和反应条件两大类。其中反应体系包括引物、缓冲液、 Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2等,反应条件包括退火温度、延伸温度、延伸时间,循环数等 1.反应体系的优化 (1)引物浓度在多重PCR体系中,引物用量和扩增的目的片段长度有着正比内在关系,即扩增片段越长,所需引物就越多,片段越短所需引物相对就越少。同时,多重PCR扩增中每增加一重PCR扩增,引物间相互影响就加大,这就势必影响到扩增的效果。为了降低这种不利影响,选择适当的引物间浓度是确保多重PCR成功的一个关键因素。先对不同的引物进行单个PCR扩增,确定单个PCR各引物的最佳浓度,然后按照多重PCR的实验流程,进行两个或多个引物对的多重PCR预实验。多对引物会增加3末端引物互补的可能性,形成引物二聚体;也有可能发生一个扩增片段抑制另一个扩增片段的情况,这就导致了扩增结果并不是均一的。即使在优化了循环条件后,某些基因的扩增产物仍不明显。多重PCR反应体系优化经常可以遇到有个或两个靶位点的扩增产物很少甚至没有扩增产物,而其它引物的扩增效率都很好的情况。为解决这一问题,可以通过适当地调整引物的相对浓度加以解决,增加弱条带的引物量,减少亮条带的引物量。降低扩增效率高的引物对浓度比增加扩增效率低的引物浓度更有助于提高扩增效率低的产物的产量。多重PCR反应中各引物的浓度差异一般都凭经验获得。只有在调整引物浓度达不到要求时才考虑调整别的反应条件,例如改变反应体系中Mg2或KC的浓度等。 有些情况,例如扩增产物是序列相似但长度不同的扩增片段,最短的产物可能扩增得更好,尤其是有些扩增片段共用一个引物的时候。这种情况可以通过长扩增片段引物启动PCR几个循环后再加入扩增短片段的引物的方法避免,也可以通过降低扩增短片段的引物来解决。理论上讲,引物和基因靶序列的摩尔比至少为103:1,如此过量的引物才能确保模板DNA一且变性就与引物退火,而不是与其自身退火。一般引物量至少要10倍于模板量 (2)模板及模板浓度从血和新鲜组织中提取的DNA,浓度和质量均能满足多重PCR的要求。对于从菌体提取的DNA,为了减少样品对扩增结果的影响,裂解液中加入的菌量不能太多否则会因裂解不完全,菌体蛋白抑制DNA聚合酶的活性,造成假阴性结果 要达到稳定的结果,每个样品都应该测定浓度,实际工作中往往是抽样检测。所以,样本模板浓度往往参差不齐,导致每个样本扩增效率不完全均等,有时还会出现扩增失败的现象。此时要考虑模板的有效浓度,适当加以调整。几种不同来源的模板DNA的浓度为:哺乳动物基因组DNA100g/ml;酵母基因组DNA1g/ml;细菌基因组DNA0.1pg/ml;质粒DNA1~5ng/ml)dNTP和MgCl2的浓度dNTP和MgCl2是PCR反应体系中的重要成分,因此对dNTP和MgC1的浓度进行优化也是很必要的 PCR反应中一般用的dNTP和MgCl2的浓度分别为200m/L和1.5mmol/L。Mg2浓度在很大程度上影响扩增的特异性,Mg2+一般正比于dNTP的浓度,这个比值确定好后可以在调整其它反应条件时保持恒定。当保持dNTP的浓度不变,随着MgCl2浓度的升高,反应的特异性逐渐增强,但当增加到一定程度后,反应产物几乎为零。PCR反应中,dNTP和MgCl2的浓度应该平衡,这可能是因为dNTP能够结合镁离子,而 Taq DNA聚合酶发挥活性需要游离的镁离子。另外,dNTP母液对于反复冻融十分敏感,反复冻融3~5次后,多重PCR反应常常不能很好进行,扩增产物几乎完全不可见,但dNTP的这种低稳定性在单一基因扩增中并不明显。 (4)PCR缓冲液(KCD的浓度如果多重PCR系统性地对扩增长的PCR产物有倾向性,最佳的选择是设计一系列多重PCR实验,固定Mg浓度(1.5mmo/L),依次递增KCl的浓度(1.0~2.0倍),对每对引物进行再优化。相反,如果倾向于优先扩增较短的产物,则应在保持KCl浓度不变的情况下逐步提高Mg2浓度(直至4.5mol/L)。如果所有产物的扩增效率都很低试着提高模板和热稳定DNA聚合酶的浓度。如果没有改善,则成倍增加所有引物的浓度并采用复性和延伸温度依次降低2的降落PCR。 PCR缓冲液的浓度从1×提高到2×可以明显提高多重PCR的效率,这种调节作用比调节DMSO、甘油或BSA更重要。通常产生长片段扩增产物的引物在低盐浓度下扩增结果更好,而生短片段扩增产物的引物在高盐浓度下扩增结果更好,高盐浓度会使长片段扩增产物难于变性解链 (5) Taq dNA聚合酶随着多重PCR体系中引物对数目的增多,dNTP和聚合酶的量也要相应增加。不同厂家的酶质量也有差异,需要做浓度梯度实验,寻找最佳的用酶量。使用过多的Tag dnA聚合酶会导致不同基因扩增不平衡及背景的轻微增高,反应的特异性降低。可以在25反应体积中加入2U,然后根据扩增结果进行轻微的调整 (6)辅助剂(如DMSO、甘油、BSA)的应用在多重PCR反应体系中加入50~100ml/的DMSO或甘油能够提高多重扩增效率和敏感性,得到更多的扩增产物和减少非特异扩增。但是这些辅助剂可能会在另一方面干扰实验效果,因为它对各基因位点扩增效率的影响不同50ml/L的DMsO可能会提高某一位点的扩增效率,降低另一位点扩增产物的数量,而对某些位点则根本不产生影响;同理,DMSO可能抑制也可能是促进非特异性扩增。因而使用这些辅助剂的效果需要在每个具体的反应体系中加以验证。加入适量的BSA(如L.0g/L)能显著提高多重PCR扩增效率。有时候BSA效果要比DMSO和甘油好,但它的作用同样也需要实验的验证 有些研究人员建议使用浓度范围为5%~10%体积分数的DMSO和甘油来改善扩增的效率和特异性,但在多重反应中,DMSO的使用会出现矛盾的结果。因此,DMSO和甘油的调节对实验结果的影响要根据具体的实验来摸索。 2.反应条件的优化 由于在一个多重PCR反应体系中有多对引物,而且扩增的模板片段长度也不尽相同,所以各对引物的扩增效率和扩增速度也不相同。由于多重PCR反应总是遵循较小片段优先扩增的原则,各对引物所要求最佳PCR条件也不尽相同(设计多对引物进行多重PCR时,应使各引物所需PCR扩增条件尽可能一致),因此在选择多重PCR扩增条件(尤其是退火温度和时间)时应尽量选择有利于较大片段扩增的条件 (1)退火时间和温度在循环参数中,影响多重PCR扩增效率的主要因素是复性温度和延伸时间。复性温度的设置策略与单个PCR相似。先计算引物的熔解温度(Tm),在此基础上推算复性温度T。(T=T。-5)。然后用“逐步引人法”确定多重PCR的最佳T,即每增加一对引物,就根据扩增的结果调整复性温度,直至每一种被扩增的基因片段都获得满意的效果。延伸时间是影响扩增产量的重要因素。随着扩增的基因座数目的增加,延伸时间也应延长。在最佳的Mg2+和dNTP浓度范围内通过延长延伸时间来提高扩增产量,比单纯增加Mg2+和dNTP浓度更为有效。 退火时间对扩增效率的影响远远小于退火温度的影响,将退火温度降低4~6对于在多重PCR中扩增出同样的基因是必需的。多重反应中并发的其它基因的特异扩增会消除非特异扩增的影响,同样,扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低 (2)延伸温度高的延伸温度会减少某些基因的扩增,即使用长的退火时间和延伸时间也可能无法消除这种影响。 (3)延伸时间在多重PCR中,由于同时扩增多个基因,酶和dNTP的缺乏就成为限制因素,就需要更多的时间来完成所有产物的合成。多重PCR中增加延伸时间,可以增加较长PCR产物的量。也有实验表明,当延伸时间延长时,所有基因的PCR产物量都增加了 4)PCR循环数PCR产物量增加最明显的是在25个循环附近。通常对于一个反应,2830个循环就足够了,增加至60个循环对产物量无明显影响 总之,多重PCR反应条件的设置是一个棘手的问题,也是多重PCR成功的保证。一般策略是首先进行单个PCR反应,分别设定各引物对应的条件;然后,依次增加引物对,不断调整反应条件直至最后保证所有的引物对都能在同一条件下扩增出目的条带。 五、常见问题的解决 针对多重PCR中的常见问题,可以通过改变影响PCR扩增效果的因素来解决 1.若所有产物条带都很弱 增加延伸时间; 降低延伸温度至62~68; 逐步降低退火温度; 调整 Taq DNA聚合酶的浓度; 同时应用以上4种策略。 2.若短片段产物条带较弱 缓冲液浓度从1×增加至1.5×或2×; 降低退火或延伸温度; 增加弱条带相对应的引物量; 同时应用以上3种策略。 3.若长片段产物条带较弱 增加延伸时间; 增加退火和/或延伸温度 增加弱条带相对应的引物浓度; 降低缓冲液浓度至0.7×~0.8×,同时保持MgCl2浓度1.5~2mmol/1L不变; 同时应用以上4种策略 4.若出现非特异产物 若非特异产物是长片段,增加缓冲液浓度至1.4×~2.0×; 若是短片段,降低缓冲液浓度至0.7×~0.9×; 逐渐增加退火温度 减少模板和聚合酶的用量; 增加Mg2至3mmol/L、6mmol/L、9mmol/L、12mmol/L-,同时保持dNTP浓度恒定在200umol/L: 同时应用以上5种策略 5.若以上方法都未见效,可以进行以下尝试 加入辅助剂BSA(0.1~0.8pg/p); 加入辅助剂DMsO或甘油(5%,体积分数); 重新比对引物,确保引物之间不存在相互作用; 六、应用 (一)多重PCR在遗传病诊断方面的应用 1.DMD和BMD的检测 Duchenne型肌营养不良症( Duchenne muscular dystrophy,DMI)是一种很常见的人类遗传病,为X性染色体隐性遗传性肌肉变性疾病,50%的病例由基因缺失引起,大约每3500个男婴就有一个发病,1/3的病例由新的突变所致,肌营养不良基因长200kb,至少有70个外显子,被35个平均35kb的内含子所间隔1。目前尚无有效治疗的方法,因而高度准确的产前诊断和DMD阳性筛选是十分重要的。以往多用 Southern分析技术来诊断,但由于该基因由多达70个外显子,至少需要7~9个cDNA克隆才能诊断,费用高、费时而难以常规开展。BMD是Becker型肌营养不良症( Becker muscular dystrophy)的缩写。BMD亦为X性染色体隐形遗传性肌肉变性疾病。BMD的发病率为新生男婴的三万分之一。65%的BMD病例的原因是基因缺失。 Chamberlain等利用多重PCR技术对DMD进行了检测,设计了6对外显子引物。用1umol/L引物加10UTaq酶,延伸温度为?23min,25个循环。产物电泳后,如与正常对照的对应条带相比有缺失或移位,即为异常。随后该实验室又将引物增加至9对,使至少80%的DMD基因缺失得到确定,能直接诊断50%以上的病例。 Hentemann等2设计了2对产物分别为140bp和73bp的引物,对42例病人检测后,发现7例基因缺失并经 Southern杂交分析证实。Simard等报道用 Chamberlain的引物对DMD进行扩增,并对DNA模板处理进行了改进,用lm羊膜液离心后的细胞经非离子去垢剂和蛋白酶K的PCR缓冲液裂解后直接PCR扩增,效果令人满意。由于 DMD/BMD是等位基因,近来的文献多同时检测此两种疾病。Begs等用多重PCR同时检测肌营养不良基因的8个外显子和启动子,可使98%有基因缺失的DMD/BMD获得诊断。 Covone等人用两种方法对照研究了127例DMD/BMID2一种方法是用与 DMD CDNA相关的9种cDNA探针与Hind消化的基因族DNA杂交,另一种方法是用9对DMD外显子的引物进行多重PCR检测,结果73例(57%)存在基因缺失,两组方法结果相近。我国华西医科大学的学者亦用 Chamberlain的9对引物对17例DMD/MD病例进行了检测,结果8例(47%)发现基因缺失,证明了针对西方人的引物序列同样可以检测中国病例。 2.用于其它遗传病的检测 Pici等人鹆对囊性纤维化( cystic fibrosis,CF)基因突变进行了筛选研究,用4对外显子引物进行多重PCR扩增,然后用限制性内切酶消化PCR产物,再进行垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳,检查15例发现有3例发生了基因突变。Pior等设计了8对引物同时检测DMD/BMD和CF,通过凝胶电泳筛选 DMD/ BMD缺失突变,并用等位基因特异的寡核苷酸杂交确定CF突变是否存在。实验表明,可以通过多重PCR的方法从血斑中获得足够的DNA进行分子分析,可用于新生儿的筛选。 Pillers等人m用多重PCR和 Southern杂交方法研究了一位同时患AIED(Aland island eye disease)、甘油激酶缺乏(GKD)和DMD的病例,发现在DXS67(1 deoxy-D-xylulose5- phosphate synthase67)和DMD基因之间出现基因缺失。另外,还有用多重PCR方法筛查类固醇硫酯酶( steroid sulfatase,,srs)缺乏症和诊断β地中海贫血患者的报道。 脊髓性肌萎缩症( spinal muscular atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传神经性肌肉疾病。SMA会造成位于脑底和脊髓的下级运动神经元分裂,从而使其无法发出肌肉进行正常活动所依赖的化学及电信号。SMA主要影响患者的近端肌,即最靠近人体躯干部的肌肉。控制胃、肠和膀胱等器官运动的非随意肌不会受到影响。各型都会对控制随意肌运动的叫作运动神经元的神经细胞产生影响。最近的基因研究发现,运动神经元的死亡也许是因为缺少一种或几种蛋白,或者是它们不能完全发挥其功能而导致的。 Simard等应用多重实时反转录PCR方法(muli Xplex real-time reverse transcriptase- PCR)对存活运动神经元( survival motor neuron,SMN)的转录本进行定量,共检测了42个潜伏期SMA病人的血标本,每个病人取三个时间点,发现SMN的表达在每个病人的不同时间点上的转录是稳定的, SMN mRNA表达的实时定量检测可以作为SMA临床试验的生物标志以作为SMA临床试验的生物标志 甘露糖结合素( mannose-binding lectin,MBu)是一种血清蛋白,能够触发补体激活,因此在先天性免疫中发挥重要作用。低水平的MBL会损伤病原微生物的调理作用,进而导致儿童的反复感染、免疫受损病人的严重感染以及自身免疫疾病。MHBL的编码基因位于人类10q11.2~q21染色体,包括四个外显子,血清中MBL水平受其启动子多态性和MB2基因第一个外显子突变的影响。目前应用的MBL基因分型方法主要有以下几种:PCR限制酶切分析、序列特异寡核苷酸探针杂交( sequence-specific oligonucleotide probes,SsOP)、放大受阻突变体系( amplification refractory mutation system,ARMs)、ARMS联合SSOP、异源双链分析( heteroduplex analysis)、 实时PCR 以及应用小沟结合DNA探针的5端核酸酶分析。 Helena0等建立了种快速、高效的多重PCR方法对MBL2基因进行分型,并且将捷克人作为斯拉夫人的代表样本,应用此方法研究了MBI2的等位基因频率。共分析了359个不相关捷克人的MBL2基因,最终得出LYD单元型在斯拉夫人的祖先中比其它高加索人更常见,同时也证明了多重PCR是一种比传统PCR方法更快速、简便、省时省力的MBI2分型方法。 根据当前不育领域的研究,大约10%~15%的夫妇存在不育的问题,而在所有的不育个体中,男性不育大约占50%,其中40%~50%存在精子缺陷,如少精症和无精症。人类Y染色体的长臂对于精子的产生是必需的。在三个不同区域的缺失会导致严重的精子缺陷,包括非闭塞的无精子症和精子减少症。这些区域被称为无精子症因子( azoospermia factor,AZF),三个分离的非重叠区被定义为AzFa、AZFb、AZFc,与产生人类损伤的精子有关。近来的研究证明Yq染色体的微缺失会遗传给其儿子。Yeom等应用多重PCR扩增6个位点,包括Y染色体的性别决定区( sex-determining region on the Y chromosome,SRY)作为阳性对照,无精子症因子区域的5个序列标签位点( sequence-tagged site,Srs),其中模板是从不育男性血液中提取的基因组DNA。本研究中的引物为Cy3标记,PCR产物可以与固定的探针杂交,提供了一种敏感、高通量检测Y染色体缺失的方法,也是一种男性不育筛选的新方法。 (二)着床前胚胎遗传学诊断( preimplantation genetic diagnosis,PGD) PGD产生于10多年前,主要目的是识别基因突变或染色体错误引起的遗传性疾病。临床上最早是用来检测夫妻X隐形连锁疾病,随后应用于不同的患者来达到优生优育的目的,主要包括:单基因病携带者,无论显性或隐性、常染色体或X连锁;染色体结构异常携带者,包括易位、翻转、缺失、插入等;避免高龄产妇后代染色体异常;辅助生殖治疗反复植入失败的夫妇反复出现不明原因流产的夫妇。当前PGD已经成为产前诊断( prenatal diagnosis)的一种替代方法。 对于单基因缺陷患者,可以用多重PCR同时扩增多个位点,选择那些位于相同染色体或者临近致病基因的多态性标志位点进行扩增能够有效诊断突变位点和多态性等位基因,可以同时分析多个诊断位点,并且减少错误诊断的概率。另外,还可以扩增高变的指纹位点,指示DNA模板是否被污染 囊性纤维化病( cystic fibrosis,CF)是一种首次成功应用单细胞植入前基因诊断的单基因缺陷性疾病。CF的突变谱差别很大,因此,发展一种突变特异的PGD方法是行不通的。文献 建立了一种针对CF通用的多重PCR方法,用于胚胎的遗传学诊断。本研究应用了CF跨膜调控子( cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)两侧的4个紧密连锁高多态性重复标识:D7S523、D7S486、DS480和D7S90。共检测了100个白细胞和50个卵裂球,其中99%6获得了多重PCR结果,总体等位基因遗失( allelic drop out,ADO)频率从2%~5%不等。确认ADO以及额外等位基因存在后,95%的多重PCR结果可以用来建立基因型标记。基于父母的基因型,考虑到由于变异参数(5%、ADO(0~2%)和单重组(1.1%~3%)造成的胚胎传送丢失,大约90%的胚胎能够应用单个卵裂球进行可靠的PGD基因分型。错误诊断的概率与已知的两侧标识双重组概率相当,小于0.05%。因此,这种多态性和多等位基因标识系统是一种可靠的、可替代直接突变胚胎遗传学诊断的方法。 (三)在遗传修饰生物( genetically modified organisms,GMO)中的应用 近年来可见应用多重PCR技术在转基因成分定性和定量检测的报道。陈文炳等用多重PCR方法在反应体系中加入13对引物同时检测转基因矮牵牛与阳性对照质粒中的1~3个外源基因,包括花榔菜花叶病毒( cauliflower mosaic virus, CaMV)35S启动子、根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶(Npt)编码基因。结果表明,多重PCR不但可以提高检测效率、降低检测成本,还可以有效防止假阳性结果的出现 四)基因重排 免疫球蛋白( immunoglobulin,Ig)和T细胞受体( T cell receptor,TCR)位点包含很多不同的V、D、J基因片段,参与早期白细胞分化的重排过程。VDJ片段重排由重组酶复合体介导,其中RAG1和RAG2蛋白通过识别、切割DNA重组信号序列( recombination signal sequences,RSs)发挥重要作用,RSS位于V基因下游、D基因两端和J基因上游。不合适的RSS会降低甚至完全阻止重排。 van dongen等成功建立了一种多重PCR方法并将其标准化,能够检测同源细胞重排免疫球蛋白和T细胞受体基因、染色体畸变t(11;14)和t(14;18)。在18个多重FCR反应中,可以使用107对不同的引物进行扩增。14个Ig/TCR和4个BCL/BCL2多重反应体系证明了多重PCR反应完全适合淋巴增生缺陷的克隆研究,并且具有较高的敏感性。特别是在疑似B细胞增殖中与IGH和IGK联合应用,疑似T细胞增殖中与TCRB和TCRG联合应用具有极高的克隆检出率 (五)抗性基因检测 抗生素的广泛使用导致具有耐药性微生物的增多,比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( methi-cillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、万古霉素抗性肠球菌( vancomycin resistant enterococcl)和多重耐药结核分枝杆菌( multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis)等。这些病原的快速检测及对应的抗生素抗性快速检测对于隔离病人和阻止疾病的进一步蔓延是很重要的。多重PCR方法能够对这些抗生素抗性基因进行同时检测,节省时间,具有较高的敏感性和特异性。 Strohmenger等应用多重PCR方法同时检测金黄色葡萄球菌的9种耐药基因,包括mecA、aacA~anhD、tetK、tetM、emA、emC、wtA、wtB和wC,并且在反应中加入另外对引物,扩增金黄色葡萄球菌的16 SrRNA作为阳性对照。通过对分离的3株金黄色葡萄球菌进行检测,多重PCR结果与肉汤微量稀释实验得到的抗性表型一致,证明了多重FCR是一种识别抗生素抗性的快速、简便、精确方法,并且可以用于临床诊断、流行病学研究中用于监测抗性基因的传播还可用多重PCR方法同时检测质粒介导的喹诺酮抗性基因qmA、qrB和qnrS,并用来筛选科威特分离的64株产超广谱内酰胺酶( expanded- spectrum beta-lactamase,ESBL)的肠细菌。 相关阅读： PCR标准反应体系及反应体系优化 实时荧光定量PCR原理 16SrRNAPCR

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[转载]PCR发展历史简述

a2381889653 2018-8-8 09:51

聚合酶链(式)反应( polymerase chain reaction,PCR) 是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学实验的工作基础。在这三种实验技术中,PCR方法在理论上出现最早,也是目前在实践中应用得最广泛的。PCR技术使微量的核酸(DNA或RNA)操作变得简单易行,同时还可使核酸研究脱离于活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命,极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展 PCR发展简史 核酸研究已有100多年的历史,20世纪60年代末、70年代初,人们致力于研究基因的体外分离技术,但由于核酸的含量较少,在一定程度上是限制了DNA的体外操作。 Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成tRNA基因”。但由于基因序列分析方法尚未成熟,热稳定的DNA聚合酶尚未报道,以及寡聚核苷酸引物合成还处在手工及半自动合成阶段,这种想法似乎没有实际意义。 1983年美国科学家 Kary mullis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶时,孕育出了PCR的雏型。经过两年的努力,在实验上证实了PCR的构想,并于1985年申请了有关PCR的第一个专利,在“ science”杂志上发表了第一篇PCR的学术论文。从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。 Kary mullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。但 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的 Klenow片段,这虽然较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于 Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术成了一种笨拙的中看不中用的实验室方法。 1988年初, Kechang改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。 1988年 Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌( Thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶耐高温,在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,从而极大地提高了PCR扩增的效率。为与大肠杆菌聚合酶 I Klenow片段区别,将此酶命名为TaqDNA聚合酶( Taq dna polymerase)。此酶的发现使PCR方法得到了广泛的应用,也使PCR成为遗传与分子分析的根本性基石。 在以后的10多年里,PCR方法不断地被改进。例如,应用具有3′-5修复活性的热稳定DNA聚合酶代替不具3-5修复活性的 Taq DNA聚合酶,减少了在扩增过程中产生的错误配对,大大提高了在复制过程中的真实性。后来发现了几种具有高保真性的 Taq dNA聚合酶,在常规PCR成熟之后,又衍生出很多适用于其它目的的FCR方法。原来的PCR只能扩增两段已知序列之间的DNA,现在可以扩增到巳知序列两侧的未知序列(染色体步移法),甚至可以扩增到序列未知的新基因2。PCR的模板也从原来要用的DNA发展到直接用RNA作为模板,即 反转录PCR ,这就使得从真核生物中扩增目的基因变得很容易。PCR原本是一种定性的方法,只能回答样品中有无目的基因存在,现在已经可以用来定量,即回答样品中原始模板的确切数目,这就是所谓的实时定量PCR。基于完整的基因组 DNA PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。PCR也从单纯用来扩增基因到能将两个以上的基因连接起来,省去了限制性内切酶消化和用连接酶连接,这就是所谓的克隆PCR3。再加上PCR方法与其它方法联合应用,到目前为止已报道的衍生PCR方法有几十种之多。目前实时荧光定量PCR被广泛应用,因为它不仅可以定性而且可确定原始样品的量。为了适合于大样本的检测,最近又建立了芯片PCR,还可将PCR的结果用数字来表示,这就是所谓的数字PCR( digital PCR)。 总之,自PCR方法被建立以来,在20多年的时间里,发展很快,已有一系列PCR方法被设计出来,并广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学研究中。PCR的建立大大地推动了生命科学的发展。由于PCR的实用性和极强的生命力,PR方法还将会被不断完善,进一步在生命科学研究中发挥更大的作用。 文章来源： 一篇文章说明聚合酶练市反应（PCR）发展历史

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[转载]介绍一下降落PCR

a2381889653 2018-8-7 10:08

降落PCR是一种设计多循环以使相连循环的退火温度越来越低,从而达到最佳扩增条件的方法反应过程中起始退火温度高于Tm值随着循环的进行退火温度逐渐降低到Tm值从而确保第一个引物一模板杂交事件发生在最互补的反应物之间,退火温度最终低于Tm值.退火温度的苑围可踣越15℃从高于Tm5℃至低于T0℃左右条件允许的话退火温度可以1℃g05℃递降.尽管退火温度最终会降低到非特异性杂交的Tm值,但此时目的扩增产物已开始几何扩增,在剩余循环中将超过任何非特昇性产物的扩增量·降落PCR是一种潜在的一步法找到最佳退火温度的方法明,对于Tm值相近的PCR反应可在同一循环条件下进行,大大提高了工作效率习 在降落PCR过程中需要采用热启动的方去,模板量一般为104~105拷贝.如果末检测到产物或产物带很弱可以采取以下措施将反应产物在恒定退火温度下再反应10个循环并重新分析;在恒定的退火温度下对起始 DI PCR产物的10倍稀释物(1:10~1:1000重新作30个循环的旷增;:使用更多的模板量,并在原始PCR混合物中掺入一定稀释度的阳性模板检测其中是否存在抑制物改变缓冲液各成分的浓度(pH、Taq聚合酶、dNTR引物);在PCR混合物中加入增强剂;用嵌套式引物重新扩增第1次PCR产物的稀释物(1:10~1:1000);放弃此套引物重新设计引 如果观察到许多产物带或高分子量成片产物可采取以下措施:提高 DT PCR的最高退火温度和最低退火温度,使其范围上移;减少最低退火温度条件下的循环次数;使各退火温度下的循环数增加一个如3个循环1℃同时减少较低退火温度或恒定退火温度循环的次数以防过多循环形成成片产物;改变缓冲液各成分的浓度(pH、Taq聚合酶、dNTP、引物);纯化产物带后重新扩增;用套式引物重新扩增第1次PCR产物的稀释物，放弃此套引物，重新设计引物扩增。 降落PCR实验步骤 1. 反应体积为50 μl。 2. 人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系：CD137-pCDNA3质粒4 μl，P1，P2各0.5 μmol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。 3. hIgG1Fc片段的PCR扩增体系：含人hIgG1Fc的PGEM-T质粒4 μl，P3、P4各0.4 μmol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。 4. HBVDNA多聚酶基因的PCR扩增体系： （1）第一轮：HBVDNA模板4 μl，P5、P6各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U. （2）第二轮：取5倍稀释的第一轮PCR产物4μl为模板，P7、P8各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U。 5. 分别在各灭菌PCR管加入上述各反应成分，100℃煮沸5 min，立即冰浴5 min，加入TaqDNA聚合酶，混匀，离心，PCR程序如下： 6. 取 10 μl PCR 扩增产物，在2%或3%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察扩增产物。 降落PCR注意事项 由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃

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[转载]荧光定量PCR探针设计原则及注意事项

a2381889653 2018-8-6 09:54

实时定量PCR (qPCR)的优势 •实时检测PCR反应过程 •精确计算出每个循环的PCR产物量 •扩增和检测同时进行 •消除后续PCR的干扰 在实时定量PCR反应中，杂交探针与插入染料如SYBR Green相比是更好的选择。荧光标记探针可以提高实时定量PCR结果的效率、灵敏度和特异性。而且定量PCR可以在一个反应里同时检测多个目标基因。 实时定量PCR的应用 •基因表达分析 •转基因检测和定量 •病原体检测和定量 •基因型/ SNP分析 •突变检测 多重PCR分析的优点 •省钱省时省力 •所需样品量少 •消除移液误差 •可以在一个反应里设置内部对照 •便于筛选 双标探针的原理 PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， PCR 仪检测不到荧光信号； PCR 扩增时（在延伸阶段）， Taq 酶的 5' － 3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。 两条线性寡核苷酸探针，其中一条的3 ‘端标记荧光激发基团，另一条的5 ' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。 分子信标技术是在同一探针的两末端分别标记荧光基团和淬灭基团，为一种标记荧光的发夹探针。在未与模板发生杂交前该探针分子呈发夹结构，结合在其两端的荧光基团距离上接近，产生能量转移效应，不发生荧光。当该探针与模板杂交，使荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。 双标探针和5’核酸酶试验引物的设计准则 双标探针 (荧光淬灭探针或称FQ探针) 在其5’端和3’端分别有一个荧光报告和淬灭基团。利用Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性，这些探针可以用于定量PCR体系。靶序列的特异性探针和特异性的PCR引物同时使用，设计的该探针在上下游PCR引物的范围内退火。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性将荧光报告基团从探针上切割下来。随着PCR循环数的增加，游离报告基团的数量不断的增加，实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号，从而对靶序列进行定量分析。 在设计这些双标探针的时候需要谨记以下几个要点。 1、探针的结合位置很重要，先设计好探针再设计PCR引物。 2、探针的结合位点应该靠近扩增产物的中心，扩增产物的长度应该在50-150bp之间。 3、探针的解链温度应该在68℃至70℃之间。 4、探针的长度最少20bp，否则容易发生非特异性结合。 5、尽量避免在探针的5’端出现dG ，因为dG 是一个较弱的淬灭剂，任何dG 都要离5’端至少两个碱基。 探针的设计标准： G-C 含量:：30~80% 多聚碱基:：避免出现多个重复碱基，特别是4个或者多于4个G。 末端构成:：在末端不能出现G。 退火温度:：68-70℃ DNA链：挑选C多余G的链。如果使用互补链，确保C不存在于3’端。 长度:：少于30个碱基。 设计：淬灭基团在3’端，荧光染料在5’端。 分子信标的设计原则： 分子信标的5’端和3’端也分别有一个荧光报告基团和一个淬灭基团。当荧光染料和淬灭基团接近的时候，探针会形成一个发夹结构。在PCR中，分子信标是特别针对目的基因设计的，分子信标探针可以使PCR引物退火。在PCR的退火阶段，探针和它对应的靶序列杂交，发夹环解开后，荧光报告基团和淬灭基团分离，可以发出一个荧光信号。信号的强弱和靶序列的多少成正比，通过实时监测这个信号，可以对靶序列进行定量。为了精确检测PCR过程，分子信标必须和它们的靶序列在退火阶段杂交成功，而游离的分子信标应该继续保持封闭状态，不会发出任何荧光。通过适当选择探针的长度和靶序列的长度，当温度高于退火温度7-10℃时，探针能够从靶序列上脱离下来，这样的探针序列的长度就很适宜。探针与靶序列的解链温度可以用“GC百分比”原则预测，很多设计探针的软件包都使用这个原则。在添加茎环区序列之前，这个预测方法只能用在探针序列的设计上。实际应用中，探针序列的长度范围通常是15-30个核苷酸。 上图显示的是分子信标在实时定量PCR中的应用原理 A：不和靶序列结合的时候，分子信标呈现发夹结构。荧光报告基团和淬灭基团的紧密结合阻止了报告基团释放荧光。 B：在PCR的退火阶段，分子信标和靶序列杂交结合，将荧光染料和淬灭基团分离，导致荧光染料释放信号。信号的强弱和靶序列的多少成正比，实时监测荧光信号可以对靶序列进行定量。 •茎环区的解链温度比退火温度高7~10℃ •探针的环状区需要15~30碱基 •茎环区的两边长度应该在5~7 碱基之间 •扩增产物的长度少于150 bp 探针合成/购买注意事项 1.引物及/或探针的解链温度(Tm)对于实时荧光定量PCR反应来说不是最佳的。 每条PCR引物的解链温度(Tm)应该在58–60°C范围内，而TaqMan®探针的Tm应该比引物的高大约10°C。另外，两条引物的Tm差应该在1°C范围内。请一定注意小沟结合物（MGB）会使探针Tm升高几度，所以TAMRA™淬灭的探针与MGB-NFQ淬灭探针的序列并不是完全可互换的。（参见# 4） 2.引物及/或探针的浓度不正确 重新将引物和探针配制至正确的储存液浓度。可以通过测量260nm吸收值来确保重悬引物/探针的浓度正确。另外还应当考虑在建立实时荧光定量PCR 实验时，需要从引物和探针的储存液移液的体积（我们推荐至少≥5 µL）。引物的储存液浓度通常范围为10–100 µM而探针则为2–10 µM。将引物的质量浓度正确地换算为摩尔浓度对于重新配制是必须的 。例如：10,000 pmol + 100 µL H20 = 100 µM的储存液 3.引物及探针是针对低复杂度序列而设计的。 在设计独特的引物及探针序列时，低复杂度序列区域可能带来一些问题 。最好选择另外一段区域。若不可行，则可以选择使用具有更高Tm值的更长的引物和探针序列，以提高特异性。另外，对热循环方案进行优化可能也有助于减少非特异性结合。 4.探针设计为MGB，但订购时为TAMRA，或者正好相反。 有必要核实在 实时荧光定量PCR 实验 中使用了正确的探针（序列，报告基团及淬光基团）。若使用了错误的探针，则实时荧光定量实验中所用的探针Tm值可能是不正确的。这会显著影响PCR效率，而且对热循环进行优化也很难改进反应结果。 5.引物或探针是针对低完整度序列而设计的。 有时模板序列会存在差异/误差，从而造成引物/探针与模板不能完全匹配而导致实验失败。对序列进行核实并检查是否存在单核苷酸多态性（SNP）位点是很重要的。建议进行多重测序来避免序列信息含糊不清，同时参考包含准确序列的公共数据库，如NCBI（生物技术信息国家中心）和dbSNP（单核苷酸多态性数据库）等，以确保序列质量 。增加引物长度而不提高退火温度可能导致更多的引物-模板错配。 6.扩增子太长 扩增子过长可能导致较低的扩增效率。理想状况中，扩增长度应该在50到150个碱基以获得最优的PCR效率。如果需要使用较长的扩增子，则需要对热循环方案和反应组分进行优化。 7.引物及/或探针是针对基因错误区域而设计的。 设计引物及探针时应确保使用的是正确的目标序列，尤其当存在有剪接体、突变基因或目标基因属于一个大的基因家族时。有时引物/探针可能会跨越错误的剪接位点或者可能并不是针对基因家族中正确的转录本而设计的。若检测的目标正是基因突变，则理想状况下探针应该根据突变中间的序列来进行设计。引物或扩增子序列可以根据公共数据库来进行BLAST，以确保对正确序列进行扩增。 8.引物及/或探针是针对错误物种而设计的。 若您在针对混合样本（例如转基因样本、细菌群或病毒群等）中的目标序列设计引物和探针，在开始搜索引物和探针之前，请通过BLAST搜索来检查您的目标序列是否存在可能的来自其他物种的同源序列。互联网上有公共BLAST服务器可供您使用（例如www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）。BLAST程序会将一段查询序列与特定数据库中的所有序列进行对比。为了获得特异性的引物和探针，您应当仅使用与其他序列具有最小相似度的目标区域来进行设计。 9.对靶标的检测不是转录本特异性的，同样会扩增背景基因组DNA。 基因组DNA（gDNA）通常都会与RNA一同被提取出来，从而在如PCR等下游应用中也可以作为模板。对污染gDNA的扩增可能会产生假阳性结果。因此，最好让引物/探针跨过靶标mRNA中的外显子间连接位点（内含子拼接位点）以防止从污染gDNA中扩增目标片段。而对于非内源序列（如来自细菌、病毒、某些植物及线粒体的序列），这些设计标准无法使用，此时比较明智的方法是使用优良的RNA提取技术来最小化背景gDNA的影响，并且可以在反转录步骤前用DNase对RNA样品进行处理。 10.订购的探针使用了所用实时荧光定量PCR仪器没有校准或不支持的染料。 确认选择了合适的染料对探针进行标记，并且核实实时荧光定量PCR仪器可以校准并支持该染料的使用。在仪器上使用该染料前可能需要进行校准。 相关阅读： PCR-引物设计 锚定PCR( anchored PCR）概述

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[转载]PCR、QPCR常见问题（转载）

a2381889653 2018-8-2 09:31

做过PCR的童鞋们都知道要想完全hold该实验、成为真正的PCR达人，并非易事。就qPCR而言，似乎其中的每一环节都可以让整个实验挂掉，也因此成为了资深科研狗们心中的痛。有时，各种假阳性、非特异性带等问题就是挥之不去、不请自来，这个时候该如何是好呢？实践出真知，小鱼就将各位前辈用经验换来的真理分享给大家。 　　一、普通PCR常见问题 　　Q1：PCR产物出现假阳性（即空白对照出现目的扩增产物） 　　Answer： 　　1、引物设计不合适：扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可扩增出非靶序列的序列；靶序列太短或引物太短，可导致假阳性。此时需重新设计引物。 　　2、为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂及器材应高温灭菌，所有离心管及加样枪头等均应一次性使用；必要时，加样前反应管和试剂均用紫外线照射，以破坏存在的核酸； 　　3、为了避免靶基因受到空气中小片段核酸（与靶序列具有一定同源性）污染，可用 巣式PCR 方法减轻或消除。 　　Q2:PCR产物中出现假阴性或无扩增产物（即阳性对照中有条带，而样品则无条带） 　　Answer: 　　1、条带放置时间过久,核酸被降解，最好在48h内进行电泳检测。 　　2、DNA模板纯度低，如含有杂蛋白质或Taq酶抑制剂，可对DNA进行再次纯化或重新用优质试剂盒提取DNA; DNA浓度太低时，可以加大模板量；对具有二级结构DNA使用较好的聚合酶；提取DNA时，避免吸入酚类试剂。 　　3、对设计不合理的引物进行重新设计合成；引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融而降解失效；检测引物OD值并进行电泳检测以确保两条引物浓度一致。 　　4、酶失活时，更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。 　　5、PCR反应条件：提高变性/退火温度；适当增加循环次数。 　　6、Mg2+浓度过低可影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，而Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性，因而可适当提高Mg2+浓度。 　　7、如果靶序列发生突变或缺失时，也会影响引物和模板的特异性结合，产生假阴性结果。 　　Q3：非特异性条带扩增或者条带出现拖尾现象 　　Answer： 　　1、当引物特异性差或引物形成二聚体时，可重新设计引物或者使用巣式PCR 　　2、若模板或引物浓度过高，可适当降低模板或引物浓度 　　3、酶量过多，则适当减少酶量 　　4、Mg2+浓度偏高，则降低镁离子浓度 　　5、退火温度偏低，适当提高退火温度或使用二阶段温度法（94变性，65左右退火与延伸） 　　6、循环次数过多，不仅会降低扩增效率，且会使错误掺入率增加，因此需要减少循环次数。 　　Q4：提高PCR特异性的策略有哪些？ 　　Answer: 　　四种策略： 　　1、 巣式PCR（Nest-PCR） 可增加稀有靶序列的灵敏度；降低了扩增多个靶位点的可能性；提高PCR特异性 　　2、递减PCR（Touch Down PCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性；循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2，直到退火温度低于Tm 5 。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。 　　3、热启动PCR：抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪到达变性温度。如在冰上配制PCR反应液以抑制Taq酶活性，后将其置于预热的PCR仪中。 　　4、使用PCR增强剂：甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等可以降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。但是增强剂的浓度要适当。 　　Q5:PCR引物设计的一般原则是什么？ 　　Answer： 　　1、引物长度：15-30bp,一般为20bp左右。 　　2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。上下游引物的GC含量不能相差太大。A/T/C/G最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 　　3、引物结构：避免引物3’端出现互补序列及二级结构，3’端的碱基特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对。 　　4、引物中酶切位点一般加在5’端，合适的酶切位点便于后续实验中的酶切分析或分子克隆。 　　5、引物浓度：每条引物浓度0.1-1umol或10-100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物间二聚体的形成机会。 　　Q6：克隆PCR产物的最优条件是什么？ 　　Answer: 　　目的片段与载体的最佳比例需依照实验来确定，一般1:1为最佳比，摩尔数比为1:8或8:1也行。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶及目的片段共10ul。室温保温1小时，或4过夜（可提高链接效率）。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。 　　Q7：PCR产物是否需要凝胶纯化？ 　　Answer: 　　如凝胶分析扩增产物中只有一条带，则无需凝胶纯化。若是有大量的引物二聚体，则需在克隆前进行凝胶纯化。 　　Q8：没有回收到目的片段，需要做什么对照实验？ 　　Answer: 　　1、涂布未转化的感受态细胞，如有菌落，表明氨苄霉素失效，或有氨苄抗性的杂菌污染。 　　2、转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。转化率=产生菌落的总数/铺板DNA总量，铺板DNA总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。例如将1ul的质粒（1ug/ul）用于100ul感受态细胞转化。再将1ul转化后的感受态细胞稀释至1000ul后（含有10ng DNA），用100ul铺板（含有1ng DNA）。过夜培养后得到了1000个菌落。转化率=1000菌落数×103ng/铺板1ng DNA=106 cfu/ug。低于108cfu/ug，转化效率低，应重新进行细胞转化。 　　3、如用pGEM-T作为阳性对照，产生了超过20-40个蓝斑，表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶，需更换核酸酶。 　　Q9：对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？ 　　Answer: 　　1、目的片段不适合连接。因用凝胶纯化的目的片段在受到UV过度照射时会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必须重新纯化。 　　2、如PCR反应体系的DNA聚合酶若带有修复功能，则扩增产物末端无碱基A（该碱基是pGEM-T载体克隆所需的）。可将酶更换为Taq DNA聚合酶。 　　3、高度重复序列可能会不稳定，在PCR扩增中产生缺失和重排。如若目的片段高频率的产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞。 　　二、普通PCR常见问题 　　Q10：如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性？ 　　Answer: 　　1、首先确定模板RNA完整性好，无DNA污染。 　　2、RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂 　　3、为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。 　　4、使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。 　　5、若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。 　　6、设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。 　　Q11：避免RNA降解的方法有哪些？ 　　Answer: 　　1、在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA 　　2、使用良好无污染技术分离RNA 　　3、将组织从动物体取出后立刻提取RNA，并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。 　　Q12:RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？ 　　Answer: 　　逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，可将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检测RNA抑制剂；若对照RNA与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗，以除去抑制剂。 　　Q13：如何解决合成cDNA第一链合成的引物退火不充分？ 　　Answer: 　　确定退火温度适合实验中所用的引物。如随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25保温10min。 　　Q14：如何减少RNA模板中的二级结构？ 　　Answer: 　　1、将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火；提高逆转录反应温度。 　　2、温度超过60时，不能使用oligo（dT）引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP 　　3、RT-PCR产物的长度超过1kb时，反应温度需保持在65。 　　Q15：RNA中有DNA污染的处理方式 　　Answer： 　　1、若是基因组DNA的污染，可使用DNaseI处理RNA; 同时设置没有逆转录的对照组反应检测DNA污染。 　　2、若是受到外源DNA的污染，可使用抗气雾剂和UDG酶。 　　Q16：qPCR探针设计的一般原则有哪些？ 　　Answer: 　　1、扩增片段的长度不应太大，一般小于300bp。 　　2、探针不能和任一引物互补，且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短，长度不要超过30bp。 　　3、探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度 　　4、探针如用于检测多态位点，多态位点应尽可能靠近探针中部 　　5、探针5’端不能是碱基G，G对荧光基团有猝灭作用。 　　Q17：在无反转录酶的情况下，对照RNA仍获得扩增结果 　　Answer： 　　1、体外转录时不可能将所有DNA模板消除，因而对照组会含有痕量的DNA。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影响。 　　2、可能是引物二聚体的条带。 　　Q18：扩增产物滞留在加样孔中 　　Answer： 　　1、可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链cDNA浓度稀释至100倍再进行二次扩增。 　　2、在二次PCR时，使用的退火温度如果比引物的Tm值低5，可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。 　　Q19：无Ct信号出现 　　Answer： 　　1、反应循环参数不够，一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值。 　　2、检测荧光信号的步骤有误。SYBRgreen法（SG法）采用的是72延伸时采集荧光信号，taqman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。 　　3、引物或探针降解，可用PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针。 　　4、模板不足或降解，则可以重新提取核酸模板。 　　Q20：Ct值出现过晚（Ct38） 　　Answer： 　　1、扩增效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，增加镁离子浓度。 　　2、反应成分降解或加样量不足 　　3、PCR产物过长，一般采用80-150bp. 　　Q21：标准曲线线性关系不佳 　　Answer： 　　1、加样存在误差，是样品浓度不成梯度。 　　2、标准品出现降解，避免反复冻融。 　　3、引物或者探针设计不佳。 　　4、模板中存在抑制物或模板浓度过高。 　　Q22：溶解曲线存在多个主峰 　　Answer： 　　1、引物设计不够优化。 　　2、引物浓度不佳，上下游引物浓度比例不一致。 　　3、镁离子浓度过高。 　　4、模板基因组的污染。 　　Q23：同一样品中，其中某一个荧光信号特别强。 　　Answer: 　　1、试剂配制时反应液没有完全溶化，导致探针量在一管增多。 　　2、试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。 　　3、PCR仪热槽被荧光物质污染，需要清除热槽中的污染。 　　Q24：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？ 　　Answer： 　　1、反应过程中电压不稳定 　　2、可能在20个循环左右时，仪器有停下或仪器有开盖，使光线突然增强 　　3、如果尖峰向下，可能是由卤素灯老化所致，这时应更换。 　　Q25：部分样本扩增效率过低？ 　　Answer: 　　1、提取液残留，一定程度抑制了PCR反应 　　2、反应液未严格取量混匀或分装不均匀 　　3、试剂失效 　　Q26：阴性对照或空白对照翘尾 　　Answer： 　　1、模板提取环境或操作过程有污染 　　2、配液过程存在污染 　　Q27：直线型扩增曲线 　　Answer： 　　1、探针部分降解：一般稀释的探针可在4°C保存至少3个月，探针的反复冻融或导致降解；或者探针在光线下暴露时间太长了。 　　2、反应液中有PCR抑制物。 　　Q28：没有扩增曲线 　　Answer： 　　1、PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段 　　2、电脑设定了自动休眠 　　Q29：基线下滑 　　Answer： 　　基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致。 相关阅读： 常用生物软件大汇总(window版） 聚合酶链式反应（PCR）的应用 PCR引物设计

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[转载]PCR发展历史（乱搜集的）

a2381889653 2018-8-1 09:50

人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的dna聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了 PCR技术 ，并在science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。而后，Saiki等人又在黄石公园从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定;从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为 反转录PCR ，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 1971年 Khorana等最早提出pCR理论:DNA变性解链后与相应引物杂用DNA聚合酶延伸引物,重复该过程便可克隆邯RNA基因。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段,核酸体外扩增设想似乎不切实际,且 Smith等已发现了DNA制性内切酶,使体外克隆基因成为可能, Khorana等的早期设想被忽视。1985年Muli等用大肠杆菌DNA聚合酶工 Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功,1985年10月25日申请了PCR的专利,1987年7月28日批准(专利号4683,202), Mullis是第一发明人;1985年12月20日在 Science杂志上表了第一篇PCR的学术论文,Muis是共同作者 但当时 Mullis所使用的大肠杆菌聚合酶1的片段 Klenow存在一些缺陷Klenow酶不耐热,在对DNA模板进行热变性时,会导致此酶的钝化,因此需要每完成一个扩增周期增加一次酶。1988年初, Keohanog改用T4DNA聚合酶进PCR,提高扩增DNA片段的均一性,1988年 Saiki等从温泉中分离的一种水生嗜热杄菌中提取到一种耐热DNA聚合酶,使扩增反应的特异性和效率大大提操作程序,最终实现了DNA扩增的自动化,迅速推动了PCR的应用和普及。现已被广泛应用于农学、植物病理学、生物学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟但在随后的几十年里,PCR技术被不断改进,它从一种定性的分析方法发展到定量测定;从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增 长达几十个kb的DNA片断。短短几十年,该技术已经成为最常用也最重分子生物学技术之一,其应用范围从基本的基因扩增,扩展到基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等,甚至扩展到许多非生物领域。 自从1985年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法以来，该方法已经成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。PCR方法就是在体外采用酶促反应来特异性的合成特定核酸片段并达到富集的目的，PCR扩增产物可用于下游多种应用，如克隆表达、芯片杂交、突变检测、测序等等。 最传统的“第一代PCR”采用琼脂糖电泳的方式来对PCR产物进行分析，但存在着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大等特点。为了避免上述传统PCR的缺陷，并对基因的表达水平进行定量分析，1992年诞生了所谓“第二代PCR”的 荧光定量实时PCR 。 定量PCR(quantification PCR)在PCR扩增的同时对反应体系中的荧光信号进行实时收集，通过三个参数间（荧光信号-Cq值-靶基因的起始浓度）的关系，最终确定靶基因的拷贝数或基因的表达水平。由于定量PCR的分析最终结果依赖于Cq值，2009年The MIQE Guides(Clinical Chemistry 55 :4 611-622)的发表明确了定量实验整个流程标准化的重要性，否则就会出现实验结果无法重复，甚至结果互相矛盾的状况。更重要的该文献还给出了如何规范定量PCR流程的checklist，其核心目的就是在规范的实验流程、统一的设计思路下，得到的结果才具有可重复性，也具有可比性。但依赖于Cq值仍然是目前定量PCR最大的技术瓶颈，在这个意义上所谓的“定量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，“第三代PCR”应运而生。 Bio-Rad公司的QX100微滴式数字PCR系统就属于“第三代PCR”技术。QX100微滴发生器（droplet generator）将含有核酸分子的反应体系形成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴阅读仪（droplet reader）逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0（因此该技术被称为“数字PCR”），最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。由于能够确定待检靶分子的绝对数目，因此QX100微滴式数字PCR特别适合如下应用：拷贝数变异、突变检测和基因相对表达研究等。 相关阅读： 常用生物软件大汇总(window版） 聚合酶链式反应（PCR）的应用 PCR引物设计

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[转载]PCR引物及其设计原则

a2381889653 2018-7-24 09:53

引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，可以刺激合成一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。引物有两种常见的选择方法，一种是参考文献（尽量选择SCI），文献上说的引物序列一般没问题，而且还有反应条件，比较省事；还有一种方法是用软件设计。个人的建议是，先找文献，如果找不到在自己设计。 引物的设计原则 引物长度（primer length）：引物长度一般在15~30碱基之间，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq 酶的最适温度。 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8.引物5′端和中间G值应该相对较高，而3′端G值较低。 G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间G值相对较高，而3′端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的G值可以用Oligo6软件进行分析） 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 11.引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 扩展阅读： PCR模板的制备 相关阅读： 逆转录PCR PCR常见问题分析

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[转载]PCR产物

a2381889653 2018-7-18 10:10

PCR扩增产物的克隆 平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。 如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。 这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。 对于较短PCR产物，用PUS19的Hinc位点进行克隆，以X-gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。 PCR扩增产物分析 PCR扩增产物有微孔板夹心杂交法、颜色互补分析法、PCR-ELISA法、PCR-OLA法、PCR-打点杂交法等方法 微孔板夹心杂交法： 　　该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA 分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32 P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简 便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常 规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。另一种微孔板杂交法不 是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素 标记的PCR产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点： 前者易操作；固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为 膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需 要时间较长；本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封 闭过程。另外，微孔板固定的DNA 不需再加热或UV照射。 颜色互补分析法 是利用三原色原理，当不同DNA 片段（A和B）同时扩增时，用引 物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧 光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有 一种颜色（红色或绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫 外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一 条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引 物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见 一条红绿互补的黄色条带。 　　该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。这种情 况下，只需判断产物的有无。另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型 时，可用复合PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM 等）。 PCR-ELISA法： (A) 　　本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5’端修饰后仍 可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带 便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。 PCR-OLA法(A) 　　研究表明、不同个体中同源DNA 片段序列间的差异大部分是限定于单个核苷酸的位 置。已弄清的人遗传病的40个基因结构变异中，绝大部分属碱基替换，同样，作为遗 传连锁分析标记的大部分序列变异主要是位于基因组的非编码区的点突变。所以，一 般基因检测技术的一个重要要求是能很容易地检出单一核苷酸变异。寡核苷酸连接试 验（OLA）就是为此目的而设计的。它可以单独或结合PCR快速确定紧密相关的DNA 序 列。 　　OLA是通过设计两种能与靶序列DNA 精确并列杂交的寡核苷酸完成的。寡核酸杂交 后，DNA 连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节 连接酶和NaCl浓度防止其连接，连接产物可通过凝胶电泳观察其大小，或通过5’端 修饰技术使一个寡核苷酸5’端带有一个配基。连接后，通过固相化的亲和配基使其 固定，漂洗后，检测另一寡核苷酸3’端携带的适当标记分子。这一过程如重复进行 多个循环，则连接产物会呈线性增加，故称这循环进行的OLA为连接检测反应（LDR）。 此反应中若再加入两种与上述寡核苷酸互补的寡核苷酸互补的寡核苷酸进行循环的连 接反应，则称之为连接酶链反应。两寡核苷酸在无靶序列的情况下，在非常接近的位 置发生杂交的可能性极小，因此，OLA技术的假阳性极少。另外，连接酶所形成的键 是连接产物。该法适于简单、标准化的基因组样品处理法，或直接用表面活性剂和蛋 白酶初步处理有核细胞作为检测样品。 打点杂交 　　当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过 程是，首先将扩增的DNA 固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再 用放射性或非放射性标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变 DNA 的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同 位素32 P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性 均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作 用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或 法医检验。因而用非放射性物质（生物素、和地高辛等）标记的寡 核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的 方法。非放射性标记物质稳定性高、使用方便、安全、检测速度 快。 文章来源： PCR产物-用户2354056307的博客

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a2381889653 2018-7-17 10:05

一、实验原理 PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 二、主要的成分 模板 1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。 注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。 2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。 引物 １．一般引物用贮液浓度为10uM。对于刚合成的引物可以根据期管壁上的说明计算稀释至10uM即可（一般引物说明上配制的浓度往往过高，所以必须稀释至10uM才能利用实验室最小刻度（0.5ul）的移液器取到）。另外引物一旦稀释完毕，应注意分装小份，防止在用的过程中反复冻融引物而造成引物的失效。 2.一般25ul反应中引物用量为0.5ul（终浓度要求为为0.1——1uM），若引物若放置时间比较长，则可以适当增加引物的用量。引物用量过多，容易导致引物二聚体（电泳时位于前方不成条带的小片段）的出现。 附： 1.引物稀释的方法：配制时首先将合成的引物12000r/min离心5min，室温静置１分钟，然后再慢慢打开管盖，根据引物合成单（或储存引物的离心管）说明加入一定量的灭菌水（引物说明是加入Buffer，此处加入无菌水即可）以达到10uM的浓度，在漩涡振荡器上充分振荡5-10min，即配成10um的贮存液，-20保存备用 PCRbuffer 一般PCR Buffer为10×的，使用时终浓度应为1×。如25ul体系中，应加入10×PCR Buffer为2.5ul。另外使用时应注意是否添加了Mg2+，若没有，则需要再单独添加，有则无需。 Mg2+ 推荐用量为１—４ｍM。浓度过低，影响PCR产物的产量，而浓度过高，则出现非特性扩增。在PCR反应中Mg2+浓度，需进行优化。 三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs） 避免反复冻融，应分装小份。dNTP的浓度取决于PCR反应体系中的特定靶序列的长度，常用浓度为0.2 mM。据此我们可以确定反应体系中的dNTP的最低适宜浓度。当dNTP的浓度大于50mmol/L时会抑制Taq酶的活性。需要注意的是dNTP与Mg2+之间的浓度关系。因为dNTP中的磷酸基团可与Mg2+结合，使反应体系中游离Mg2+浓度下降从而影响Taq酶的活性。 Taq酶 PCR使用的Taq酶在反应时由于丧失3’——5’外切核酸酶活性，因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反应中，taq酶造成的错误的核苷酸错误的掺入率大概为每20000个核苷酸中就有一个，虽然表面上看起来不会有多大的影响，但是在分子克隆中如果有一个错误核苷酸掺入，很有可能造成移码突变，影响是严重的。为弥补taq酶这一缺点常将克隆后的序列进行测序，来确认所扩增序列的准确性。同时也可采用保真度更高的Pfu DNAPolymerase，来确保扩增的准确性，Pfu DNAPolymerase有3 ’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性，是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端，不能进行Ta克隆！而解决此问题的办法是使用TaqPlus DNAPolymerase，该酶是Taq酶和pfu Polymerase的混合物，因此既能保证准确性又能保证能够进行Ta克隆。在使用中应该注意如下问题： 1．25ul体系中一般用量为0.1ul（用枪头沾一下即可），用量过多可能会出现非特异性扩增。 2.PCR体系构建过程中最后加入的一种成分，因此只有在其他试剂加完之后才可从冰箱中取出加入。 3.Taq酶中含有甘油，故不结冰，若结冰则应丢弃。 4.对于预变性时间较长的PCR反应，应在预变性即将结束后加入酶，减少长时间高温对酶活力造成的损伤。 5.保存时间过长的酶可以适当增加用量。 三、体系构建 1.加样原则是酶最后加，倒数第二加的为模板。加样时应从离心管底部将各成分依螺旋式上升的方式加到管壁上。如果做多管PCR，那么按照如下方法计算出公共成分做n管时所需总体积然后混合均匀之后再分装到各个离心管中去，这样可以有效地避免误差及污染。 V总=V标×（n+1） 其中V总需配制的总体积V标每管PCR反应需要某成分的标准体积，n表示所做PCR的管数。 2设立适当的阳性对照和阴性对照，检测PCR各试剂的可用性及污染性，便于对电泳结果准确的分析。 四、预实验 准备一个冰盒，并将做PCR的各试剂（除酶）、模板及无菌水放到冰上融化，设置PCR仪上反应程序。 五、实验步骤 下列步骤均在冰上操作 1.取1.5ml离心管，加入各公共成分（除酶）的V总，然后分装于各PCR管中，最后将酶加入。 2.瞬时离心10s，将各成分混匀。 3.放入PCR仪反应。 4.4冰箱保存。 5.电泳检测。 注：常用于PCR的DNA聚合酶多要求反应必须冷启动，即反应必须在瞬间从低温达到变性温度（一般94）。但有些酶需要热启动，则无需在冰上操作，但酶同样还是需要现用现取，保持酶的最大活性。 示例 PCR反应体系（25µl）及条件如下： 质粒DNA0.5µl 上游特异性PCR引物0.5µl 下游特异性PCR引物0.5µl 10×PCRbuffer2.5µl Mg2+1.5µl dNTP0.5µl Taq PCR聚合酶0.1µl 灭菌水18.9µl 预变性942min 变性9430s 退火5930s 延伸721min 循环数30 cycles 后延伸7210min. 文章来源： 一步一步教你做PCR-用户2354056307的博客

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[转载]PCR重要概念解释（上）

a2381889653 2018-7-16 11:09

原文地址： PCR重要概念解释(上)_用户2354056307_ 新浪博客 Abundance (mRNA 丰度)：指每个细胞中 mRNA 分子的数目。 Abundant mRNA(高丰度 mRNA)：由少量不同种类 mRNA 组成，每一种在细胞中出现大量拷贝。 Acceptor splicing site (受体剪切位点)：内含子右末端和相邻外显子左末端的边界。 Acentric fragment(无着丝粒片段)：(由打断产生的)染色体无着丝粒片段缺少中心粒，从而在细胞分化中被丢失。 Active site(活性位点)：蛋白质上一个底物结合的有限区域。 Allele(等位基因)：在染色体上占据给定位点基因的不同形式。 Allelic exclusion(等位基因排斥)：形容在特殊淋巴细胞中只有一个等位基因来表达编码的免疫球蛋白质。 Allosteric control(别构调控)：指蛋白质一个位点上的反应能够影响另一个位点活性的能力。 Alu-equivalent family(Alu 相当序列基因)：哺乳动物基因组上一组序列，它们与人类 Alu家族相关。 Alu family (Alu 家族)：人类基因组中一系列分散的相关序列，每个约 300bp 长。每个成员其两端有 Alu 切割位点(名字的由来)。 α-Amanitin(鹅膏覃碱)：是来自毒蘑菇 Amanita phalloides 二环八肽，能抑制真核 RNA 聚合酶，特别是聚合酶 II 转录。 Amber codon (琥珀密码子)：核苷酸三联体 UAG，引起蛋白质合成终止的三个密码子之一。 Amber mutation (琥珀突变)：指代表蛋白质中氨基酸密码子占据的位点上突变成琥珀密码子的任何 DNA 改变。 Amber suppressors (琥珀抑制子)：编码 tRNA 的基因突变使其反密码子被改变，从而能识别 UAG 密码子和之前的密码子。 Aminoacyl-tRNA (氨酰-tRNA)：是携带氨基酸的转运 RNA，共价连接位在氨基酸的 NH2基团和 tRNA 终止碱基的 3或者 2－OH 基团上。 Aminoacyl-tRNA synthetases (氨酰-tRNA 合成酶)：催化氨基酸与 tRNA 3或者 2－OH 基团共价连接的酶。 Amphipathic structure(两亲结构)：具有两个表面，一个亲水，一个疏水。脂类是两亲结构，一个蛋白质结构域能够形成两亲螺旋，拥有一个带电的表面和中性表面。 Amplification (扩增)：指产生一个染色体序列额外拷贝，以染色体内或者染色体外 DNA 形式簇存在。 Anchorage dependence (贴壁依赖)：指正常的真核细胞需要吸附表面才能在培养基上生长。 Aneuploid (非整倍体)：组成与通常的多倍体结构不同，染色体或者染色体片段或成倍丢失。 Annealing (退火)：两条互补单链配对形成双螺旋结构。 Anterograde (顺式转运)：蛋白质质从内质网沿着高尔基体向质膜转运。 Antibody (抗体)：由 B 淋巴细胞产生的蛋白质(免疫球蛋白质)，它能识别特殊的外源“抗原”，从而引起免疫应答。 Anticoding strand (反编码链)：DNA 双链中作为膜板指导与之互补的 RNA 合成的链。 Antigen (抗原)：进入基体后能引起抗体(免疫球蛋白质)合成的分子。 Antiparallel (反式平行)：DNA 双螺旋以相反的方向组织，因此一条链的 5端与另一条链的端相连。 Antitermination protein (抗终止蛋白质)：能够使 RNA 聚合酶通过一定的终止位点的蛋白质质。 AP endonucleases (AP 核酸内切酶)：剪切掉 DNA 5端脱嘌呤和脱嘧啶位点的酶 Apoptosis (细胞凋亡)：细胞进行程序性死亡的能力；对刺激应答使通过一系列特定反应摧毁细胞的途径发生。 Archeae (古细菌)：进化中与原核和真核不同的一个分支。 Ascue (子囊)：真菌的子囊包含四个或八个(单一的)孢子，表示一次减数分裂的产物。 Att sites (Att 位点)：在噬菌体和细菌染色体中将噬菌体插入或切除细菌染色体的位点。 Attenuation (衰减)：控制一些细菌启动子表达中涉及的转录终止调控。 Attenuator (衰减子)：衰减发生处的一种内部终止子序列。 Autogenous control (自体调控)：基因产物减弱(负自体调控)或者激活(正自体调控)其编码基因表达的作用。 Autonomous controlling element (自主控制元件)：玉米中一种具有转座能力的转座元件。 Autoradiography (放射性子显影)：通过放射性标记分子在胶卷上留下图像检测分子的方法。 Autosomes (常染色体)：除性染色体外的所有染色体。二倍体细胞拥有两套常染色体。 B B lymphocytes or B cell (B 淋巴细胞或 B 细胞)：合成抗体的细胞。 Backcross (回交)：杂交检测的另一种(早期的)说法。 Back mutation (回复突变)：逆转产生基因失活效果突变的突变，从而使细胞恢复野生型。 Bacteriophage (细菌噬菌体)：侵染细菌的病毒，通常简称为噬菌体。 Balbiani ring (B 环)：多线染色体条带中一个很大的泡状环。 Normal chromosomes (常染色体)：相对较大，一定区域内在特定化学处理下保持着色。 Base pair (碱基对)：是 DNA 双链中一对 A 和 T 或 G 和 C。在 RNA 中特定条件下也能形成其它的配对。 Bidirectinal replication (双向复制)：当两个复制叉在同一起始点以不同的方向移动时形成。 Bivalent (二价染色体)：在减数分裂初期一种包括四条染色单体的结构(两个染色单体代表同源染色体)。 Blastoderm (囊胚层)：昆虫胚胎发育的一个阶段，其中胚胎周围的一层细胞核或细胞围绕着中央的卵黄。 Blocked reading frame (闭锁读框)：由于被终止密码子打断而不能被翻译成蛋白质的读码框。 Blunt-end ligation (平端连接)：直接在末端连接两个 DNA 双链分子的反应。 bp：是碱基对的简称，表示 DNA 之间的距离。 Branch migration (分支迁移)：指双链中与其互补链部分配对的 DNA 链通过延伸与其同源的固定链配对的能力。 Breakage and reunion (断裂与重连)：指一种遗传重组的模式，其中两个 DNA 双链分子在相应的位置打断并十字交叉重新连接(涉及在连接位点异源双链的形成)。 Buoyant density (漂浮密度)：衡量一种物质漂浮在一些标准液体上的能力，如 CsCl。 C Cbanding：在着丝粒附近产生着色区域的染色体分带技术。 C gene (C 基因)：编码免疫球蛋白质链恒定区域的基因。 C value (C 值)：单倍体基因组中 DNA 的总量。 CAAT box (CAAT 盒)：真核生物转录单位起始点上游的保守序列，被一组转录因子识别。 Cap (帽)：是真核生物 mRNA 5端的结构，在转录后通过末端 5 GTP 的磷酸基团和 mRNA 的末端碱基而引入。增加的 G(有时是其它碱基)是甲基化的，产生了 MeG5pppNp… 的结构。 CAP(CRP)：由 cAMP 激活的正调控蛋白质。对 RNA 聚合酶起始 E.coli 中一些操纵子(分解代谢——敏感)是必须的。 Capsid (衣壳)：是病毒微粒外部的蛋白质衣壳。 Caspases：一个蛋白质酶家族，其成员在调亡(细胞程序性死亡)中起作用。 Catabolite repression(分解代谢物阻碍)：由于葡萄糖增加引起一些细菌操纵子表达降低。是cAMP 水平降低使 CAP 调控蛋白质失活所导致。cDNA：与 RNA 互补的单链 DNA，通过体内 RNA 逆转录而合成。 cDNA clone (cDNA 克隆)：代表一个 RNA 的双链 DNA 进入一个克隆载体。 Cell cycle (细胞周期)：一次细胞分裂到另一次分裂的时期。 Cell hybrid (细胞杂交)：包含来自不同种属亲本细胞染色体的体细胞(如人－鼠融合细胞杂交)，通过融合细胞形成融合的异型核而产生。 Centrioles (中心粒)：在减数分裂期聚集在中轴附近、由微管组成的小空圆柱体，位于着丝粒上。 Centromere (着丝粒)：染色体聚集区域，包含减数分裂或有丝分裂纺锤体结合位点。 Centrosomes (中心体)：减数分裂细胞微管组织的区域。在动物细胞中，每一个中心体包括一对由微管附接的、高密度不定型区域围绕的中心粒构成。 Chaperone (分子伴侣)：使一些蛋白质装备或者恰当折叠所需的蛋白质，但是这种蛋白质并不是目标复合物的成分。 Chemical complexity (化学复杂度)：化学分析测量的 DNA 成分量。 Chi sequemce (Chi 序列)：一个提供 E.coli 中 RecA 介导遗传重组热点的八聚体序列。 Chi structure (Chi 结构)：两个双链 DNA 之间的接头通过去掉两个连在一起的环而使每个环产生线形末端暴露出来。它类似于希腊文 chi，从而得此名字。 Chiasma (交叉)：两个同源染色体在减数分裂中交换物质的位点。 Chromatids (染色单体)：复制时产生的染色体拷贝。此名字通常用来形容处于随后的细胞分裂期它们分开的之前的染色体。 Chromatin (染色质)：是细胞中期核内 DNA 和蛋白质复合体。个别的染色体不能区分开。它只能通过与 DNA 特异性作用的染料而识别。 Chromatin remodeling (染色体重建)：指发生在基因活化转录时核小体能量-依赖型的排列或重排。 Chromocenter (染色中心)：来自不同染色体的异染色质聚集。 Chromomeres (染色粒)：在某一时的期染色体中，特别是减数分裂初期，染色很深的可见小颗粒，此时染色体可能表现为一系列的染色粒。 Chromosome (染色体)：携带很多基因的基因组的分离单位。每一条染色体包含长的双链 DNA 分子以及等量的蛋白质。只在细胞分裂中才为可见的形态单位。 Chromosome walking (染色体步移)：连续分离携带重叠 DNA 序列的克隆，使染色体大部分被覆盖。步移通常用于获得某个感兴趣的位点。 cis-acting locus (顺式作用位点)：只影响处于同一 DNA 分子上的 DNA 序列，此性质通常暗示该位点不编码蛋白质。 cis-acting protein (顺式作用蛋白质)：不同寻常的、只作用于表达它的 DNA 序列上的蛋白质质。 cis configuration (顺势构型)：指在同一个 DNA 分子上的两个位点。 cis/trans assays(顺/反测验)：分析两个突变相对构型对表达的影响，双杂合体中，同一基因上的两个突变在反式构型中表现出突变表型，顺势构型中表现出野生表型。 Ciston (顺反子)：是由顺/反测验定义的遗传单位，与基因等同，都是代表一个蛋白质质的DNA 单位组成。 Class switching (类别转换)：在淋巴细胞分化过程中免疫球蛋白质重链 C 区表达的转换。 Clone (克隆)：指大量与祖先细胞和分子相同的细胞和分子。 Cloning vector (克隆载体)：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。 Closed reading frame (关闭读框)：包含阻碍它翻译成蛋白质的终止密码子。 Coated vesicles (包被膜泡)：膜表面有一层蛋白质，如网格蛋白质、COP-1、COP-II 的膜泡。 Coconversion (共转变)：在基因转换中两个位点的同时修改。 Coding strand (编码链)：与 mRNA 有相同序列的 DNA 链。 Codominant alleles (共显性等位基因)：两个都对表型有贡献，谁也不占优势。 Codon (密码子)：三连体核苷酸，代表一个氨基酸或者终止信号。 Coevolution (共进化)：见协同进化。 Cognate tRNAs (同功 tRNA)：能够被一个特殊的氨酰基-tRNA 合成酶识别的 tRNA。 Coincidental evolution (重合进化)：见协同进化。 Cointegrate structure (共合结构)：两个复制子融合产生的结构，一个复制子带有一个转座子，另外一个缺少，但是整合体中出现两个在复制子汇合处的转座子，方向是正向复制。 Cold-sensitive (冷敏)：这种突变在低温下是缺陷型的，但是在高温下正常。 Colon hybridization (菌落杂交)：使用原位杂交来确定携带一个特定同源序列的插入 DNA片段载体的技术。 Compatibility group (相容组)：含有不能同时存在一个细菌细胞内的质粒。 Complementation (互补)：不同的(非等位)基因提供扩散型产物，从而使含有两个反式突变的杂合体产生野生表型的能力。 Complementation assay (互补测验)：见体内互补测验。 Complementation group (互补群)：互相反式重组时不互补的一系列突变，它定义了一个遗传单位(顺反子)。 Complex locus(复合基因座)：果蝇中拥有与代表单个蛋白质的基因功能不一致的遗传性质。在分子水平上复合基因座通常很大(100kb)。 Complexity (复杂度)：在给定样本中不同 DNA 序列的总长度。 Composite transposons (复合转座子)：两个插入序列包围着一段中央区域，这两个序列中的一个或者两个可能使整个元件转座。 Concatemer (多联体 DNA)：包含一系列一前一后重复的基因组单位。 (Con)catenated circle (多联环)：DNA 环如同链上的环一样连接起来。 Concerted evolution (协同进化)：两个相关基因如同组成一个等位基因那样共同进化。 Condensation reaction (缩合反应)：由于失去水分子使共价键形成，例如往多肽链中加入氨基酸的反应。 Conditional lethal mutations (条件致死突变)：在特定的(非许可的)条件下杀死一个细胞或病毒的突变，但是在其它(许可的)条件下使其存活。 Conjugation (接合)：指两个细菌之间的杂交，部分染色体从一个细胞转入另一个细胞。 Consensus sequemce (共有序列)：当许多实际序列比较时，每个位点上的碱基能够代表最常出现的碱基理想序列。 Conservative recombination (保守重组)：在没有任何新 DNA 链形成情况下，已经存在 DNA链的打断和重新连接。 Conservative transposition (保守转座)：即大的序列移动，原认为是转座子，现在认为是附加体。这种机制类似于噬菌体λ位点。 Constant regions (恒定区)：免疫球蛋白质的保守区由 C 基因编码，是变化很少的链的一部分。重链的恒定区决定免疫球蛋白质的类型。 Constitutive genes (结构基因)：由于 RNA 聚合酶与启动子作用而表达的基因，不需要额外的调控。有时候也被称为看家基因，因为它在所有细胞中都有低水平表达。 Constitutive heterochromatin (组成型异染色质)：指永久不表达序列的钝化状态，通常是卫星DNA。 Constitutive mutations (组成型突变)：引起需要调控的基因在不被调控的状态下持续表达。 Contractile ring (收缩环)：在有丝分裂后期中轴附近形成的激动蛋白质纤维环，负责将子代细胞分开。 Controlling elements (控制成分)：玉米中的控制成分是最初由其遗传性质确认的转座单位。 分自主(能够独立转座)或者非自主(只有在一个自主元件存在下转座)两类。 Coordinate regulation (协同调控)：即对一组基因的调控。 Cordycepin (蛹虫草菌素)：是 3脱氧腺苷，是 RNA 聚腺苷化的阻扼子。 Core DNA (核心 DNA)：核心颗粒中包含的 146bp DNA。 Core particle (核心颗粒)：核小体的消化产物，包含组蛋白质八聚体和 146bp DNA，其结构与核小体本身相似。 Corepressor (共阻碍物)：是一个小分子，通过结合到调控蛋白质上抑制转录。 Cosmid (粘粒)：包含l噬菌体 cos 位点的质粒，因此，质粒 DNA 能够在体内被噬菌体衣壳包裹。 Cot (浓度时间常数)：在复性反应中 DNA 浓度和反应时间的乘积。 Cot1/2(半变 Cot 值)：反应完成一半时所需的 Cot 值，它直接与复性 DNA 成正比。 Cotransfection (共转染)：两个标记的共同转染。 Crossing-over (交换)：发生在减数分裂中染色体间互相交换物质，引起遗传重组。 Crossover fixtion (交换固定)：不均等交换的一种可能结果，能使前后连接簇中一个成员的突变延伸到每一簇。 Cruciform (十字架)：在同一链中插入其互补链(而不是与双链中另一条链中的互补片段)配对的 DNA 重复序列所形成的结构。 Cryptic satellite (隐蔽卫星)：不能通过密度梯度上的峰值分离的卫星，即隐藏在主带中。 ctDNA：即叶绿体 DNA。 cAMP：磷酸基团连接核糖 3和 5位置的 AMP 分子，其结合可激活 CAP，原核生物转录中的正调控因子。 Cyclins (细胞周期蛋白质)：在细胞周期中连续积累的蛋白质，随后在减数分裂中被蛋白质水解作用消除。 Cytokinesis (胞质分裂)：在减数分裂中涉及子代细胞分裂和离开的最终过程。 Cytological hybridization (细胞学杂交)：见原位杂交。 Cytoplasm (细胞质)：指质膜和核之间的物质。 Cytoplasmic inheritance (胞质遗传)：定位在线粒体或者叶绿体(也可能是其它细胞器)的基因性质。 Cytoplasmic protein synthesis (胞质蛋白质合成)：代表核基因 mRNA 的翻译，通过附加在细胞骨架上的核糖体进行。 Cytoskeleton (细胞骨架)：真核细胞质中纤维组成的网络。 Cytosol (胞质溶胶)：容纳细胞器(如线粒体)的胞质容积。 D Dloop (D 环)：线粒体 DNA 上的一个区域，其上一小段 RNA 与 DNA 的一条链配对，使 DNA 原始配对链在此区域闲置。也用来描述在 RecA 蛋白质催化的反应中单链“入侵者”的进入，使双链 DNA 中的一条被闲置。 Degeneracy (简并性)：指密码子的第三个碱基上的变化不会改变它所代表的氨基酸。 Deletion (缺失)：一段 DNA 序列被删除，两边的区域连接起来产生的。 Denaturation of DNA or RNA (DNA 或 RNA 变性)：指它们从双链转变成单链状态，双链分开一般因加热产生。 Denaturation of protein (蛋白质变性)：指蛋白质的物理结构向另一结构(不活泼的)转变。 Depressed state (抑制状态)：指关闭的基因。当描述一个基因的一般状态时，它与“诱导”同义。在描述突变的效果时，它与“组成型”同义。 Dicentric chromosome (双着丝粒染色体)：两个染色体片段融合的产物，每一片段都有一个着丝粒。通常稳定，在减数分裂中当两个中心粒向两极运动时被拉断。 Diploid (二倍体)：二倍体染色体包括两个拷贝的常染色体和两个性染色体。 Direct repeat (同向重复)：在同一个 DNA 分子中，相同的(或者相近的)序列以相同的方向出现两次或多次，但并不一定相邻。 Discontinuous replication (不连续复制)：指 DNA 以小片段(岗崎片段)合成然后连接起来。 Disjuction (间断分布)：指在细胞分裂中染色体成分向两极运动。在减数分裂和有丝分裂 II期，分裂的是姊妹染色单体，在有丝 I 期分裂的是姊妹染色单体对。 Divergence (差异百分率)：两个相关 DNA 的核苷酸序列或者两个蛋白质氨基酸序列间差异百分率。 Divergent transcription (异向转录)：相反方向两个启动子之间的转录起始，因此转录从中央区域开始向两边进行。 dna mutant (dna 突变)：这种突变的细菌是温度敏感型的，它们不能在 42℃下合成 DNA，但是能在 37℃合成。 DNAase (DNA 酶)：攻击 DNA 之间化学键的酶。 DNAase I hypersensitive (DNA 酶 I 超敏位点)：由于对 DNA 酶 I 和其它核酸酶切割高度敏感而被发现的染色单体上一小段区域。可能由不包括核小体的区域构成。 DNA-driven hybridization (DNA 驱动杂交)：涉及到额外 DNA 与 RNA 反应的杂交。 DNA poymerase (DNA 聚合酶)：合成子代 DNA 链(在 DNA 模板的指导下)的酶。可能在修复或复制中涉及。

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a2381889653 2018-7-16 11:08

原文网址; PCR重要概念解释（中） Extranuclear genes (核外基因)：核外的、定位在细胞器，如线粒体或叶绿体中的基因。 F Ffactor (F 因子)：细菌性或繁殖质粒。 F1 generation (F1 代)：两个亲本系(同源)杂交后的第一代。 Facultative heterochromatin (兼并性异染色质)：指同时存在活泼型拷贝的惰性序列。如，哺乳动物雌性中的一条 X 染色体。 Fast component (快速变性区)：复性反应中的快成分是首先复性，含有高重复 DNA 的成分。 Fate map (原基分布图)：在胚胎上标示该区域内细胞的后代将会发育而成的成熟组织。 Figure eight (8 字型)：由尚未完成的重组生成的两个相互连接的环状 DNA。 Filter hybridization (滤膜杂交)：将变性 DNA 样本固定于硝酸纤维膜上，然后用放射性标记的DNA 或 RNA 进行杂交。 Fingerprint of DNA (DNA 指纹图谱)：指不同基因组间的不同多形态限制性片段模式。 Fingerprint of protein (蛋白质指纹谱)：酶(如胰蛋白酶)切割蛋白质后产生的片段模式(通常用双向凝胶电泳分离)。 Fluidity (游动性)：指膜的性质，脂质在其单层膜上双向移动的能力。 Focus formation (转化灶形成)：指转化后的真核细胞以高密度的簇生长。 Focus formation units (转化灶单位)：转化灶的数量单位。 Foldback DNA (折回 DNA)：指插入重复组成 DNA 通过变性后重新复性产生的结构。 Footprinting (足纹法)：一种检测 DNA 位点的技术，通过某些蛋白质结合保护化学键，使被保护位置免受酶切割。 Forward mutations (正向突变)：失活野生型基因的突变。 Founder effect (始创效应)：指从一个祖先起源、具有相同染色体(或者染色体一个区域)的个体集合。 Frameshift mutations (移码突变)：因非 3bp 整数倍碱基插入或缺失造成的、改变三联体翻译成蛋白质读框的突变。 G G banding (G 分带)：在中期染色体上产生条纹，从而区分出单倍体各个成员的技术。 G1：真核细胞周期中减数分裂后期到 DNA 复制开始的时期。 G2：真核细胞周期中 DNA 复制结束到下一次减数分裂开始的时期。 Gamete (配子)：指任何一种类型的生殖细胞，精子或者卵，具有单倍体染色体物质。 Gap in DNA (DNA 裂隙)：在双链中的一条上一个或多个核苷酸缺失。 Gene /ciston (基因/顺反子)：指能产生一条多肽链的 DNA 片段。包括编码区和其上下游区域(引导区和尾)，以及在编码片段间(外显子)的割裂序列(内含子)。 Gene cluster (基因簇)：一组相同或者相似的基因。 Gene conversion (基因转换)：指异源双链 DNA 中的一条链转换，使其在出现碱基配对处与另一条链互补。 Gene dosage (基因剂量)：在一个基因组中某个基因的重复数量。 Gene family (基因家族)：一系列外显子相关联的基因，其成员是由一个祖先基因复制或趋异产生。 Genetic code (遗传密码)：DNA(或 RNA)三联体与蛋白质中氨基酸的对应关系。 Genetic marker (遗传标记)：见标记。 Genomic (chromosomal) DNA clone (基因组或染色体 DNA 克隆)：由克隆载体携带的基因组序列。 Genotype (基因型)：一个生物的遗传组成。 Golgi apparatus (高尔基体)：在内质网附近由膜堆积而成结构，在蛋白质糖基化和存储转运中起重要作用。 Gprotein (G 蛋白质)：位于质膜上的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白质三聚体。当三聚体结合 GDP 时，它保持完整并且没有活性。当结合在亚基上的 GDP 被 GTP 代替时，a 亚基与bg二聚体脱离。分离得亚基(a或者bg)随后激活或者抑制一个靶蛋白质。 Gratuitous (安慰诱导物)：与转录中实际诱导物相似，但不是该诱导酶的底物。 GT-AC rule (GT-AG 规则)：指在核基因内含子开始和结束出现的两个固定的脱氧核苷酸。 Gyrase (螺旋酶)：大肠杆菌中 II 型拓扑异构酶，能够向 DNA 中引入负超螺旋。 H Hairpin (发夹)：指在单链 RNA 或 DNA 相邻的互补区域形成的双螺旋结构。 Haploid (单倍体)：单倍染色体组中仅含有每个常染色体的一个拷贝和一个性染色体。单倍体数 n 是二倍体生物配子的特征常数。 Haplotype (单元型)：一些染色体特定区域内等位基因的特殊组合，其缩小模型就是基因型。本来是用来描述 MHC 等位基因组合的，现在用来描述 RELPs 之间的特殊组合。 Hapten (半抗原)：一些小分子物质，与蛋白质结合后能像抗原一样引发免疫应答。 Histone acetyltransferase ，HAT(组蛋白乙酰化酶)：向组蛋白添加乙酰基团来修饰它的酶，一些转录辅激活物有 HAT 活性。 Histone deacetyltransferase ，HDAC(组蛋白去乙酰化酶)：从组蛋白质上除去乙酰基团的酶，通常与转录阻遏子相联系。 Helper virus (辅助病毒)：提供缺陷型病毒缺乏的功能，使后者能完成侵染循环。 Hemizygote (半合体)：失去某个基因拷贝(如由于一条染色体的丢失)，从而只有一个拷贝的单倍体个体。 Heterochromatin (异染色质)：永久处于高聚集状态的基因组区域，它不转录而且复制较晚。可能是组成型的或者兼性的。 Heteroduplex (hybrid) DNA (异源双链 DNA)：由不同亲本双链分子中的互补单链产生碱基配对的双链 DNA，在遗传重组中产生。 Heterogametic sex (异配性别)：具有 2A+XY 的双倍染色体组成。 Heterogeneous nuclear (hn) RNA (不均一核 RNA)：由 RNA 聚合酶 II 产生的核基因转录无。它有宽广的范围和低的稳定性。 Heterokaryon (异核体)：在一个共同的细胞质中包含两个核的细胞，由体细胞融合产生。 Heteromultimeric proteins (异源多聚体蛋白质)：有不同的亚基(不同基因编码)组成的蛋白质。 Heterozygote (杂合体)：在某个位点上有不同等位基因的个体。 Highly repetitive DNA (高度重复 DNA)：即卫星 DNA，是复性中的第一成分。 Histones (组蛋白)：真核生物中保守的 DNA 结合蛋白质，是染色质的基本亚单位。 Homeobox (同源框)：黑腹果蝇同源基因编区域的一部分保守序列。在两栖和哺乳动物早期胚胎发育中也已发现。 Homeotic genes (同源异形基因)：由将身体的一部分转化成另一部分的突变所定义，例如，昆虫的腿可以代替触角。 Homogametic sex (同配性别)：单倍染色体组成为 2A+XY。 Homologs (同源染色体)：携带同样的遗传位点的染色体，二倍体细胞含有每个同源染色体的两个拷贝，分别来自父母本。 Homomultimeric protein (同源多聚体蛋白质)：由相同亚基组成的蛋白质。 Homozygote (纯合体)：同源染色体相应位点有相同等位基因的个体。 Hotspot (热点)：突变或者重组频率显著增加的位点。 Housekeeping (constitutive) genes (持家或组成型基因)：是那些(理论上)在所有细胞中都表达的基因，因为其功能对任何细胞型都是必要的。 HOX genes (HOX 基因)：包括同源框的哺乳动物基因簇，单独成员与黑腹果蝇中 ANT-C 和-BX-C 座位相近。 Hybrid-arrested translation (杂交捕获翻译)：确定与 mRNA 相应的 cDNA 的一种技术，它依赖其与 RNA 配对的能力阻止翻译。 Hybrid DNA (杂交 DNA)：见异源双链 DNA。 Hybrid dysgenesis (杂种败育)：指黑腹果蝇某些株系杂交后代不育(尽管它们在表型上是正常的)的现象。 Hybridization (杂交)：使互补 DNA、RNA 配对形成杂合 RNA 或 DNA。 Hybridoma (杂交瘤)：通过骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合产生的细胞株，它们能无限制的产生两种亲本的免疫球蛋白。 Hydrolytic reaction (水解反应)：伴随着水分子解离而使共价键打开的反应。 Hydropathy plot (亲水性分析)：蛋白质某区域疏水度的检测，也是其位于膜表面的可能程度的检测。 Hydrophilic groups (亲水基团)：与水结合从而蛋白质的亲水区域或脂质双分子层处于水环境中。 Hydrophobic groups (疏水基团)：排斥水分子，因此互相作用产生非水性环境。 Hyperchromicity (增色效应)：当 DNA 变性时吸光度增加的现象。 Hypervariable region (高度可变区)：当不同抗体比较时表现出最大变化的区域。 Ideogram (理数图)：代表染色体 G 带图表。 Idling reaction (空转反应)：当空载 tRNA 进入 A 位点时，核糖体产生 pppGpp 和 ppGpp，诱发应急型反应。 Immortalization (永生或无限增值化)：指真核细胞系获得在培养基中进行无数次分裂的能力。 Immunity in phages (噬菌体免疫)：由于原噬菌体基因组合成的噬菌体抑制物，而阻止同一类型噬菌体侵染细胞的能力。 Immunity in plasmids (质粒免疫)：一个质粒阻止其它同类型质粒在细胞中存活的能力。主要是阻碍复制能力。 Immunity in transposons (转座子免疫)：指某些转座子阻止其它同类型转座子向相同 DNA分子中转移的能力。有多种机制。 Imprinting (印记)：指一个基因通过精子或者卵子发生的改变，使在早期胚胎中父本和母本等位基因有不同的性质。可能是由于 DNA 甲基化产生的。 In situ hybridization (原位杂交)：变性压在显微镜切片中的细胞 DNA，当加入放射性标记的单链 RNA 时可以进行反应，杂交接过可通过自动放射性自显影检测。 In vitro complementation assay (体外互补分析)：确定野生型细胞成分的方法，可以赋予从突变细胞获得的提取物活性。可用于分析确定由突变造成失活的细胞成分。 Incompatibility (不相容性)：某些细菌质粒不能共存在一个细胞中的能力，由质粒免疫造成。 Indirect end-labeling (间接末端标记)：检查 DNA 组织的一种技术，是通过在特殊位点上加入一个切口，分离出含有与切口一端相邻序列的所有片段，可揭示从切口到 DNA 上另一断点的距离。 Induced mutation (诱发突变)：加入诱变剂造成的突变。 Inducer (诱导物)：通过与调控蛋白结合激活基因转录的小分子。 Induction (诱导)：指细菌或者酵母只有当底物存在时才会合成某种酶的能力。当用在基因表达中，指诱导物与调控蛋白结合造成的转录转换。 Induction of prophage (原噬菌体诱导)：由于溶源阻碍物的破坏，噬菌体从宿主基因组切除进入溶源(非感染的)循环。 Initiation factors (起始因子，原核中 IF，真核中 eIF)：在蛋白质合成起始阶段特异性作用于核糖体小亚基的蛋白质。 Insertion sequence (插入序列,IS)：仅携带其转座所需基因的小型细菌转座子。 Insertions (插入)：DNA 中碱基对的增加。 Integral membrane protein (嵌膜蛋白质)：通过非共价键插入膜中的蛋白质，它通过 25 个不带电的或者疏水性氨基酸与膜保持联系。 Integration (整合)：病毒或者其它 DNA 序列插入到宿主基因组中，并且与宿主 DNA 序列两端共价结合。 Interallelic complementation (等位基因间互补)：指异源多具体蛋白质由两个不同突变等位基因编码的亚单位间作用引起的性质变。混合型蛋白质可能比一种类型亚单位构成的蛋白质活性强或者弱。 Interbands (间带)：多线染色体中位于带之间相对较分散的区域。 Intercistronic region (顺反子间区)：一个基因终止密码和另一个基因起始密码间的距离。 Intermediate component (中间组分)：复性反应中处于快成分(卫星 DNA)和慢成分(非重复DNA)之间的组分，由中度重复 DNA 组成。 Interphase (间期)：减数细胞分裂间的时期，分为 G1、S 和 G2 期。 Intervening sequence (间插序列)：即内含子。 Intron (内含子)：一段 DNA 片段，它转录但通过将其两端的序列(外显子)剪接在一起而被移出转录本。 Inversion (倒位)：是染色体的一种改变，一个片段相对两端区域旋转了 180°，然后又重新插入。 Inverted repeats (反向重复)：同一个序列的两个拷贝在一个分子中以相反的方向重复，相邻重复组成回文序列。 Inverted terminal repeats (末端反向重复)：在一些转座子末端以相反方向出现的、小的相关或同样序列。 IS：是插入序列的缩写，只携带其转座必须遗传功能的小型细菌转座子。 Isoaccepting tRNAs (同工 tRNA)：携带相同的氨基酸的 tRNA。 Isotype (同型)：一组密切相关的免疫球蛋白链。 K Karyotye (核型)：一个细胞或种属中整个染色体物质。 Kilobase, kb (千碱基)：1000 个 DNA 碱基对或 1000 个 RNA 碱基的缩写。 Kinase (激酶)：磷酸化(加上一个磷酸基团) 底物的酶，蛋白质激酶的底物是其它蛋白质的氨基酸，分为酪氨酸特异性及丝氨酸/苏氨酸特异性激酶两类。 Kinetic complexity (动力学复杂度)：DNA 复性动力学检测的 DNA 成分的复杂度。 Kinetochore (动粒纤维)：染色体的结构特点，减数分裂纺锤体的微管通过它与染色体相连。 L Lagging strand of DNA (DNA 后随链)：总体上沿着 3¢到 5¢方向延伸，但以小片段形式(5¢-3¢)不连续合成，最后共价连接起来。 Lampbrush chromosomes (灯刷染色体)：在两栖卵母细胞内发现的减数分裂大染色体。 Lariat (套索)：RNA 剪接过程中的中间结构，其中有由 5¢-2¢键形成的带尾巴的环形结构。 Late period of phage development (噬菌体发育晚期)：噬菌体 DNA 复制后的部分感染期。 Late-replication materials (延迟复制物)：在 S 期前不复制，通常由异染色体组成。 Leader (前导区)：在 mRNA 5¢端起始密码子之前的非翻译区。 Leader sequence of a protein (蛋白质前导序列)：短的 N 端序列，负责进出膜。 Leading strand (前导链)：以 5¢-3¢方向连续合成的 DNA 链。 Leaky mutations (渗漏突变)：允许残留水平的基因表达。 Left splicing junction (左剪接点)：一个外显子右末端和内含子左末端的分界点。 Lethal locus (致死座位)：可以获得致死突变(通常是该基因被删除)的任何基因。 Library (文库)：代表整个基因组的一系列克隆片段集合。 Ligation (连接反应)：在双螺旋 DNA 单链上，连接缺口处两个相邻碱基形成磷酸二脂键(也可用于连接 RNA 平末端连接)。 LINES: 哺乳动物基因组中长散布序列，由 RNA 聚合酶 II 转录本反转座产生。 Linkage (连锁)：指由于位于同一染色体上的基因具有一起遗传的倾向，用位点间的重组率来表征。 Linkage disequilibrium (连锁不平衡)：指某些遗传标记的重组发生在物种中的频率高于或低于从其距离位点推测的值。表明一组记是协同遗传的，可能是由于某个区域的退化重组或始创效应，当一个标记引入时无足够时间达到平衡。 Linkage group (连锁群)：包括通过连锁关系联系起来的(直接或者间接的)所有位点，等同于染色体。 Linker DNA (连接 DNA)：核小体中除 146bp 核心 DNA 外的所有 DNA。 Linker fragment (连接片段)：指包含几个限制性酶靶位点的合成双链寡核苷酸。在重组 DNA 的重建中可加在准备用其它酶切割的 DNA 片段末端。 Linker scanner mutations (接头分区突变)：体外在限制性片段加上位点，使两个 DNA 分子发生重组产生，结果在重组的位点加上连接序列。 Linking number (连环数)：闭合 DNA 双螺旋一条链绕过另一条链的次数。 Linking number paradox (连接数矛盾)：指核小体 DNA 中-2 超螺旋的存在和当组蛋白质移开时测量的-1 超螺旋间不一致。 Lipids (脂质)：具有极性头，包括磷酸盐(磷脂)、固醇(如胆固醇)或糖类(糖脂)与由脂肪酸组成的疏水性尾结合。 Lipid bilayer (脂质双分子层)：脂质聚集形成的形式，疏水性的脂肪酸在外边而极性头朝向中间。 Liquid (solution) hybridization (液相杂交)：在溶液中进行互补核酸链的反应。 Locus (基因座)：染色体上某个具有特殊作用的基因所处的位置。它可能被等位基因中一个所占据。 LOD score (LOD 分数)：遗传连锁的一种计算，定义为连锁基因的可能性数据与非连锁基因的可能性数据之比率的 Log10。通常认定基因连锁时 LOD 值应为 3.0，即 1000:1 的比率(必须同任何两各位点不连锁的可能性 50:1 相比较)。 Long-period interspersion (长周期散布)：一种基因组类型，其上一长段重复序列与非重复DNA 交替出现。 Loop (环)：RNA(或者单链 DNA)发夹结构末端的单链区域，与双链 DNA 中反向重复之间的区域一致。 LTR：是长末端重复的缩写，在逆转录病毒 DNA 两端的正向重复序列。 Lumen (腔)：由膜围绕的器官，通常指内质网或者线粒体的内部。 Luxury genes (奢侈基因)：在特别细胞类型中大量(通常)表达并编码特殊功能产物的基因。 Lysogen (溶原)：指在噬菌体感染后期，当它们冲破细胞来释放感染噬菌体子代时细胞死亡。也可用于真核细胞，例如，感染细胞被免疫系统攻击时。 Lysogenic immunity(溶原免疫)：前噬菌体阻止另一相同噬菌基因组在细胞中存活的能力。 Lysogenic repressor (溶原阻遏蛋白)：阻止原噬菌体再次进入溶原循环的蛋白质。 Lysogeny (溶原性)：指噬菌体能够以稳定的细菌基因组原噬菌体形式在细菌中存活的能力。 Lysosomes (溶酶体)：由膜包围的小体，在真核细胞中包括水解酶。 Lytic infection (裂解性感染)：细菌感染后，将以细胞破坏和子代噬菌体的释放结束。 M Main band of genomic DNA (基因组 DNA 主带)：密度离心中由一个宽峰度组成，不包括可见的卫星 DNA 组成的分离条带。 Major histocompatibility (主要组织相容性)：包含一个巨大基因簇的大染色体区域，这些基因编码移植抗体和其它在淋巴细胞表面发现的蛋白质。 Map distance (图距)：用 cM(厘米摩尔根)=重组百分率(有时有调整)来测量。 MAR (基质附着位点，有时也称为 SAR 即支架附着位点)：附着到核基质的 DNA 区域。 Marker (DNA 标记)：已知大小的 DNA 片段，用来计算琼脂糖凝胶电泳条带。 Marker (genetic ) (遗传标记)：在试验中任何感兴趣的等位基因。 Maternal inheritance (母性遗传)：指只有一个亲本提供的遗传标记在子代更容易存活。 Mb(兆碱基)：106 bp DNA 的缩写。 Meiosis (减数分裂)：由两次连续的分裂(减数分裂 I 期，减数分裂 II 期)，使最初的 4n 染色体减少为 4 个 1n 染色体的产物细胞。产物可能是成熟或生殖细胞(精子或者卵)。 Melting of DNA (DNA 溶解)：即变性。 Melting temperature (解链温度 Tm )：DNA 变性过程中温度范围的中值。 Membranes (膜)：由不对称的磷脂双分子层组成，具有侧向流动性并有蛋白质。 Membrane proteins (膜蛋白)：有疏水性区域使蛋白质部分或全部结构能够位于膜上，通产非共价连接。 Metastasis (转移)：指肿瘤细胞从它开始所在的位点向身体其它部位迁移并产生新群落。 Micrococcal nuclease (微球菌核酸酶)：切割 DNA 的内切核酸酶，在染色质核小体之间的DNA 更容易被切开。 Microsomes (微粒体)：与核糖体结合的碎片状内质网。 Microtubules (微管)：由微管蛋白质二聚体组成的纤维。中期的微管被重新组织成有丝分裂中的纺锤体纤维，负责染色体的移动。 Microtubule associated proteins (微管相关蛋白，MAPs)：与微管相关的蛋白质，影响微管稳定性和组织形式。 Microtubule organizing center [微管组织中心，MTOC)：延伸出微管的结构，有丝分裂细胞中最主要的 MTOC 是中心粒。 Minicell (微小细胞)：大肠杆菌中一种无核细胞，通过无核分裂的细胞质分裂而形成。 Minichromosome (SV40 或多瘤病毒微型染色体)：多瘤病毒环形 DNA 的核小体形式。

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a2381889653 2018-7-16 11:07

Mitosis ( 有丝分裂 ) ：真核肌体细胞分裂的方式。 Modification of DNA or RNA (DNA 或 RNA 修饰 ) ：在最初合成聚核苷酸链之后核苷酸上所 做的任何改变。 Modified bases ( 修饰碱基 ) ：除通常在 DNA( T 、 C 、 G 、 A) 和 RNA( U 、 C 、 G 、 A) 四种碱 基以外的碱基，通常是在核酸合成后发生改变。 Molecular chaperone ( 分子伴侣 ) ：协助一些蛋白质装配或者恰当折叠所需的蛋白质，但这种蛋白质并不是靶合物的成分。 Monocistronic mRNA ( 单顺反子 mRNA) ：编码一个蛋白质的 mRNA 。 Monolayer ( 单细胞层 ) ：指真核细胞在培养基上生长，只能形成一个细胞深度的一层。 Morphogen ( 形态发生因子 ) ：诱导特别细胞型以依赖其浓度形式发育的因子。 MPF( 促成熟因子 ) ：是二聚体激酶，包括 p34 催化亚基和周期蛋白调控亚基，其激活能引 发有丝分裂进行。 MtDNA ：线粒体 DNA 。 MTOC ：见微管组织中心。 Multicopy plasmids ( 多拷贝质粒 ) ：以大于一个拷贝出现在细菌中的质粒。 Multiforked chromosome ( 多叉染色体 ) ：在细菌中，有一个以上复制叉，因为在第一个复制 循环结束之前第二个就已开始。 Multimeric protein ( 多亚基蛋白质 ) ：由一个以上亚基组成的蛋白质。 Mutagens ( 诱变剂 ) ：通过诱导 DNA 上的突变增加突变率的物质。 Mutation ( 突变 ) ：指基因组 DNA 序列上的任何改变。 Mutation frequency ( 突变频率 ) ：在种群中某个突变被发现的频率。 Mutation rate ( 突变率 ) ：某个突变发生的速率，通常用每个基因每代出现的次数表示。 Myeloma ( 骨髓瘤细胞 ) ：起源淋于巴细胞的一个肿瘤细胞株，通常产生一种免疫球蛋白质。 N Negative complementation ( 负互补 ) ：当等位基因间互补允许多亚基蛋白质中突变亚基抑制 野生型亚基的活性时发生。 Negative regulators ( 负调控物 ) ：通过关闭转录或者翻译来行使功能。 Negative supercoiling ( 负超螺旋 ) ：双链 DNA 在空间以双螺旋链旋转方向相反的方向形成的扭曲。 Neutral substitution ( 中性置换 ) ：蛋白质中不改变活性氨基酸的变化。 Nick ( 切口 ) ：指双链 DNA 中一条链上两个相邻核苷酸间缺少磷酸二脂键。 Nick translation ( 切口平移 ) ：指大肠杆菌中 DNA 聚合酶 I 能够将切口作为一个起点，将双 链 DNA 中的一条分解并用新物质重新合成新链代之。可用来在体外向 DNA 内引入放射性标记核苷酸。 Noautonomous controlling elements ( 非自主成分 ) ：有缺陷的转座子，只有在同类型自主成 分帮助下才能转座。 Nondisjunction ( 不分离 ) ：指染色单体 ( 双染色体 ) 在减数分裂或有丝分裂中不能向两极移动。 Nonpermissive conditions ( 非许可条件 ) ：不允许条件致死突变存活。 Nonrepetitive DNA ( 非重复 DNA) ：表现出与单个序列一样的复性动力学特征的 DNA 。 Nonreplicative transposition ( 非复制型转座 ) ：指转座子将供体部位序列直接移到新的位点 ( 通常产生一个双链断口 ) 。 Nonsense codon ( 无义密码子 ) ： UAG 、 UAA 、 UGA) 中的任何一个，引起蛋白质合成终止 (UAG 被称为琥珀密码子， UAA 被称为赭石密码子 ) 。 Nonsense mutation ( 无义突变 ) ：指 DNA 上任何代表氨基酸的密码子变为终止密码的突变。 Nonsense suppresser ( 无义抑制 ) ：编码能识别一个或多个终止密码子的突变 tRNA 基因。 Nontranscribed spacer ( 非转录间区 ) ：基因组中前后转录单位之间的区域。 Northern blotting (Northern 杂交 ) ：将琼脂糖凝胶上的 RNA 转移到硝酸纤维膜上从而能够与 互补 DNA 杂交的技术。 Nuclear envelope ( 核膜 ) ：围绕核的一层双膜结构，其上有核孔。内膜在内部与核层粘连蛋 白结合。外膜在细胞质中延伸到内质网的骨架。 Nuclear lamina ( 核纤层 ) ：在核膜内由三种以上核粘连蛋白质构成的蛋白质层。 Nuclear matrix ( 核基质 ) ：围绕和穿透核的骨架。 Nuclear pores ( 核孔 ) ：在核膜上延伸的大孔状结构，可运输大分子进出核。 Nucleoid ( 类核 ) ：细菌中包含基因组的紧凑结构。 Nucleolar organizer ( 核仁组织区 ) ：携带编码 rRNA 基因的染色体区域。 Nucleolus ( 核仁 ) ：由于 rRNA 基因的转录而形成的核内紧凑区域。 Nucleolytic reaction ( 溶核反应 ) ：涉及到核酸中磷酸二脂键的水解。 Nucleosome ( 核小体 ) ：染色质的基本结构亚单位，由 200bp DNA 和组蛋白质八聚体组成。 Null mutation ( 空白突变 ) ：能够完全消除基因功能，通常是由于基因的物理删除导致。 O Ochre codon ( 赭石密码子 ) ： UAA ，是引起蛋白质合成终止的三个密码子之一。 Ochre mutation( 赭石突变 ) ：任何产生 UAA 的 DNA 突变。 Ochre suppressor( 赭石型抑制子 ) ：编码能识别 UAA 密码子从而使蛋白质合成继续的突变 tRNA 基因。该突变子也能抑制琥珀突变。 Okazaki fragment ( 岗崎片段 ) ：在非连续复制中产生的 1000 － 2000bp 短片段，随后被连接 成完整的共价链。 Oncogenes ( 癌基因 ) ：其基因产物具有转化真核细胞的能力，使之与肿瘤细胞相同的方式生 长。逆转录病毒携带的癌基因通常 v-onc 表示。 Open reading frame (ORF ，开放读码框 ) ：不含终止密码子、由编码氨基酸的三联体组成的 连续 DNA 序列，能翻译成蛋白质。 Operator( 操纵基因 ) ： DNA 上的一个位点，阻遏蛋白能与之结合抑制相邻启动子从而抑制 转录。 Operon ( 操纵子 ) ：细菌基因表达和调控的单位，包括结构基因和能被调控基因产物识别的 DNA 控制元件。 Organelles( 细胞器 ) ：细胞质中的结构单元，被膜所包围。 Origin( 原点， Ori) ：复制起始处的 DNA 序列。 Orphans( 孤独基因 ) ：在独立位点上发现的单个基因，但它与一个基因簇相关。 Overwinding of DNA(DNA 过旋 ) ：沿双链中两条链的缠绕方向使之更紧的正超螺旋。 P Packing ratio ( 包装比 ) ：指 DNA 长度与其包含纤维单位长度的比值。 Pairing of chromosomes ( 染色体配对 ) ：见联会染色体。 Palindrome ( 回文序列 ) ： DNA 序列中一条链从左到右阅读和另一条链从右到左读是一样的 序列，由相邻的反向重复组成。 Papovaviruses ( 乳头多瘤病毒 ) ：是一类基因组较小的动物病毒，包括 SV40 和多瘤病毒。 Paranemic joint ( 平行汇接 ) ：指两个 DNA 互补序列肩并肩连接在一起而不是以双螺旋结构 缠绕在一起的区域。 pBR322 ：一个标准的质粒克隆载体。 PCR( 聚合酶链式反应 ) ：指通过变性与引物退火，在 DNA 聚合酶作用下使 DNA 延伸的循环技术，能将目标 DNA 序列数量扩增到 106 倍以上。 Perinuclear space ( 核周隙 ) ：内核膜和外核膜之间的区域。 Periodicity of DNA (DNA 的周期率 ) ：每个双螺旋转弯中所包含的碱基对数。 Permissive condition ( 许可条件 ) ：允许条件致死突变存活的条件。 Peptite strains of yeast ( 酵母小菌落株 ) ：缺少线粒体功能的酵母突变株。 Phage /bacteriophage( 噬菌体 / 细菌噬菌体 ) ：一种细菌病毒。 Phase variation ( 相转变 ) ：指细菌鞭毛类型的改变。 Phenotype ( 表型 ) ：一个生物的表现或其它特点，是遗传和环境相互作用的最终表现。 Phosphatase ( 磷酸酶 ) ：一种从底物上移开磷酸基团的酶。 Plasma membrane ( 质膜 ) ：限定每个细胞界限的连续膜体。 Plasmid ( 质粒 ) ：染色体外自主复制的环形 DNA 。 Playback experiment ( 再现试验 ) ：重新获得与 RNA 杂交的 DNA ，从而通过快速复性反应检 查其是非重复序列。 Plectonemic winding ( 相缠螺旋 ) ：指典型的双螺旋 DNA 中两条链的相互缠绕。 Pleiotropic gene ( 多效基因 ) ：影响表型上不止一个特点 ( 是不相关的 ) 的基因。 Ploidy( 倍数 ) ：指一个细胞中出现的染色体拷贝数，单倍体只有一个拷贝，二倍体有两个拷贝，等等。 Point mutation ( 点突变 ) ： DNA 上单个碱基对的改变。 Polarity ( 极性 ) ：指一个基因突变影响同一转录单位下游基因的表达 ( 转录或者翻译 ) 的效果。 Polyadenylation ( 多聚腺苷酸化 ) ：真核 RNA 转录时，向其 3¢ 端加入一系列聚腺苷酸的过程。 Polycistronic mRNA ( 多顺反子 mRNA) ：包括不止一个基因编码区域的 mRNA 。 Polymorphism ( 多态性 ) ：指基因组群中同时发生的等位基因不同 ( 不同表型的等位基因或限 制性模式的 DNA 变化 ) 。 Polyploid ( 多倍体 ) ：有两套以上单倍体基因组。 Polyrotein ( 多聚蛋白质 ) ：能剪切成几个独立蛋白质的基因产物。 Polysome/polyribosome( 多聚核糖体 ) ：是一条 mRNA 上结合多个参加翻译的核糖体。 Polytene chromosomes( 多线染色体 ) ：由一条染色体多次复制但不分离产生。 Position effect ( 位置效应 ) ：指转移到基因组上新位置而引起基因表达的改变，如活性基因置于异染色质附近会失活。 Position effect variegation ( 位置效应斑驳 ) ：指一个基因在某些细胞中失活而在其它细胞中 有活性，是异染色质非活性区域延伸的结果。 Positive regulator protein ( 正调控蛋白 ) ：一个转录单位激活所必须的蛋白质。 Positive supercoiling ( 正超螺旋 ) ：双链以两条链缠绕的方向形成的超螺旋。 Postmeiotic segregation ( 减数分裂后分离 ) ：当复制后允许两条链分开时，含有不同信息的 异源双链 DNA 两条链分离现象。 Primary cells ( 原始细胞 ) ：直接从动物中取出放入培养基中的真核细胞。 Primary transcript ( 初级转录本 ) ：与一个转录单位相对应的未修饰 RNA 产物。 Primer ( 引物 ) ：与一条 DNA 链配对的短序列 ( 通常是 RNA) ，提供自由 3¢ 末端 OH ，使 DNA 聚合酶开始合成 DNA 链。 Primosome ( 引发体 ) ：指在非连续 DNA 复制中，每个岗崎片段合成引发反应中涉及的蛋白 质复合体。引发体能沿着 DNA 移动，参与连续的引发反应。 Prion ( 阮病毒 ) ：一种蛋白质感染颗粒，尽管它不含有核酸但是可遗传的。例如羊骚痒病和 牛海绵状脑病因子 PrPsc 和在酵母中保持遗传状态的 Psi 。 Procentriole ( 原中心粒 ) ：未成熟的中心粒，在成熟中心粒附近形成。 Processed pseudogene ( 已加工假基因 ) ：缺少内含子的非活性基因拷贝，与活性基因的割裂 结构相反。可能起源于 mRNA 逆转录物和双拷贝插入基因组。 Processive enzyme ( 进行性酶 ) ：连续作用于特殊底物的酶，在重复的催化过程中不分离。 Prokaryotic( 原核生物 ): 无核低等生物，尤指细菌。 Promoter ( 启动子 ) ：结合 RNA 聚合酶并起始转录的 DNA 区域 -10 sequence (-10 区 ) ：位于细菌基因起始位点上游 10bp 的一段保守序列 TATAATG 。在 RNA 聚合酶诱导 DNA 溶解起始时起作用。 -35 sequence (-35 区 ) ：细菌基因起始位点上游 35bp 处的保守序列，在 RNA 聚合酶起始识 别中作用。 Proofreading ( 校正 ) ：指蛋白质或核酸合成中的纠错机制。涉及对加入链中的单个单体检查。 Prophage ( 原噬菌体 ) ：噬菌体基因组共价整合成为细菌基因组线性部分。 Proteolytic ( 蛋白质水解 ) ：包括蛋白质中肽键的水解。 Proto-oncogene ( 原癌基因 ) ：真核基因组中与逆转录病毒携带的癌基因对应基因，常用 c-onc 表示。 Provirus ( 原病毒 ) ：真核染色体中与 RNA 逆转录病毒基因组对应的双链 DNA 序列。 Pseudogenes ( 假基因 ) ：由原始活性基因突变引起的基因组中稳定但不活泼的成分。 Puff ( 胀泡 ) ：指多线染色体某些条带位点 RNA 合成相关的条带扩展。 Pulse-chase experiments ( 脉冲追踪试验 ) ：将细胞与放射性标记的合成底物 ( 属于某些途径或大分子 ) 一起培养，则标记结果将在下一步与非标记底物共培养中延续。 Q Quaternary structure of protein ( 蛋白质四级结构 ) ：指蛋白质的多亚基组成。 Quick-stop dna mutant ( 快停突变体 ) ：当温度升高到 42 ℃时大肠杆菌 DNA 迅速停止复制的突变类型。 R Rloop (R 环 ) ：当 RNA 与 DNA 双链中互补链杂交时，使原来的 DNA 链以环的形式延伸出杂交区域而形成的结构。 Rapid lysis mutants ( 裂解突变体 ) ： T- 噬菌体侵染后使大肠杆菌表现出裂解形式的突变。 Reading fram ( 读码框架 ) ：将一条核苷酸链以三种三连体形式读出的形式之一。 Reassociation of DNA (DNA 复性 ) ：指互补单链间配对形成双螺旋。 RecA ：是大肠杆菌中 recA 基因座的产物，具有双重功能，能激活蛋白酶并能改变单链 DNA 分子。蛋白酶 - 激活活性控制 SOS 反应；核酸酶活性涉及重组修复途径。 Receptor( 受体 ) ：是一种位于脂膜上的跨膜蛋白质，在胞外区域与配体结合，从而引发胞内 结构域活性改变 ( 有时也用于固醇类受体，它们是被胆固醇或其它小分子配体结合激活的转录因子 ) 。 Recessive alleles ( 隐性等位基因 ) ：在杂合体表型上被显性等位基因所覆盖。通常是隐性基 因产物的缺失或失活所致。 Recessive lethal ( 隐性致死 ) ：当细胞具有一个等位基因纯合体时是致死的。 Reciprocal recombination ( 互惠重组 ) ：按照等位基因父本和母本的来源反向安排所产生的新基因型。 Reciprocal translocation ( 相互易位 ) ：一个染色体部分和另一个染色体部分交换。 Recombinants ( 重组体 ) ：子代与父母有不同的基因型。 Recombinant joint ( 重组接点 ) ：两个重组双链 DNA 分子连接的位点 ( 异源双链区的边缘 ) 。 Recombination nodules ( 重组节 ) ：联会复合体上出现的稠密物质，涉及染色体交换。 Recombination-repair ( 重组修复 ) ：通过从另一双链中获得同源单链来修补双链 DNA 一条链 上缺口的模式。 Regulatory gene ( 调控基因 ) ：编码一个 RNA 或蛋白质产物，其作用是控制其它基因表达。 Relaxed mutants ( 松弛突变体 ) ：使大肠杆菌对氨基酸 ( 或其它营养来源 ) 不严格反应突变。 Relaxed replication control ( 松弛型复制控制 ) ：有些质粒在细菌停止分裂后继续复制的能力。 Release (termination) factors( 释放因子 ) ：识别终止密码子引起完整的多肽链和核糖体从 mRNA 上释放的蛋白质。 Renaturation ( 复性 ) ：指 DNA 双螺旋的两条互补单链重新结合。 Repeating unit ( 串联重复单位 ) ：是重复序列的长度，在限制性图谱上呈环状。 Repetition frequency ( 重复频率 ) ：在二倍体基因组中特定序列出现的次数，非重复 DNA 为没有 r 因子的情况下外终止转录的序列。 Rifamycins ( 利福平 ) ：阻止细菌转录的一种抗生素。 Right splicing junction ( 右剪接点 ) ：内含子右末端和相邻外显子左末端的边界。 RNAase ：底物为 RNA 的酶。 RNA-driven hybridization (RNA- 驱动杂交 ) ：以过量 RNA 与单链 DNA 样本中互补序列反应。 RNA polymerase (RNA 聚合酶 ) ：使用 DNA 作为模板合成 RNA 的酶 ( 正式应为 DNA- 依赖 性 RNA 聚合酶 ) 。 RNA replicase (RNA 复制酶 ) ：使用 RNA 为模板合成 RNA 的酶 ( 在 RNA 病毒的复制中使用 ) 。 Rolling circle( 滚环 ) ：一种复制模式，复制叉沿环形模板复制一定次数，每个反应中新合成的链将前一反应中合成的链抛出，形成与环状模板链互补的一系列线性序列。 Rot ： RNA- 驱动杂交反应中 RNA 浓度和反应时间的乘积。 Rough ER ( 粗糙内质网 ) ：由结合核糖体的内质网组成。 S S phase (S 期 ) ：真核细胞循环中 DNA 合成的时期。 S1 nuclease (S1 核酸酶 ) ：特异性分解未配对 ( 单链 )DNA 的酶。 Saltatory replication ( 跳跃复制 ) ：产生某些序列大量拷贝的偶然单向扩增。 Satellite DNA ( 卫星 DNA) ：由一个短基本重复单位构成的许多连续重复 ( 相同或者相似的 ) 组成。 Saturation density ( 饱和密度 ) ：分裂在因细胞 - 细胞接触而被抑制之前，培养细胞在体外生 长的密度。 Saturation hybridization ( 饱和杂交试验 ) ：一个成分过量，使另一成分中所有互补序列形成 双链结构。 Scaffold ( 染色体支架 ) ：当染色体失去组蛋白质的时，形成一个以姊妹染色体对形式存在的蛋白质结构。 Scarce (complex) mRNA ( 稀少 mRNA) ：由大量的不同 mRNA 成分组成，每一个在细胞中 只有很少的拷贝。 scRNA ：出现在胞质和核中的小胞质 RNA 分子。 scRNPs ： scRNAs 与蛋白质结合形成的小核糖体蛋白颗粒。 Segmentation genes ( 体节基因 ) ：控制昆虫体节数量或极性的基因。 Selection ( 选择 ) ：指使用特殊条件从而只能使带有特殊表型的细胞存活。 Semiconservative replication ( 半保留复制 ) ：通过亲本 DNA 双螺旋两链分开，每一链作为模 板合成新的互补链的复制方式。 Semidiscontinuous replication ( 半不连续复制 ) ：一条新链连续合成而另一条链不连续合成的 模式。 Septum ( 隔膜 ) ：在细胞中部形成的物质，在分裂周期末能将细胞分成两个子细胞。 Serum dependence ( 血清依赖性 ) ：指真核细胞需要血清中的某些因子才能在培养基上生活。 Sex chromosome ( 性染色体 ) ：在两个性别中内容不同的染色体，通常标记为 X 或 Y( 或 W 和 Z) ，一个性别是 XX( 或 WW) ，另一个性别是 XY( 或 WZ) 。 Sex linkage ( 性连锁 ) ：一种遗传方式，在性染色体 ( 通常是 X) 上所携带基因的表现。 Sex plasmid ( 性质粒 ) ：实际上是一个附加体，能够起始接合过程，在此过程中染色体物质从一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞。 Shine-Dalgarno sequence (SD 序列 ) ：部分或所有细菌 mRNA 上 AUG 起始密码之前的 AGGAGG 序列，与 16S RNA 上 3¢ 末端序列互补，在核糖体与 mRNA 结合中起作用。 Short-period interspersion ( 短散布序列 ) ：基因组的一种形式，其中， 300bp 的中等重复序列 与 1000bp 左右的非重复序列交替出现。 Shotgun experiment ( 鸟枪法试验 ) ：以随机产生的片段形式克隆整个基因组。 Shuttle vector ( 穿梭载体 ) ：构建的具有两种宿主 ( 例如，大肠杆菌和酿酒酵母 ) 复制原点的质 粒。可用来在真核生物和原核生物中携带外源片段。 Sigma factor (s 因子 ) ：起始必须的 RNA 聚合酶的一个亚基，主要影响 RNA 聚合酶结合位 点 ( 启动子 ) 的选择。 Signal hypothesis ( 信号假说 ) ：指分泌蛋白质 N- 端序列新生肽链连接到膜上的作用，即 mRNA 和核糖体通过正在合成的蛋白质 N- 端衔接到膜上。 Signal sequence ( 信号序列 ) ：蛋白质上负责共转移进入内质网膜的区域 ( 通常是 N- 端 ) 。 Signal transduction ( 信号传导 ) ：指受体和配体在细胞表面作用并传递引发细胞内途径信号 的过程。 Silent mutations ( 沉默突变 ) ：不改变基因产物的突变。 Silent sites ( 沉默位点 ) ：指突变不影响基因产物的位点。 Simple-sequence DNA ( 简单序列 DNA) ：等同于卫星 DNA 。 SINES ：短散布序列，是一类反转座子，以短的散布重复在哺乳动物基因组中出现，来自 RNA 聚合酶 III 介导的转录。 Single-copy plasmid ( 单拷贝质粒 ) ：在细菌中以每个宿主染色体一个质粒的比率存在。 Single-strand assimilation ( 单链同化 ) ：指 RecA 蛋白质引起 DNA 单链替换双螺旋中其同源 链的能力，即能使单链同化进双链。 Single-strand exchange ( 单链交换 ) ：双螺旋 DNA 一条链离开其原来的配对链，而与另一分 子中的互补链配对从而替换第二个分子中同源链的反应。 Single X hypothesis ( 单 X 假说 ) ：指雌性哺乳动物中一个 X 染色体失活现象。 Sister chromatids ( 姊妹染色单体 ) ：由复制产生的一个染色体的拷贝。 Site-specifix recombination ( 位点特异性重组 ) ：发生在两个特异序列 ( 不一定同源 ) 之间，如 噬菌体整合 / 切除或转座中共整合结构的拆分。 Slow component ( 慢成分 ) ：复性反应中最后复性的成分，通常由非重复 DNA 组成。 Slow-stop dna mutant ( 慢停突变 ) ：大肠杆菌中，在 42 ℃下能够完成当前复制但不能起始第 二轮复制的突变。 Smooth ER ( 光滑内质网 ) ：由不与核糖体结合的内质网组成。 snRNA( 核小 RNA) ：指任何一个限制在核内的小分子 RNA ，一些 snRNA 在涉及剪接过程，另一些涉及 RNA 合成反应。 snRNPs ：核小核糖体蛋白质 (snRNA 与蛋白质结合 ) 颗粒。 Solution hybridization ( 液相杂交 ) ：见液态杂交。 Somatic cells ( 体细胞 ) ：生物体内除生殖细胞以外的所有细胞。 Somatic mutation ( 体细胞突变 ) ：发生在体细胞内的突变，只影响其子代细胞，不遗传后代。 SOS box (SOS 框 ) ：能被 LexA 抑制蛋白质所识别的～ 20bp DNA 序列 ( 启动子 ) 。 SOS response(SOS 反应 ) ：指大肠杆菌对放射性或其它 DNA 损伤反应而诱导许多酶，包括 激活修复活性。其原因是 RecA 激活蛋白酶活性，从而切割 LexA 抑制因子。 Southern blotting (Southern 杂交 ) ：指将变性 DNA 从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维膜从而与 补核算杂交的过程。 Spheroplast ( 原生质球 ) ：指细胞壁被大部分或者全部除掉的细菌或者酵母细胞。 Spindle ( 纺锤体 ) ：指真核细胞在分裂中重新组织的结构，核膜崩裂，染色体通过微管衔接 到纺锤体上。 Splice site ( 剪接位点 ) ：外显子 - 内含子交界处周围的序列。 Splicing ( 剪接 ) ：指内含子切除和外显子连接，因此内含子被剔除，而外显子剪接到一起。 Spontaneous mutation ( 自发突变 ) ：无任何诱变剂加入时发生的突变。 Sporulation ( 孢子形成 ) ：细菌 ( 由形态转变 ) 或者酵母 ( 作为减数分裂的产物 ) 中产生孢子。 SSB ：单链结合蛋白，大肠杆菌中一种与单链 DNA 结合的蛋白质。 Staggered cuts ( 交错切口 ) ：当 DNA 两条链在不同的相邻位点切割时产生交错切口。 Start point ( 起始点 ) ：指 DNA 上转录成 RNA 第一个碱基所在的位置。 Stem ( 中轴 ) ：发夹结构中的碱基配对层。 Sticky ends( 粘端 ) ：指双链 DNA 相反突出端或不同 DNA 双链分子末端的互补单链，可由双螺旋 DNA 上的交错切口产生。 Stop codons ( 终止密码子 ) ： 3 个终止蛋白质合成的核苷酸三链体 (UAA 、 UAG 、 UGA) 。 Strand displacement ( 链置换 ) ：一些病毒复制的模型，其中合成一条新链代替双螺旋 DNA 中的互补链。 Streptolydigins ( 利迪链霉素 ) ：阻遏细菌聚合酶转录的延伸的一种抗生素。 Stringent replication ( 严谨型复制 ) ：指限制单拷贝质粒在细菌染色体之外多次复制。 Stringent response ( 应急反应 ) ：指细菌在恶劣生长环境中关闭 tRNA 和核糖体形成的能力。 Structural gene ( 结构基因 ) ：编码非调控 RNA 或蛋白质的基因。 Supercoiling ( 超螺旋 ) ：指闭合环状双链 DNA 在空间中螺旋，并绕过自身中轴的结构。 Superrepressed ( 超阻遏 ) ：与不可诱导的意思相同。 Suppression ( 抑制 ) ：指降低突变效果而不逆转 DNA 本身变化的突变。 Suppressor (extragenic) ( 抑制子 ) ：通常是编码突变 tRNA 的基因，此 tRNA 能够识别突变的 密码子，按原意或可接受的错意替代。 Suppressor (intragenic) ( 抑制因子 ) ：是在移码突变后恢复原来读码框的补偿突变。 SWI/SNF ：染色质重建复合体，用 ATP 的水解提供能量改变核小体结构。 Synapsis( 联会 ) ：指在减数分裂初期同源染色体的两对姊妹染色单体联合，产生二价染色体 结构。 Synaptonemal complex ( 联会复合体 ) ：联会染色体的形态结构。 Syntenic genetic loci ( 同线基因座 ) ：位于同一个染色体上的基因座。 Transformation (转化)：细菌接纳外源 DNA 而引入新的基因标记。 Transformation of eukaryotic cells (真核细胞的转化)：指真核细胞在培养基中向非限制生长状态的转化。 Transgenic animals (转基因动物)：通过卵注入将新的 DNA 序列引入遗传系产生的动物。 Transit peptide(转运多肽)：通过膜上翻译后通道进入细胞器的蛋白质上切下的短引导序列。 Transition (转换)：是一种突变，嘌呤代替另一种嘌呤，或嘧啶代替另一种嘧啶。 Translation (翻译)：是在 mRNA 膜板上进行蛋白质合成。 Translocation of a chromosome (染色体易位)：指部分染色体通过切割分开然后与其它染色体结合的重组。 Translocation of a gene (基因易位)：指在基因组上原拷贝位点以外尾点出现新的拷贝。 Translocation of a protein (蛋白质转运)：指蛋白质跨膜运动。 Translocation of the ribosome (核糖体位移)：是其在往多肽链中加入一个氨基酸后沿着 mRNA 移动一个密码子。 Transmembrane protein (跨膜蛋白质)：是膜的组成成分，其一个或多个疏水区域位于膜上，亲水区域暴露在膜的一边或者两边。 Transplantation antigen (移植抗体)：在所有哺乳动物细胞中，由主要组织相容性位点编码的一种蛋白质，涉及淋巴细胞的作用。 Transposase (转座酶)：催化转座子插入新位点的酶。 Transposition immunity (转座免疫)：指某些转座子阻止其同类型转座子转座到同一个 DNA分子的能力。 Transposon(转座子)：能将自身插入基因组新位置的 DNA 序列(与靶位点无任何相关序列)。 Transposition (转座)：指转座子移到基因组新的位点(参见非重复转座、复制型转座和保守性转座)。 Transvection (转位)：指仅当两个染色体联会时影响另一个同源染色体上等位基因的能力。 Transversion (颠换)：指一个嘌呤被嘧啶代替或相反的突变。 True-breeding organisms (培育纯合体)：是正在考虑的性状纯合体。 Twisting number (DNA 扭转数)：指碱基对数目与双螺旋每个螺旋的碱基数之比。 U Underwinding of DNA(欠旋 DNA)：由负超螺旋产生(因双螺旋本身以链缠绕反方向螺旋)。 Unequal crossing-over (不等交换)：指重组位点在两个亲本 DNA 分子上不同位置交换。 Unidirectional replication (单向复制)：指单个复制叉从起始处向特定移动。 Uninducible mutants (不可诱导型突变)：失去被诱导能力的突变。 Unscheduled DNA synthesis (期外 DNA 合成)：真核细胞 S 期以外合成的任何 DNA。 Up promoter mutations (启动子上升突变)：增加转录起始频率的突变。 Upstream (上游)：转录起点之前的序列，例如，细菌启动自在转录单位的上游，起始密码在编码区上游。 URF(准开放读框)：推测能编码蛋白质，但尚未发现其任何产物。 V gene (V 基因 ) ：编码免疫球蛋白链中主要可变区 (N 端 ) 的序列。 Variable region ( 可变区 ) ：免疫球蛋白中由 V 基因编码的区域，高度可变，因构建有活性基 因时引入不同基因拷贝和改变产生。 Variegation( 斑驳 ) ：表型斑驳在机体发育中由基因型的改变产生。 Vector ( 载体 ) ：见克隆载体。 Vesicle ( 膜泡 ) ：结合于膜上的小体，由膜出芽产生，通常能和其它膜融合。 Virion ( 病毒颗粒 ) ：是病毒物理颗粒 ( 与其侵染细胞和复制的能力无关 ) 。 Virulent phage ( 烈性噬菌体 ) ：不能产生溶原态的噬菌体。 W Wobble hypothesis ( 摆动假说 ) ：一个 tRNA 通过与密码子第三个碱基非寻常配对 ( 不是 GC ， AT) 而识别不止一个密码子。 Writhing number ( 缠绕数 ) ：双链中轴在空间绕过自身的次数。 Z Zero time-binding DNA ( 零时间结合 DNA) ：在复性反应开始时进入双螺旋形式，是由于反 向重复在分子内配对引起。 Zinc finger protein ( 锌指蛋白 ) ：具有重复结构的氨基酸模式，相隔特定距离的胱氨酸结合锌指，能与某些 RNA/DNA 结合。 Zoo blot ( 动物杂交 ) ：指使用 Southern 杂交检验与一个种属的 DNA 与其它很多种属基因组 DNA 杂交的能力。 Zygote ( 合子 ) ：由两个配子融合产生，即一个受精卵。 T T cells (T 细胞 ) ： T 淋巴细胞，可分为几个功能类型，携带 TCR(T 细胞受体 ) 并且涉及细胞 免疫。 Tm 是溶解温度的缩写。 Tandem repeats ( 连续重复 ) ：连续存在的多拷贝相同序列。 TATA box (TATA 框 ) ：在真核 RNA 聚合酶 II 转录单位起始点前 25bp 处发现的富含 AT 的 保守区，可能涉及 RNA 聚合酶的正确起始定位。 Telomerase ( 端粒酶 ) ：是核糖体蛋白酶，能通过加入单个碱基在端粒末端产生重复单位。 Telomere ( 端粒 ) ：是染色体的实际末端， DNA 序列包括简单的重复单位以及突出的、可形 成发夹结构的单链末端。 Temperature-sensitive mutation ( 温敏型突变 ) ：产生在低温下正常而在高温下无活性基因的 突变 ( 相反突变通常称为冷敏型突变 ) 。 Terminal redundancy ( 末端冗余 ) ：指噬菌体基因组两端 ( 例如 ) 同一个序列的重复。 Termination codon ( 终止密码子 ) ： UAG( 琥珀 ) 、 UAA( 赭石 ) 或者 UGA 之一，引起蛋白质合 成终止，也称为无义密码子。 Terminator ( 终止子 ) ：转录本后部所代表的 DNA 序列，能够引起 RNA 聚合酶终止转录。 Tertiary structure of a protein ( 蛋白质三级结构 ) ：指蛋白质多肽链空间组织形式。 Testcross ( 测交 ) ：用一个基因型未知的个体与隐性纯合体杂交，其后代的表型与未知基因 型亲本携带的染色体直接相关。 Thalassemia ( 地中海贫血症 ) ：是一种缺少 a 或者 b- 株蛋白质的红细胞疾病。 Thymine dimer ( 胸腺嘧啶二聚体 ) ：由紫外照射引起 DNA 上相邻胸腺嘧啶化学交联而形成 的一种突变。 Topoisomerase ( 拓扑异构酶 ) ：能够改变 DNA 连环数的酶 (I 型一次一个， II 型一次两个 ) 。 Topological isomers ( 拓扑异构体 ) ：具有不同连接数的相同 DNA 分子。 Tracer ( 示踪 ) ：指复性反应中带有放射性标记的成分，其量很少，不足以改变反应进程。 Trailer ( 非转录尾区 ) ：指 mRNA 3¢ 末端位于终止密码子之后的非翻译序列。 Trans configuration( 反式构型 ) ：指两个基因座在不同 DNA 分子 ( 染色体 ) 上出现。 Transcribed spacer ( 被转录间隔 ) ：指 rRNA 转录单位的一部分，它被转录但是在成熟过程 中被抛弃，即它不产生 rRNA 。 Transcription ( 转录 ) ：以 DNA 模板合成 RNA 。 Transcription units ( 转录单位 ) ：指 RNA 聚合酶起始位点和终止位点间的距离，可能包括不 止一个基因。 Transduction ( 转导 ) ：指噬菌体将细菌基因从一种细菌中转移到另一种细菌中。一个携带自 身以及宿主基因的噬菌体称为转导噬菌体。也可指逆转录病毒获得和转移真核基因。 Transfection ( 转染 ) ：接受加入的 DNA 从而获得新的基因标记。 原文地址： PCR重要概念解释(下)_用户2354056307_ 新浪博客

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[转载]PCR常见问题分析

a2381889653 2018-7-13 09:59

问题1：无扩增产物 现象： 正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象： 条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低 6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象： 产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象： 空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物 的交叉污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 母链结合 当PCR反应加热至90-95左右时，会使模板DNA产生变形，解开为单链，当退火冷却至55-60左右时，因为引物分子量较小，运动速度较快，和母链碰撞的机会很多，所以退火时引物优先会与母链相互结合。引物如果太大，会导致退火时无法激发模板，即引物无法优先与模板链相互结合，而是与较多的互补模板链相互结合。所以引物不能太大，一般不可以超过30个脱氧核苷酸的长度。 缓冲液 PCR缓冲液不仅对 pH 的变化 有缓 冲作用 ，而 且有利 于模板 退火 和引物 的 K离子 ，以及含有能够激活 DNA 聚合酶的 MgZ+离子 ，还有 DNA聚合酶 的稳定剂 等。所以缓 冲液 中通 常会 含 有MgClz、Tris·HC1(pH 8．4，室温 )、KCI、明 胶 等。Mg 离子对 Taq酶的活性以及专一性都具有一定 的影 响，Mg2+离子浓度过高 时，Taq酶专一性降低 而活性会加强 ，所 以当 Mg2+离子 的浓度过高 ，会导致非 特异性扩增产物积累，而当 Mg 离子 的浓度过 低 ，会 导至扩增 量降低 。MgCIz最佳 浓度一 般为1．5mmol／mL左右 。 结语 近几年来 ，众多学者对 PCR技术进行 r研究与改进 ，经过他们不断 的探索与创新，PCR技术有 了进一步 的发展 与完善 ，并且已经派生出反转 录 PCR、原位 PCR、荧光 PCR、单细胞 PCR等各式各样 的新型 的 PCR技术 ，并且这些 PCR技 术进行相互融合 ，继 而为分子生物学领域的研究 的深入开展 提供了高质 量的技术 方面 的保 障 ，为公共卫生事业提供了快捷、方便 、灵 敏的检测手段 ，为生命科学的研究 及发展打 开了一扇扇崭新的大门。 原文地址： PCR问题及提高PCR扩增特异性的方法总结 相关阅读： 逆转录PCR PCR引物及其设计原则

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[转载]Taq酶对PCR定量检测结果的影响

a2381889653 2018-7-13 09:57

摘要 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个 DNA 分子扩增 107～108 倍，大大提高了 DNA 的得率。在 PCR 反应过程中，Taq 酶对 PCR 定量检测结果起到很大的影响。本文重点探讨 Taq 酶对 PCR 定量检测结果的影响。 P C R 的发展可以说起源于 D N A 合成酶的发现。DNA合成酶最早于1955年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶极易被热所破坏，因此不符合一连串的高温连锁反应所需。从基因修复复制 (DNA repair replication) 得到启发，Dr. Kjell Kleppe于1971年首次发表了第一篇 PCR 反应的实验论文，提出了 PCR 的原始雏形概念。但由于当时受所使用的DNA合成酶的对热不稳定性限制，只能进行类似PCR前两个周期反应的单纯且少量的基因复制 。1976年从热泉 Hot spring中的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来Taq polymerase是现今所使用的酶的雏形 ，它的耐高温的特性符合 PCR 的反应要求，但其应用于 PCR 技术直至 PCR 技术理论的成型又在其后进行了多年的探讨 。1985 年，Dr. Kary B. Mullis经多年的研究论证并与 Saiki 等人发表了 PCR 技术应用的论文。此后，PCR 技术的发展日趋完善，应用的范畴日趋扩展。直至 1995 年由美国 PE 公司首先研制成功了荧光定量 P C R （也称 T a q M a n PCR,以下简称 FQ-PCR）检测仪，它融汇了 PCR 的灵敏性、D N A 杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，并能做到电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探测 PCR过程中的变化以获得定量的结果，实现了完全闭管操作。 聚合酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction）是利用 DNA 片段两端的两个短的单链引物，应用热稳定的聚合酶，通过双链 DNA 模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，在体外对特定核苷酸片断进行指数级扩增的技术。早期的PCR 技术在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过光密度扫描来进行半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是 PCR 终产物。此时的定量 PCR 技术的难点主要在于： 1）如何确定 PCR 正处于线性扩增范围内。因为只有在此范围内 PCR 产物信号才与初始模板的拷贝数成比例。 2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。因为在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的 cDNA 或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整，在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。 FQ-PCR 即在普通的 PCR 反应中加入荧光修饰的探针，探针标记除用 TET 和 FAM 外，还可用 HEX、JOE作为报告荧光，3′端的淬灭基团常用 TAMRA。在探针保持完整时，荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭，而在探针被切断后，荧光报告基团才发出报告荧光，且荧光的强度与 PCR 产物的数量呈正比。随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到一个荧光信号的波长和长度变化。这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，实时得到一条荧光扩增曲线（参见图1，使用北京英贤仪器有限公司实时荧光定量 PCR 分析仪INCE-8000），因此也称之为 Real-time-PCR（RT-PCR）。RT-PCR 的应用范围很广泛，包括 mRNA 表达的研究、DNA 拷贝数的检测、单核苷酸多态性（SNPs）的测定等。 PCR 本身虽然是一个单纯的实验技术，即 PCR 反应中各种成份在变性、退火、延伸的温度循环中，对 DNA 模板进行指数级扩增。因此，变性、退火、延伸的温度高低及时间长短，反应中的各种成分( T a q . Polymerase, primers, dNTPs, MgCl2 )的浓度及纯度、性能都影响着 PCR 增幅的效果。 为了明确 Taq 酶的不同对反应结果的影响，我们使用北京英贤仪器有限公司实时荧光定量PCR分析仪INCE-8000，进行了如下试验：温度循环为 95 — 60° C二步法，时间设定相同，反应组成（DNA模板，Primer，TaqMan-Probe，dNTP，MgCl2）及终浓度相同，只是分别使用了不同厂家的Taq酶及其相应的反应缓冲液，反应结果参考图 2、3 及表 1、2。 此结果表明不同的Taq酶导致反应结果的灵敏度会产生明显差异，因此对基因表达偏低的样本进行定量检测时，有必要选择使用扩增效率高的 Taq 酶，从而提高 PCR 扩增反应的阳性率。 我们知道不同 PCR 系统的检测极限也不相同：有灵敏度可达一个拷贝的；也有灵敏度只可达1000个拷贝的；还有更低的。但利用同一PCR 检测系统，对PCR反应结果的影响因素就以 Taq 酶为关键。 Taq 酶在 PCR 反应中所起的作用是利用其 3′→ 5′聚合酶活性以 DNA 为模板，将 dNTP 中的脱氧单核苷酸逐个加到 3-OH 末端；同时利用其 5′→ 3′外切酶活性即能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关，又可以从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。由此在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。 Taq酶由水栖高温菌（Thermus aquatics）YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为70～75，有实验表明 Taq 酶活性在热启动以后的半衰期为：97时 20 分钟、95时 40 分钟、94时 60 分钟、92时 90 分钟。半衰期后 PCR 扩增效率迅速降低为接近零。 发展至今 T a q 酶已可用基因重组的方法生产，Cetus公司生产的商品名为Ampli Taq，其完整基因长2499bp，在大肠杆菌中表达生产，含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌 DNA 聚合酶有 38% 是一致的，包括对 dNTP 结合，引物与模板作用区均存在于 Taq 酶中。 第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段则是Cetus公司的Stoffel将Taq DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段（N端289个氨基酸）去除，称为stoffel片段。其97.5的半衰期从 Taq DNA 聚合酶的 5～6min 提高到20min，同时该酶片段也对两个或更多模板位点的扩增反应即复合 PCR（Multiplex PCR）更为有利。 VentTM DNA多聚酶：是美国New England Biolabs 公司从潜水艇排气孔（Vent）中分离的超级嗜热菌-能生长于98中的Thermococcus litoralis中分离纯化得到的，故名 Vent酶。它的一些酶学性质较 Taq DNA聚合酶更为优越，它能耐100高温且2h以上仍有活力，并且具有 3’→ 5’外切酶活性的校正能力，错误扩增的机率比 Taq 酶降低一倍。 近年，经过基因改造的Hot Start Taq DNA聚合酶，因其低温时酶没有活性，94-95加热后开始反应，从而抑制了低温条件下的非特异性扩增，大大提高了PCR反应的特异性，同时Hot Start Taq DNA 聚合酶能为 PCR 反应提供更高的产量及灵敏度、特异性，已逐渐成为 PCR 技术的主流。 Taq 酶的种类繁多，有稳定性好的，有特异性强的，有保真性好的，有错配率低的，有扩增效率高的等等，因此要根据实验目的的要求有选择性的使用 Taq 酶是实验成功的关键。 参考文献 Chien A, Edgar DB,Trela JM. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 1976;127:1550-7 Saiki RK, et al. Enzymatic amplification of beta-globulin ge-nomic sequences and restriction site analysis for the diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985;230:1350-4

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[转载]PCR技术之DNA聚合酶

a2381889653 2018-7-13 09:55

TaqDNA聚合酶 在早期进行的PCR反应中，使用的是大肠杆菌DNA聚合酶1的大片段，，即Klenow片段。也曾有人用噬菌体T4 DNA聚合酶。这两种酶的共同弱点是对热不稳定性，DNA合成反应只能在370C进行。PCR时每一循环的解链温度都在90C以上进行，故在每两个循环之间要加入新的DNA聚合酶，使得整过程整个实验过程很繁琐和昂贵。同时在370C，引物与DNA模板之间会发生分子非特异性结合，最终导致很多非特异性DNA片段的扩增。 Taq 酶有耐高温的特性，其最适的活性温度是720C（75-80），连续保温30分钟仍具有相当的活性，而且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力，一次加酶即可满足PCR操作过程自动化的实现。 TaqDNA聚合酶的热稳定性及最适延伸温度 相对分子质量为94000的TaqDNA聚合酶的酶活性较高，大约为200000Umg，在合成时有一个较高的最适温度75-80C，转换数Kcat接近150nt/(s•酶分子)。这种活性有明显的温度依赖性。TaqDNA聚合酶虽然在90C以上合成DNA的能力有限，但高温时仍比较稳定。有人试验证明在92.5C,95C,和97.5C时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130分钟、40分钟和5-6分钟后仍可保持50%左右的活性，其半衰期较长。所以，在一个PCR预备试验中，每次循环时上限温度为95C（试管内）处理20秒，则循环50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能够保证实验的需要。 TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最适延伸温度在75-80C时，dNTP的掺入速度为35-100nt/(•酶分子),最长延伸长度7。6kb，如对M13上的富含GC的30-me引物，该酶在70C的延伸率高于60nt/(•酶分子), 在55C仍有较高的延伸活性，22C和37C时延伸速度分别为0。25和1。5 nt/(•酶分子)。由此可见，在低温下，TaqDNA聚合酶一表现活性明显降低，因而，导致此酶在模板链分子内局部二级结构区域的延伸能力受损或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。在很高的温度（90C以上）时，很少DNA合成。在体外条件下，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链的双链结构稳定性的限制。温度对TaqDNA聚合酶活性的影响见表。 由于TaqDNA聚合酶的最适延伸温度高达75-80C，故退火和延伸反应温度均可提高，限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR的特异性。 如何选择DNA聚合酶？ 在选择之前，先了解一下DNA聚合酶的四个重要特点：热稳定性，保真度，扩增速度及特异性。 l 热稳定性 热稳定性是指DNA聚合酶能够耐受高温的能力。不同的DNA聚合酶的热稳定性差异较大，一般通过半衰期来体现。 l 保真度 保真度是指DNA聚合酶精确复制DNA模板的能力。部分DNA聚合酶具有3’-5’的核酸外切酶活性，能够校正错误碱基。保真度的高低可通过错配率来体现。 l 扩增速度 扩增速度是指在延伸时，DNA聚合酶向DNA新链中掺入核苷酸的速率。扩增速度除与DNA聚合酶有关，还会受到延伸温度，缓冲液及模板复杂程度等的影响。 l 特异性 特异性是指DNA聚合酶在PCR过程中只扩增目的片段的能力。为了提高PCR特异性，常通过抗体法或配体法等方式对DNA聚合酶进行修饰，使酶活性在低温条件下封闭，减少非特异性延伸和扩增。 常见的DNA聚合酶 1）Taq DNA聚合酶（应用：常规PCR。） Taq DNA聚合酶来源于Thermus aquaticus，热稳定性高，在PCR循环高温条件下仍可保持较高的酶活。Taq DNA聚合酶具有良好的行进性，扩增效率高，扩增速度为30-60 sec/kb。但该酶无3’→5’核酸外切酶活性，即无校正功能，易产生错配碱基。使用该酶扩增得到的PCR产物3’末端带A，可直接用于TA克隆。 2）高保真DNA聚合酶（应用：高保真PCR，如基因克隆、点突变、测序及SNP分析等。） 高保真DNA聚合酶是一类具有3’→5’核酸外切酶活性的酶，具有校正功能，扩增产物为平末端。当实验对保真度要求较高时，需选择此类酶。常见的高保真酶有Pfu、KOD、Phusion、Canace等。不同的高保真酶在保真度，扩增速度，扩增效率等方面有所差异。一代的高保真酶的保真度较低，扩增速度较慢，如Pfu，KOD等。 3）热启动DNA聚合酶（应用：低拷贝基因扩增。） 热启动DNA聚合酶是一类提高PCR产物特异性的酶。该类酶是通过抗体法或配体法等方式对DNA聚合酶进行修饰而成，使得DNA聚合酶活性在预变性温度下才被激活。 4）Taq Plus DNA聚合酶（ 应用：快速、常规PCR。） Taq Plus DNA聚合酶是由Taq DNA聚合酶和具有3’→5’核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶按比例混合而成，具有扩增效率高和错配率低的优良性能，其扩增速度为30 sec/kb，错配率是Taq DNA聚合酶的1/6。使用该酶扩增得到的PCR产物3’末端带A，可直接用于TA克隆。 5）Long Taq DNA聚合酶（应用：长片段PCR。） Long Taq DNA聚合酶也是Taq 酶与高保真酶按比例混合而成的酶，配上优化的缓冲体系可使得该酶可扩增长达8 kb的人基因组DNA片段和10 kb的质粒模板。其PCR产物3’末端带A，可直接用于TA克隆。 6）直接扩增DNA聚合酶（应用：转基因型鉴定，基因分型） 直接扩增DNA聚合酶是指可以直接以样本裂解产物或未纯化的基因组DNA为模板进行扩增的酶。该类酶具有很强的PCR反应抑制物耐受性。

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[转载]PCR引物设计

a2381889653 2018-7-13 09:52

张新宇，朱有康，高燕宁 （中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021） 摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。在PCR引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“PremierPrimer5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo6”软件。 关键词 ： PCR ； 引物设计 自从 1985 年 Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一 ，而引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。 现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行 PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。 1.引物设计的原则 引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即错配)。 具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性 (internal stability, 用 G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点： 1.引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应 。 2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物 3’端出现 3 个以上的连续碱基，如 GGG 或 CCC，也会使错误引发机率增加 。 3.引物 3’端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基，因此应当避免在引物的 3’端使用碱基 A 。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR 反应失败。5’端序列对 PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物 。 4.引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大 。 5.引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式 Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在 Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。 6.G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3’端 G 值较低（绝对值不超过 9），而 5’端和中间 G 值相对较高的引物。引物的 3’端的 G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应 。 7.引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行 。 8.对引物的修饰一般是在 5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的 PCR 因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 2.0 引物的自动搜索和评价分析 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以 “Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。 要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。 2.1Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 2.1.1 功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计()、限制性内切酶位点分析()和 DNA 基元(motif)查找()。“Premier”还具有同源性分析功能（），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（）、语音提示键盘输入（）等等。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到 DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的 18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推 DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换 DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。 2.1.2 使用步骤及技巧 “Premier”软件启动界面如下： 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。进行引物设计时，点击 按钮，界面如下： 进一步点击 按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或 Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（SearchRanges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按 ，随之出现的 Search Progress 窗口中显示 Search Completed 时，再按 ，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（ Sense ），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为 100，即各指标基本都能达标（如下图）。 点击其中一对引物，如第 1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier” 主窗口，如图所示： 该图分三部分，最上面是图示 PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由 变成 ，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 ，只有 。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。 在需要对引物进行修饰编辑时，如在 5’端加入酶切位点，可点击 ，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击 按钮。 如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至 DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。 总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是一个相当不错的软件。 2.2 Oligo 6.22 使用技巧简介 2.2.1 功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和 G 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图，加了个 Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 2.2.2 使用（以 Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指标分别为 Tm、 G 和 Frq，其中 Frq 是 6.22 版本的新功能，为邻近 6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的 cascade 排列方式不太方便，可从 windows 菜单改为 tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如 Frq，这样界面的结构同于 Oligo 5.0，只是显示更清楚了。 经过 Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击 Tm 图块上左下角的 Upper 按钮 ，选好上游引物，此时该按钮变成 ，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成 Lower。G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的 G 值在 5’端和中间值比较高，而在 3’端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取 72附近为佳，5’到 3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用 3’端 Frq 值相对较低的片段。 当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是 3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性 PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过 4.5 为好。当然，在设计克隆目的的 PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种 PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为 GC 含量，以 45-55％为宜。有一些模板本身的 GC 含量偏低或偏高，导致引物的 GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果 PCR 的模板不是基因组 DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行 False priming site 的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发 PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的 PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过 100 为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为 450 以上，而在错误位点的引发效率为 130，那么这对引物也是可以接受的。 当我们结束以上四项检测，按 Alt+P 键弹出 PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。 除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由 Whitehead Institute 开发的“Primer 3”等（本网站 http://210.72.11.60 已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该软件的独特之处在于，对全基因组 PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组 PCR 的用户试用。 参考文献（References）： H.A.艾得希主编,田丁等译.PCR技术——DNA扩增的原理与应用.北京:北京医科大学中国协 和医科大学联合出版社,1991. 林万明著.PCR技术操作与应用指南.北京:人民军医出版社,1993. 朱平主编.PCR基因扩增实验操作手册.北京:中国科学技术出版社,1992 郑仲承.寡核苷酸的优化设计，生命的化学,2001,21(3):254-256. GeorgeH.KellerMarkM.Manak.DNAprobes.1992. Oligo软件帮助文件(Oligo.HLP). Martin,F.H.,Castro,M.M.,andTinoco,Jr.I.Basepairinginvolvingdeoxyinisine,implicationsfor probedesign.NucleicAcidsRes,1985,13:8927-8938. Rychlik,W.andRhoads,R.E.Acomputerprogramforchoosingoptimaloligonucleotidesforfilterhybridization,sequencingandinvitroamplificationofDNA.NucleicAcidsRes,1989,17:8543-8551. 扩展阅读： PCR发展历史（乱搜集的） PCR、QPCR常见问题（转载） 聚合酶链式反应（PCR）的应用

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斑马鱼-基因型-鉴定：基因组粗提-PCR-电泳（-测序）

HantsingWang 2018-6-9 18:04

Last Updated 20/03/2018 by Hantsing Wang 器材：纸杯，剪刀，烧杯 一、麻醉剪鱼尾鳍： 从系统中取出需要鉴定的鱼，烧杯中加入 Tricaine （ Tricaine 麻醉剂用量， 5g/L 存储 , 约 1:20 稀释， 200-300mg/L 麻醉用。），将鱼置于烧杯中至昏迷，纸杯中加系统水，减去 2/3 尾鳍，剪一次洗一次酒精擦一下，尾鳍置于已经编号的 tube （ 1.5ml 管）中，鱼放入对应编号的纸杯。 二、 DNA 提取： ① tube 中加入 150ul ， 50mM NaOH 溶液（要测 pH 看是否为碱性，用 2MNaOH 配制），离心使鱼尾在管底，在 95 ℃金属浴中加热 40-60min 左右（至组织完全消解，溶液呈黄色），每 20-30min 震荡一次； ②将 tube 置于 4 ℃冰箱冷却 1-2min ，在加入（ 1/10 体积） 15ul 的 1M Tris-HCl ， pH7.5 中和； ③在 4 ℃， 12000rpm 离心 15min ，将上清液移到另一管中，做好标记（若不进行鉴定，可在 -20 ℃贮存）； 三、 PCR 扩增： （ 25ul 体系）（加液从大到小） Taq DNA polymerase ：（溶解在甘油里，每管分开了加，效果好） ① rTaq 0.2ul(buffer 含 Mg2+ ，若无，需要加 Mg2+ ， 2ul)(5U/ul) ② EX-Taq 0.2ul 酶活力大小有 2 个单位， kat 和 U 。 1min 内能转化 1 umol 底物的酶量称为 1 酶单位（ U ）， 1s 内能转化 1mol 底物的酶量为 1 katal （简称 kat ）。它们的换算如下： 1 kat=6*10^7 U ， 1U=16.67n kat 。 PCR 反应： ①充分变性（ 93 ℃ -95 ℃， 4min ） ②循环条件：（ 30-40 cycles ） 变性（ 93 ℃ -95 ℃， 30s ） 退火（ 55℃-65℃ ， 30s ，温度根据引物设计调整） 延伸（ 72 ℃，根据引物设计产物长度） ③充分延伸（ 72 ℃， 15min ） ④ 4 ℃保存 转基因鱼， GFP 的编码序列是 700 多 bp ，编码一个 238 个氨基酸的蛋白。蛋白质分子量 26.9KDa ，（ 1kDa=1000 摩尔质量）。 GFP 之所以能产生绿色荧光是由于其蛋白分子多肽链内含有特殊的生色团结构 , 即第 65-67 位氨基酸 Ser- Tyr- Gly 链内环化加氧形成对羟苯甲基咪唑环酮 , 和周围其它三个氨基酸形成六肽生色团。 四、琼脂糖（ agarose ）凝胶电泳 琼脂糖具有亲水性，不带电， DNA 在碱性环境下带负电， EB 可镶入 DNA 分碱基中形成荧光络合物， DNA 分子片段长度，构型不同，泳动速率不同，紫外光照射下形成不同区带。 ①闭环（超螺旋）②开环③线形的螺旋率依次降低。在琼脂糖电泳的前后顺序是： ①闭环（超螺旋） ③线形 ②开环。开环质粒是指双链环状的质粒 DNA 有部分解链，因此电泳速度最慢。 判断质粒质粒好坏的一个指标就是 超螺旋质粒在所以质粒中的含量。 溴化乙锭（ EB ）（冷却至 60 ℃左右），终浓度为 0.5ug/ml （ EB 储液， 4 ℃保存，一般是配成浓度为 10mg/ml ） 10 3 ul=1ml ， 1g=10 3 mg=10 6 ug=10 9 ng=10 12 pg 小胶： 0.3g 琼脂糖 + 30ml TAE + 1.5ul EB 大胶： 0.5g 琼脂糖 + 50ml TAE + 2.5ul EB （琼脂糖： TAE ： EB = 1g ： 100ml ： 5ul ） 室温下 30~45 分钟后凝胶完全凝结，小心拔梳子。 小孔胶 5ul Marker ，大胶大孔加 10ul Marker ，易扩散，最后加 Marker 0.1ul Loading Buffer （载样缓冲液） + 1ul DNA 样品，混匀后 1.1ul DNA 样品： Loading Buffer=10ul:1ul 混匀，小孔最多 10ul ；中孔 25ul ；大孔 50ul 。 跑胶使用 std 模式，电压恒定在 100V 左右，样品跑过 1/2 ，不超过 2/3 停止。 研究院在四楼成像。 电泳： 1% 琼脂糖凝胶，一般 90-110V 电压，电泳 20 ～ 40min 即可。 备注： 一、配制缓冲液 1.Tris- 硼酸（ TBE ） (Tris-Borate-EDTA) 使用液浓度： 0.5 ×： 0.0 25mol/L Tris- 硼酸 0.001mol/L EDTA 储存液配制： 5 ×：① 54g Tris 碱 ② 27.5g 硼酸 ③ 20ml 0.5mol/L EDTA （ pH=8.0 ， 4 .65g Na 4 EDTA ，分子式： C10H12N2O8Na4 ），采用 ddH2O 溶解混匀， pH 是 8.3 ，不需要调整，溶液体积 1L 。 2.Tris- 乙酸（ TAE ） (Tris-Acetate-EDTA) 【由三羟甲基氨基甲烷 (Tris base) 、乙酸 (acetic acid) 、乙二胺四乙酸 (EDTA) 组成缓冲液】 使用液浓度： 1 ×： 0.04mol/L Tris- 乙酸 0.001mol/L EDTA 储存液配制： 50 ×：① 242g Tris 碱 ② 57.1ml 冰乙酸 ③ 100ml 0.5mol/L EDTA （ pH=8.0 ）， 采用 ddH2O 溶解混匀， NaOH 调 pH 至 8. 5 ，溶液体积 1L 。 二、使用方法： 如果要将 50 ×母液稀释成 2000ml 工作液，需要取 40ml 母液，加入 1960ml 水混匀即可， 2000ml 终体积除以 40ml 体积母液就是 50 倍。 Tris- 磷酸（ TPE ）： 浓贮存液（每升）： 10 ×：① 108g Tris 碱 ② 15.5ml 85 ％磷酸（ 1.679g /ml ） ③ 40ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) 使用时再稀释 10 倍。 TAE 与 TBE 緩冲溶液的成份： 50xTAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA) 242 g ----------- Tris base 57.1 ml ----------- Acetic acid 100ml ------------ 0.5M EDTA Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5. 10xTBEBuffer (Tris-Borate-EDTA) 108 g--------------- Tris base 55 g --------------- Boric acid 9.3 g --------------- Na4EDTA Add ddH2O to 1 liter. The pH is 8.3 and requires no adjustment. 它们的区別有下列几点： 1. TBE 不能太浓 ( 它只可有 10 times （倍） ) ，因為 borate 会很容易沉淀，但一般有少许沉淀是不会有太大问題。 2. TBE 的 缓冲能力 ( buffering capacity ) 比 TAE 高，用 TBE 来跑出來的 胶 ( gel ) ，分辨率 (resolution) 会比較高。 3. 因为 TBE 有 borate 离子 (ion) ，它会影响酶 (enzyme) 的工作。因此，若要为分离出的 DNA 进行下一步酶处理，如克隆、限制性酶切 ( cloning / restriction cut ) 的话，就要切记不要让 DNA 碰上 borate ion 。 4. TAB 的 缓冲能力 ( buffer capacity ) 比较差， gel 一般比較模糊，但它不会对影响酶的工作。 TE 溶液中含有 Tris 碱（ base ）、 EDTA 。 TE 溶液加入硼酸（ borate ）成为 TBE ，加入乙酸（ acetate ）成为 TAE Tris 全名是 Tris Base, tris(hydroxymethyl)amino - methane 三羟甲基氨基甲烷； 2- 氨基 -2- （羟甲基） -1,3- 丙二醇

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TE煮沸法快速获得可扩增DNA

mashengwei 2017-12-1 09:20

非常感谢何老师的分享 。 近期sci-hub.cc不能访问了，大家可以试试下面的两个网址： 1、 https://scihub22266oqcxt.onion.link 2、 https://sci-hub.bz TE 煮沸法快速获得可扩增 DNA 何华纲 近日盟主推送了“史上最快核酸提取方法，30秒内完成”，这里跟大家分享一下我们实验室使用的民间版DNA提取方法，发表论文时（ Genetic,Physical and Comparative Mapping of the Powdery Mildew Resistance Gene Pm21 Originating from Dasypyrum villosum . Front. Plant Sci. 2017, doi:10.3389/fpls.2017.01914. ）也没有好好考虑命名，为了交流方便，不妨叫作“TE煮沸法”，具体如下： 1 、剪取 1 厘米左右叶片放入 1.5ml 离心管，玻璃棒手工研磨数下可至匀浆。 2 、加入 150 微升 TE （成分及浓度见原文）， 90 度煮 10 分钟，释放 DNA ，同时灭活各类核酸酶。 3 、 10000rpm 离心 1 分钟，可避免颗粒物对 PCR 的干扰，提高PCR稳定性；离心后无需倒管，直接取上清液作为 PCR 模板。 4 、 PCR扩增时 ，根据提取液中 EDTA 的用量及模板用量，按比例增加 Mg 离子，消除 EDTA 对 Taq 酶活性的影响。 全过程花费时间：平均每个样品的处理时间差不多就是剪叶片编号所花时间。 在对簇毛麦Pm21进行遗传作图时，面临了着这样一个问题：Pm21所在染色体区域存在严重的交换抑制（大约1/20染色体片段的总遗传距离仅0.3cM）。想用一个超大的群体来解决，但小作坊里人手紧缺。问过公司，报价不低，于是狠下心来自己摸索DNA提取方法。刚开始，想用一个相对简单的方法来提取质量较好的DNA，但是方法再简单，有些步骤总不能少的，要过上万单株的群体，恐怕还是要得抑郁症。痛定思痛，改变观念，放低要求，不讲质量，只要释放出“可扩增DNA”就行，这样就有了“TE煮沸法”，完成了Pm21的精细定位。文中Figure2的多重PCR就是用这个方法做出来的。 “TE煮沸法”，除了高浓度的TE，不使用其他试剂，避免了试剂因素对后续PCR的干扰，至于提取液中过多的EDTA，在PCR体系里按比例多加Mg2+就可以了。整个提取过程是一管式的，无需倒管，减少了人工出错环节。获得的DNA粗提液相当稳定，在4度放置几个月后PCR照扩不误。“TE煮沸法”也同样适合于小麦、大麦、玉米、水稻等单子叶植物和拟南芥、油菜、番茄等双子叶植物。 “TE煮沸法”操作简单、快速，但主要还是基于人工磨样，后续或可结合磨样机实现自动化操作。此外，由于DNA完整性可能比较差（ 直接电泳是看不出条带 的），做做分子标记没什么问题，但要用来克隆基因，还需慎重。 有需要的实验室可以试一试，同时也欢迎大家分享自己的学习和实验等的心得体会。想法不怕不成熟，就怕没想法。 欢迎关注“ 小麦生信联盟 ”，了解小麦新进展

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全球最高引100篇文章系统分析(1亿篇文章筛选出来，总共分7档）

热度 5 sibscas 2017-11-26 13:31

iNature ：对于全球最高引的前100篇文章，篇均引用量是 34834.92 次；这100篇文章主要聚集在 生物化学及分子生物学领域；这100篇文章中， 发表在PHYSICAL REVIEW B杂志及JBC杂志都是发表了7篇文章；对于这100篇文章，产出率最高的机构是加州大学；总的来说，这100篇文章主要是聚集在基础研究， 如蛋白质的定量，蛋白质的分析，实时定量PCR技术，BLAST的诞生，DNA测序，同源序列比对等方面。 iNature编辑组的统计时间是2017年11月26日。 1 引用量最高的10000篇文章分析 我们以Web of Science为基础，通过相关的检索，从1874-2018年，总共检索到 120611782条记录（ 图.1 ）。 图.1 总文章数 我们对于所有的文章进行了分类归档，发现引用次数大于10万次，为第一档，有3篇文章；第二档的引用量是5-10万次，有9篇文章；第三档的引用量是1-5万次，有238篇文章；第四档的引用量是5000-1万次，有748篇文章；第五档的引用量是1000-5000次，有22994篇文章；第六档的引用量是500-1000次，有68509篇文章； 第七档的引用量是小于500次，有120519371篇文章 （ 图.2 ） 。 文章分档 引用次数 文章数 累加文章数 I 10万 3 II 5-10万 9 12 III 1-5万 238 250 IV 5000-1万 748 998 V 1000-5000 22994 23902 VI 500-1000 68509 92411 VII 500 120519371 120611782 图.2 所有文章的归档分类 之后我们根据引用量从高到底，进行排序，我们筛选了10000条记录（因为Web of Science最多只能一次分析10000条记录），进行相应的统计分析。 我们发现每篇文章的平均引用次数是3173.14次，总引用次数是31731393次，施引文献是14692585 （ 图.3 ） 。另外，我们发现，最高引用文章大部分都聚集在1990-2010年之间，达到了40%以上。 图.3 10000篇文章引用分析 之后，我们看了一下不同时间段，对于这些文章的引用次数分析，发现绝大部分引用都是聚集在1990-2016年之间（ 图.4 ）。 图.4 10000篇文章不同时间段引用分析  由于分析10000篇文章，工作量太大，我们就直接分析前100篇文章，发现前100篇文章的平均引用量是34834.92次，总引用次数是3483492次，施引文献达到2627346篇。这100篇文章，占前10000篇的总引用的10.98%，但是总文章数是1.00%，故我们主要分析这100篇文章 （ 图.5 ） 。 图.5 100篇文章引用分析 2 引用量最高的100篇文章分析 对于这100文章发表的时间进行分析，我们发现在1950年以前只有4篇，1950-1960年之间，有10篇；1961-1970年，有9篇；1971-2010年，总共有74篇，占了绝大部分；2010年以后，只有3篇文章（ 图.6 ），这三篇文章分别是遗传进化（ MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods，2011年），癌症综述（ Hallmarks of Cancer: The Next Generation，2011年 ），全球癌症统计（ Global Cancer Statistics，2011年 ） 。 图.6 100篇文章发表时间分析 其次我们对这100篇文章的种类进行了基本分析，发现生物化学及分子生物学方面有35篇，物理学有15篇，化学有14篇，数学11篇 （ 图.7 ） 。 图.7 100篇文章方向分析 我们再次对这100篇文章发表的杂志进行分析（3篇），发表在PHYSICAL REVIEW B杂志及JBC杂志都是7篇文章；ANALYTICAL BIOCHEMISTRY，JOURNAL OF CHEMICAL PHYSICS，NATURE，NUCLEIC ACIDS RESEARCH都是发表了4篇文章，总的来说，这高引用的100篇文章，大部分都是生物，物理，生物化学及化学方面的文章。另外这9个杂志占了39篇文章 （ 图.8 ） 。 图.8 100篇文章杂志分析 我们再次统计了国家，发现美国有44篇，占了绝大部分，其次是英国，达到9篇；德国有6篇，很遗憾，没有发现有中国参与的文章 （ 图.9 ） 。 图.9 100篇文章国家分布 我们对研究机构统计了一下，发现加州大学系统占的比例最大，达到了7篇，其次是宾夕法尼亚州立大学，达到了4篇 （ 图.10 ） 。 图.10 100篇文章的大学或研究所分析 3 引用量最高的100篇文章列表 对于这100篇文章，主要是技术的变革及基础研究，如蛋白质的定量，蛋白质的分析，实时定量PCR技术，BLAST的诞生，DNA测序，同源序列比对等，这些东西都是非常的基础，故这也注定了它们的高引用量 （ 图.11 ） 。 标题 总引用次数 年均引用 1 PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT 335844 5012.6 2 CLEAVAGE OF STRUCTURAL PROTEINS DURING ASSEMBLY OF HEAD OF BACTERIOPHAGE-T4 244785 5099.69 3 RAPID AND SENSITIVE METHOD FOR QUANTITATION OF MICROGRAM QUANTITIES OF PROTEIN UTILIZING PRINCIPLE OF PROTEIN-DYE BINDING 201313 4793.17 4 DNA SEQUENCING WITH CHAIN-TERMINATING INHIBITORS 66790 1629.02 5 DENSITY-FUNCTIONAL THERMOCHEMISTRY .3. THE ROLE OF EXACT EXCHANGE 65244 2609.76 6 Generalized gradient approximation made simple 63484 2885.64 7 SINGLE-STEP METHOD OF RNA ISOLATION BY ACID GUANIDINIUM THIOCYANATE PHENOL CHLOROFORM EXTRACTION 63161 2037.45 8 DEVELOPMENT OF THE COLLE-SALVETTI CORRELATION-ENERGY FORMULA INTO A FUNCTIONAL OF THE ELECTRON-DENSITY 61406 2046.87 9 A short history of SHELX 58640 5864 10 Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(T)(-Delta Delta C) method 58159 3421.12 11 ELECTROPHORETIC TRANSFER OF PROTEINS FROM POLYACRYLAMIDE GELS TO NITROCELLULOSE SHEETS - PROCEDURE AND SOME APPLICATIONS 55121 1413.36 12 A SIMPLE METHOD FOR THE ISOLATION AND PURIFICATION OF TOTAL LIPIDES FROM ANIMAL TISSUES 51444 843.34 13 BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL 49116 1754.14 14 CLUSTAL-W - IMPROVING THE SENSITIVITY OF PROGRESSIVE MULTIPLE SEQUENCE ALIGNMENT THROUGH SEQUENCE WEIGHTING, POSITION-SPECIFIC GAP PENALTIES AND WEIGHT MATRIX CHOICE 47444 1976.83 15 Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs 45557 2169.38 16 NONPARAMETRIC-ESTIMATION FROM INCOMPLETE OBSERVATIONS 44604 743.4 17 MINI-MENTAL STATE - PRACTICAL METHOD FOR GRADING COGNITIVE STATE OF PATIENTS FOR CLINICIAN 43637 1014.81 18 A REVISED MEDIUM FOR RAPID GROWTH AND BIO ASSAYS WITH TOBACCO TISSUE CULTURES 41340 738.21 19 THE NEIGHBOR-JOINING METHOD - A NEW METHOD FOR RECONSTRUCTING PHYLOGENETIC TREES 38735 1249.52 20 A RAPID METHOD OF TOTAL LIPID EXTRACTION AND PURIFICATION 37927 642.83 21 REVISED EFFECTIVE IONIC-RADII AND SYSTEMATIC STUDIES OF INTERATOMIC DISTANCES IN HALIDES AND CHALCOGENIDES 37143 884.36 22 DENSITY-FUNCTIONAL EXCHANGE-ENERGY APPROXIMATION WITH CORRECT ASYMPTOTIC-BEHAVIOR 34065 1135.5 23 SELF-CONSISTENT EQUATIONS INCLUDING EXCHANGE AND CORRELATION EFFECTS 33872 639.09 24 Efficient iterative schemes for ab initio total-energy calculations using a plane-wave basis set 33658 1529.91 25 The moderator-mediator variable distinction in social psychological research: conceptual, strategic, and statistical considerations. 33191 1037.22 26 Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode 32667 1555.57 27 The status, quality, and expansion of the NIH full-length cDNA project: The Mammalian Gene Collection (MGC) 32391 2313.64 28 DETECTION OF SPECIFIC SEQUENCES AMONG DNA FRAGMENTS SEPARATED BY GEL-ELECTROPHORESIS 32239 749.74 29 REGRESSION MODELS AND LIFE-TABLES 32022 696.13 30 COLORIMETRIC METHOD FOR DETERMINATION OF SUGARS AND RELATED SUBSTANCES 31882 514.23 31 RAPID COLORIMETRIC ASSAY FOR CELLULAR GROWTH AND SURVIVAL - APPLICATION TO PROLIFERATION AND CYTO-TOXICITY ASSAYS 31292 894.06 32 The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools 30770 1465.24 33 HELICAL MICROTUBULES OF GRAPHITIC CARBON 30386 1125.41 34 STATISTICAL METHODS FOR ASSESSING AGREEMENT BETWEEN TWO METHODS OF CLINICAL MEASUREMENT 29847 932.72 35 FUZZY SETS 29740 561.13 36 CONTROLLING THE FALSE DISCOVERY RATE - A PRACTICAL AND POWERFUL APPROACH TO MULTIPLE TESTING 29691 1290.91 37 Electric field effect in atomically thin carbon films 28520 2037.14 38 INHOMOGENEOUS ELECTRON GAS 27972 518 39 CONFIDENCE-LIMITS ON PHYLOGENIES - AN APPROACH USING THE BOOTSTRAP 27721 840.03 40 SPECIAL POINTS FOR BRILLOUIN-ZONE INTEGRATIONS 27045 643.93 41 MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods 26581 3797.29 42 USE OF LEAD CITRATE AT HIGH PH AS AN ELECTRON-OPAQUE STAIN IN ELECTRON MICROSCOPY 25405 461.91 43 From ultrasoft pseudopotentials to the projector augmented-wave method 25057 1318.79 44 MEASUREMENT OF OBSERVER AGREEMENT FOR CATEGORICAL DATA 25005 609.88 45 PROJECTOR AUGMENTED-WAVE METHOD 24314 1013.08 46 MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 24066 2187.82 47 RELIABILITY OF MOLECULAR WEIGHT DETERMINATIONS BY DODECYL SULFATE-POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS 23835 486.43 48 THE ATTRACTIONS OF PROTEINS FOR SMALL MOLECULES AND IONS 23763 344.39 49 ISOLATION OF BIOLOGICALLY-ACTIVE RIBONUCLEIC-ACID FROM SOURCES ENRICHED IN RIBONUCLEASE 23574 604.46 50 The colorimetric determination of phosphorus 23420 251.83 51 Cutoff Criteria for Fit Indexes in Covariance Structure Analysis: Conventional Criteria Versus New Alternatives 22755 1197.63 52 Particle swarm optimization 22586 982 53 DISC ELECTROPHORESIS .2. METHOD AND APPLICATION TO HUMAN SERUM PROTEINS 22463 415.98 54 MAXIMUM LIKELIHOOD FROM INCOMPLETE DATA VIA EM ALGORITHM 22259 542.9 55 A TECHNIQUE FOR RADIOLABELING DNA RESTRICTION ENDONUCLEASE FRAGMENTS TO HIGH SPECIFIC ACTIVITY 21557 615.91 56 Efficiency of ab-initio total energy calculations for metals and semiconductors using a plane-wave basis set 21539 979.05 57 NEW LOOK AT STATISTICAL-MODEL IDENTIFICATION 21172 481.18 58 Global Cancer Statistics 20983 2997.57 59 A NEW GENERATION OF CA-2+ INDICATORS WITH GREATLY IMPROVED FLUORESCENCE PROPERTIES 20677 626.58 60 CLINICAL-DIAGNOSIS OF ALZHEIMERS-DISEASE - REPORT OF THE NINCDS-ADRDA WORK GROUP UNDER THE AUSPICES OF DEPARTMENT-OF-HEALTH-AND-HUMAN-SERVICES TASK-FORCE ON ALZHEIMERS-DISEASE 20596 605.76 61 THE ASSESSMENT AND ANALYSIS OF HANDEDNESS: THE EDINBURGH INVENTORY 20514 436.47 62 The rise of graphene 20505 1864.09 63 Distinctive image features from scale-invariant keypoints 20258 1447 64 A RATING SCALE FOR DEPRESSION 20238 348.93 65 AN INVENTORY FOR MEASURING DEPRESSION 20104 352.7 66 EQUATION OF STATE CALCULATIONS BY FAST COMPUTING MACHINES 19396 298.4 67 ESTIMATION OF CONCENTRATION OF LOW-DENSITY LIPOPROTEIN CHOLESTEROL IN PLASMA, WITHOUT USE OF PREPARATIVE ULTRACENTRIFUGE 19380 421.3 68 HIGH-RESOLUTION 2-DIMENSIONAL ELECTROPHORESIS OF PROTEINS 19179 446.02 69 COMPARISON OF SIMPLE POTENTIAL FUNCTIONS FOR SIMULATING LIQUID WATER 19023 543.51 70 THE MOS 36-ITEM SHORT-FORM HEALTH SURVEY (SF-36) .1. CONCEPTUAL-FRAMEWORK AND ITEM SELECTION 18987 730.27 71 MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function 18845 1346.07 72 PHASE ANNEALING IN SHELX-90 - DIRECT METHODS FOR LARGER STRUCTURES 18787 670.96 73 A LOW-COST, HIGH-EFFICIENCY SOLAR-CELL BASED ON DYE-SENSITIZED COLLOIDAL TIO2 FILMS 18733 693.81 74 GAUSSIAN-BASIS SETS FOR USE IN CORRELATED MOLECULAR CALCULATIONS .1. THE ATOMS BORON THROUGH NEON AND HYDROGEN 18531 639 75 OPTIMIZATION BY SIMULATED ANNEALING 18374 524.97 76 A NEW METHOD OF CLASSIFYING PROGNOSTIC CO-MORBIDITY IN LONGITUDINAL-STUDIES - DEVELOPMENT AND VALIDATION 18044 582.06 77 MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models 17994 1199.6 78 TISSUE SULFHYDRYL GROUPS 17989 304.9 79 VMD: Visual molecular dynamics 17956 816.18 80 METAANALYSIS IN CLINICAL-TRIALS 17945 560.78 81 IMPROVED PATCH-CLAMP TECHNIQUES FOR HIGH-RESOLUTION CURRENT RECORDING FROM CELLS AND CELL-FREE MEMBRANE PATCHES 17744 479.57 82 HOMEOSTASIS MODEL ASSESSMENT - INSULIN RESISTANCE AND BETA-CELL FUNCTION FROM FASTING PLASMA-GLUCOSE AND INSULIN CONCENTRATIONS IN MAN 17634 534.36 83 A SIMPLE METHOD FOR DISPLAYING THE HYDROPATHIC CHARACTER OF A PROTEIN 17621 489.47 84 Measuring inconsistency in meta-analyses 17584 1172.27 85 MEASUREMENT OF PROTEIN USING BICINCHONINIC ACID 17573 532.52 86 THE HOSPITAL ANXIETY AND DEPRESSION SCALE 17458 498.8 87 STUDY OF THE CONDITIONS AND MECHANISM OF THE DIPHENYLAMINE REACTION FOR THE COLORIMETRIC ESTIMATION OF DEOXYRIBONUCLEIC ACID 17232 277.94 88 The Protein Data Bank 17152 952.89 89 The NCEP/NCAR 40-year reanalysis project 17118 778.09 90 Collective dynamics of 'small-world' networks 17044 852.2 91 Hallmarks of Cancer: The Next Generation 16913 2416.14 92 ABINITIO MOLECULAR-DYNAMICS FOR LIQUID-METALS 16788 671.52 93 Bias in meta-analysis detected by a simple, graphical test 16785 799.29 94 DETERMINATION OF SERUM PROTEINS BY MEANS OF THE BIURET REACTION 16754 242.81 95 A MATHEMATICAL THEORY OF COMMUNICATION 16715 238.79 96 PROCHECK - A PROGRAM TO CHECK THE STEREOCHEMICAL QUALITY OF PROTEIN STRUCTURES 16710 668.4 97 MODELTEST: testing the model of DNA substitution 16619 830.95 98 MULTIPLE RANGE AND MULTIPLE F TESTS 16580 263.17 99 ESTIMATING DIMENSION OF A MODEL 16551 413.78 100 A SIMPLE METHOD FOR ESTIMATING EVOLUTIONARY RATES OF BASE SUBSTITUTIONS THROUGH COMPARATIVE STUDIES OF NUCLEOTIDE-SEQUENCES 16492 434 图.11 前100篇文章列表 注： 所有的数据来源为Web of science。 温馨提示 ： iNature微信公众号是介绍一流的，最前沿的科研成果，提供专业的完整的同行解析；另外也会介绍全世界知名的实验室及业界大师；同时为公众提供一个了解生命科学及科研过程的平台。

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10项主导生命科学领域发展的技术（一）

热度 4 sibscas 2017-11-21 13:07

iNature ：经过iNature编辑组整理了历年的诺贝尔自然学奖（包括物理学奖，化学奖，生理医学奖）及最新的科研进展，遴选出了10项改变了全球生命科学领域的技术，这10项技术分别是：X射线的发现及应用，DNA是遗传物质,测序方法的发明及应用（包括DNA及蛋白质测序）,PCR技术的诞生,基因操作技术（包括CRIPSR及RNAi）,显微镜的出现及应用，色谱技术的发展及应用，分子克隆技术，重编程技术（iPS及相关），蛋白的标记技术（尤其是GFP标记）。 突破性技术 1.X射线的发现及应用 1895年11月8日伦琴发现了X射线，为开创医疗影像技术铺平了道路 ，于1901年获得了首个诺贝尔物理学奖。这一发现不仅极大的推动了医疗方面，而且因为这个，Henri Becquerel 及居里夫妇发现了天然放射性现象，他们于1903年获得了诺贝尔物理学奖。 第一张X射线图片 但是，X射线是怎么样同生命科学联系在一起的呢？这主要由三位学者做了奠基性的工作。在1912年，德国物理学奖Max von Laue发现了晶体的X射线衍射现象，这是固体物理学中具有里程碑意义的发现，从此，人们可以通过观察衍射花纹研究晶体的微观结构，并且对生物学、化学、材料科学的发展都起到了巨大的推动作用，因为这个，Laue在1914年获得了诺贝尔物理学奖。 Max von Laue 虽然Laue发现了X射线衍射现象，但是并没有提出怎么去解析晶体结构。这方面，这要是由Lawrence Bragg及William Bragg共同解决，他们通过对X射线谱的研究，提出晶体衍射理论，建立了布拉格公式，并改进了X射线分光计，他们于1915年获得诺贝尔物理学奖，这为后面的结构学奠定了基础。 Lawrence Bragg 后面基于蛋白纯化技术的提高，Max F. Perutz及John Kendrew解析了肌球蛋白及肌红蛋白，他们于1962年获得诺贝尔化学奖。还有很多都是关于蛋白结构的解析，如核糖体结构的解析以及RNA聚合酶的解析，都是使用类似的方法，X射线晶体衍射方法在结构学方面起了举足轻重的作用，现在也是很常规的方法。 2.DNA是遗传物质 Kossel分离并描述了存在于核酸中的五种有机化合物：腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶。 这些化合物后来显示为核碱基，并且是所有活细胞中发现的DNA和RNA的形成的关键。因为这些工作，Kossel获得了1910年的诺贝尔生理医学奖。 A，T，C，G，U五种碱基 但是，Kossel虽然发现了这些东西，人们对于什么是遗传物质一直争论不休，有的人认为是DNA，而另一些人认为是蛋白质，更有甚者，认为糖类是遗传物质。 噬菌体感染实验 Hershey及Chase通过噬菌体感染实验，证明DNA是遗传物质，而糖类，蛋白质及RNA都不是遗传物质，基于这Hershey与1969年获得诺贝尔生理医学奖，很遗憾，Chase没有获得，可能是因为Chase是一位女性，而没有得到诺贝尔奖委员会的青睐，非常的可惜。 Rosalind Franklin及DNA衍射图 正是基于这项实验，导致了大家对于DNA的进一步的研究热潮，尤其是Maurice Wilkins和Rosalind Franklin（1958年，由于卵巢癌去世，错失诺贝尔生理医学奖）使用X射线晶体衍射方法，获得了DNA的原始结构，而后由James Watson和Francis Crick观察了衍射图，他们才提出DNA的双螺旋结构。 DNA双螺旋结构 之后，Watson和Francis Crick提出了DNA双螺旋模式：一种核酸的构象，在该构象中，两条反向平行的多核甘酸链相互缠绕形成一个右手的双螺旋结构。碱基位于双螺旋内侧，磷酸与糖基在外侧，通过磷酸二脂键相连，形成核酸的骨架。碱基平面与假象的中心轴垂直，糖环平面则与轴平行，两条链皆为右手螺旋。双螺旋的直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm， 两核甘酸之间的夹角是36゜，每对螺旋由10对碱基组成，碱基按A-T，G-C配对互补，彼此以氢键相联系。维持DNA双螺旋结构的稳定的力主要是碱基堆积力。双螺旋表面有两条宽窄`深浅不一的一个大沟和一个小沟。 中心法则 紧接着，在1958年，Francis Crick提出了中心法则，这是在细胞内的生物大分子间转移的基本法则，指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)是对中心法则的补充。正是因为以上的贡献，到1962年，Maurice Wilkins，Watson和Francis Crick共同获得诺贝尔生理医学奖。 3.测序方法的发明及应用 测序方法主要涉及蛋白质测序及DNA测序，其中蛋白质测序是由Frederick Sanger 开发完成的，第一个测出了胰岛素的氨基酸序列，这项成果于1958年获得诺贝尔化学奖。Sanger使用了来自剑桥大学化学系的Bernhard Charles Saunders的有毒气体研究的化学试剂1-氟-2,4-二硝基苯（现称Sanger试剂，氟二硝基苯，FDNB或DNFB）。 Frederick Sanger Sanger试剂证明在多肽链一端标记N末端氨基有效。然后，他用盐酸或使用酶如胰蛋白酶将胰岛素部分水解成短肽。将肽的混合物在一张滤纸上二维分馏，首先通过一维电泳，然后垂直于另一个色谱法。用茚三酮检测到的胰岛素的不同肽片段移动到纸上的不同位置，形成了Sanger称为“指纹”的不同图案。通过FDNB标记赋予的黄色可以识别来自N末端的肽，并且通过完全酸水解确定在肽末端标记的氨基酸的特性，并发现哪一个二硝基苯基 - 氨基酸在那里。 胰岛素结构 通过重复这种类型的程序，Sanger能够确定使用不同的初始部分水解方法产生的许多肽的序列。然后可以将它们组装成更长的序列，以推断胰岛素的完整结构。最后，由于A和B链在没有三个连接二硫键（两个链间，一个在A上的一个链内）是生理上无活性的，Sanger和他们的同事在1955年确定了它们的完整结构。Sanger的主要结论是蛋白质胰岛素的两条多肽链具有精确的氨基酸序列，并且通过延伸，每种蛋白质都具有独特的序列。正是这一成就在1958年获得了他的第一个诺贝尔化学奖。这个发现对于Crick的后续序列假说来说，对于DNA编码蛋白质的思想来说是至关重要的。 Sanger测序方法（双脱氧核苷酸终止法） DNA测序主要是由Frederick Sanger及Walter Gilbert 共同作出了奠基性的贡献，他们于1980年获得诺贝尔化学奖。Frederick Sanger提出了Sanger sequence的方法，也就是双脱氧核苷酸终止法，现在是主流的方法，应用于各种各样的测序中，视为测序的金标准。Sanger首先使用这种方法测出了bacteriophage φX174的基因组结构，幸好这物种的基因组不大，否则Sanger也不会选择这个进行测序。 bacteriophage φX174基因组 Maxam-Gilbert测序是由Allan Maxam和Walter Gilbert在1976 - 1977年开发的DNA测序方法。 该方法基于DNA的核碱基特异性部分化学修饰，并随后在与修饰的核苷酸相邻的位点断裂DNA主链，完成测序。 Maxam-Gilbert测序 Maxam-Gilbert测序，也称为化学测序，该方法允许使用纯化的双链DNA样品，无需进一步克隆。 该方法使用放射性标记及其技术复杂性阻碍了其进一步大规模的应用，而Sanger方法经过改进后，得到了广泛使用。 4.PCR技术的诞生 提到PCR技术，学习生命科学的，没有人不会不知道。我们进行PCR反应，Taq DNA聚合酶及PCR仪必不可少。故在这里主要介绍这俩个概念。Taq聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶，是一种为嗜热菌（Thermus aquaticus），最初被我国台湾学者钱嘉韵等人从其中分离出来，这是一种大量扩增DNA短链数量的方法。 T. aquaticus是一种住在温泉和热液喷口的细菌，Taq聚合酶被鉴定为能够耐受PCR期间所需的蛋白质变性条件（高温）的酶。因此，它取代了原始用于PCR的大肠杆菌的DNA聚合酶。Taq的最佳活性温度为75-80℃，在92.5℃下半衰期大于2小时，95℃为40分钟，在97.5℃为9分钟，可以复制1000bp DNA在72℃不到10秒钟。Taq的缺点之一是缺乏3'至5'核酸外切酶校正活性，导致复制保真度相对较低。原来其误差率在9,000个核苷酸中约为1。 Taq DNA聚合酶结合DNA 现在已经从具有校正活性的其他嗜热细菌和古细菌如Pfu DNA聚合酶中分离出一些热稳定的DNA聚合酶，并且正在使用（或与Taq组合）用于高保真扩增。Taq使具有A（腺嘌呤）的DNA产物在其3'末端突出。这可能在TA克隆中有用，由此使用具有T（胸腺嘧啶）3'突出端的克隆载体（例如质粒），其与PCR产物的A突出端互补，从而使PCR产物连接到质粒载体。 在20世纪80年代初，Kary Mullis在Cetus公司工作，将合成DNA应用于生物技术。他熟悉使用DNA寡核苷酸作为结合目标DNA链的探针，以及它们用作DNA测序和cDNA合成的引物。 1983年，他开始使用两个引物，一个与靶DNA的每条链杂交，并向反应中加入DNA聚合酶。这导致指数型DNA复制，大大扩大了引物之间的DNA量。 PCR反应原理 然而，在每一轮复制后，需要将混合物加热至90℃以上以使新形成的DNA变性，从而允许链条在下一轮扩增中分离并作为模板。该加热步骤还使得在发现Taq聚合酶（来自大肠杆菌的DNA聚合酶I的Klenow片段）之前使用的DNA聚合酶失活。使用热稳定的Taq可以在高温（〜60°C及以上）条件下进行PCR，这有助于引物的高特异性，并降低非特异性产物如引物二聚体的产生。此外，使用热稳定聚合酶消除了对每轮热循环添加新酶的需要。在相对简单的机器中的单个封闭管可用于执行整个过程。因此，使用Taq聚合酶是使PCR适用于有关DNA分析的各种分子生物学问题的关键所在。 PCR程序图 Hoffmann-La Roche最终以3.33亿美元从Cetus购买了PCR和Taq专利， 1989年，“科学”杂志将Taq聚合酶命名为“年度最佳分子”。 Kary Mullis在1993年获得诺贝尔化学奖。到20世纪90年代初期，Taq聚合酶的PCR技术被广泛应用于许多领域，包括基础分子生物学研究，临床检测和取证。它也开始在艾滋病毒直接检测艾滋病毒方面找到紧迫的应用。 5.基因操作技术（包括及RNAi及CRISPR） RNA干扰（RNAi）是通过降解目标mRNA分子来抑制基因表达或翻译生过程。Andrew Fire和Craig C. Mello在1998年发表了线虫干细胞的干扰工作，他们于2006年共同分享了诺贝尔生理医学奖。 植物中的RNAi 但是不得不提，RNAi在植物里面更早的被发现，这也说明诺贝尔奖委员会有时候也不一定会注意到最原创的东西。 RNAi现在被称为精确，有效，稳定和优于用于基因抑制的反义技术。 RNA干扰 microRNA与siRNA- 是RNA干扰的核心。 RNA是基因的直接产物，这些小RNA可以结合其他特定的信使RNA（mRNA）分子，并且增加或减少其活性，例如通过防止mRNA被翻译成蛋白质。 RNA干扰在防御细胞对寄生核苷酸序列（病毒和转座子）中起重要作用。 动植物RNA干扰的区别 RNAi途径存在于许多真核生物中，包括动物及植物，并由Dicer酶引发，Dicer将长双链RNA（dsRNA）分子切割成约20个核苷酸siRNA的短双链片段。研究最多的是转录后基因沉默，当引导链与信使RNA分子中的互补序列相互对应并且通过Argonaute 2（Ago2）（RISC复合物的催化成分）诱导切割时，发生转录后基因沉默。在一些生物体中，尽管siRNA的摩尔浓度最初是有限的，但是该方法系统地传播。 RNAi应用 RNAi是细胞培养和活生物体中有价值的研究工具，因为引入细胞的合成dsRNA可以选择性地并且强有力地诱导抑制感兴趣的特定基因。 RNAi可用于大规模筛选，系统地关闭细胞中的每个基因，这可以帮助鉴定特定细胞过程所需的组分或诸如细胞分裂的事件。该途径也被用作生物技术，医药和杀虫剂的实用工具。 虽然RNAi应用简便，但是RNAi始终是在RNA水平上进行操作的，有时候经过几代遗传，RNA干扰的效果不会很好，另外，RANi干扰只是knockdown基因的表达，而没有达到knockout的程度，故也限制了RNAi的进一步应用。现在，出现了一种更powerful的技术，叫做CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术。 CRISPR组成成分 CRISPR包含已经攻击细菌的病毒的DNA片断。这些片段被细菌使用以通过类似病毒检测和破坏进一步攻击的DNA。这些序列在细菌防御系统中起着关键作用，并且构成了称为CRISPR / Cas9的基因组编辑技术的基础，其允许生物体内的基因永久修饰。 CRISPR种类 CRISPR / Cas系统的简单版本CRISPR / Cas9已被修改为编辑基因组。通过将与合成指导RNA（gRNA）复合的Cas9核酸酶转移到细胞中，可以在期望的位置切割细胞的基因组，从而允许去除和/或添加碱基，进而执行相应的基因编辑功能。 CRISPR应用 CRISPR / Cas基因组编辑技术有许多潜在的应用，已经在动物，植物，真菌等各个物种进行了应用，但是对于人类而言，还存在着伦理学问题，以及需要进一步解决脱靶效应等问题，才能进一步用在临床方面。 其实，RNAi与CRISPR技术相辅相成，使用CRISPR有时会遇到致死的问题，故只能使用RNAI，只需要使基因表达下调就可以了；但是有时候，对于RNAi出现的问题，CRISPR又可以解决，如knockout基因，遗传性问题。 后面5项技术，会在近期继续介绍，敬请关注。 温馨提示 ： iNature微信公众号是介绍一流的，最前沿的科研成果，提供专业的完整的同行解析；另外也会介绍全世界知名的实验室及业界大师；同时为公众提供一个了解生命科学及科研过程的平台。

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分子生物学技术PCR在石油勘探开发中的应用

热度 1 jiangkaixi 2014-5-11 15:44

自 1985 年诺贝尔奖获得者 K.Mullis 发明多聚酶链反应 (PCR) 后，这一技术成为生命科学研究各领域和地质微生物学一个强有力的手段，可在短时间内扩增极微量的 DNA 。 PCR 技术的极高灵敏度可用来研究地质体中微生物的种群数量、分布与迁移等。 Inagakid 等在 2005 年报道从 100Ma 前的白垩纪黑色页岩样品中成功提取并扩增古 DNA ，通过研究保留在沉积岩中的古微生物 DNA ，可以重建地史时期的微生物群结构和古环境条件。 经过近 30 年的发展，当前由 PCR 技术发展起来的实时定量 PCR 技术 (RT-PCR) ，多重 PCR 技术 ( mPCR ) 结合高通量、高精度基因测序 (NGS) 使分子生物学研究更加简单、高效和精确。当前油气勘探开发难度日益加大，不断涌现出新问题，迫切需要新的思路、新的技术和新的方法。近几年引入的全二维气相色谱 - 飞行时间质谱仪，成倍挖掘了蕴藏在原油中的地质 - 地化信息；氩离子抛光扫面电镜则使页岩气储层纳米级孔隙表征和演化规律研究成为可能。因此分子生物学技术 PCR 及其衍生技术吸引了石油科技工作者的极大兴趣，在石油微生物学上，其应用范围不断扩大和深入，获得了一批重要的新发现和新应用。 石油微生物学研究在石油勘探开发领域主要集中于以下几个方向 ( 图 1) ：微生物油气勘探、油藏原油微生物降解、微生物提高油气采收率、原油污染和油田污水处理等。在微生物油气勘探中，利用油气指示菌 ( 如甲烷氧化菌、丁烷氧化菌、中链烷烃氧化菌和长链烷烃氧化菌 ) 功能基因的定量 PCR 方法，高效检测陆地表层土壤和洋底淤泥中油气指示菌的数量、分布和种群，预测地下是否具有油气藏响应，结合地质 - 地震 - 地化研究成果，优选有利油气勘探区，在岩性油气藏勘探和生物点礁气藏勘探中已有很多成功案例。 图 1 PCR 技术在石油勘探开发中的应用 另外利用 PCR 技术分离嗜油细菌样本中的 16SrRNA( 细菌鉴定的可靠分子指标 — 细菌的 “ 身份证 ” ) ，通过基因测序并与 16SrRNA 数据库的系列数据进行比较，鉴定微生物种类，从而筛选出适应目标油藏特殊温度、盐度和酸碱度的高效烃类降解细菌，并利用基因组学和蛋白组学研究其对烃类的降解机理，使微生物采油研究上升一个新的层次，为开发常规水驱、化学驱等难以动用的剩余油和重质油提供强有力手段，同时也可应用于陆地土壤原油污染和海洋石油污染的生物修复和油田污水处理。 加拿大卡尔加里大学 Steve Larter 教授领导的石油研究组是研究油藏生物降解和稠油开发的世界级顶尖团队。该团队于 2013 年报道了利用定量 PCR 技术计算并分析生物降解油藏内不同深度岩芯样品的 SrRNA 拷贝数和差异性，揭示了不同岩芯样品微生物的丰度特征。研究结果表明，油水过渡带微生物总数最大，沿油柱顶部方向微生物丰度递减，正构烷烃完整性递增。首次用分子生物学手段观测了油藏内微生物对烃类的降解模式，即降解首先从油水界面开始 → 油水过渡带 → 油柱顶部 → 油层顶部，随降解程度的增强，各级界面不断推进和变化。 可预见 PCR 相关 技术的发展和引入将大大加快发现油藏内不同深度和不同物理化学环境下微生物种群数量发育规律、活动和迁移规律，可准确评估微生物对油藏的降解速率，认识其降解机理等至今仍不甚了解和未知的问题。上述问题的解决将帮助建立更加精确的油藏生物降解模型，在钻前准确预测生物降解的等级和分布，有效评价勘探风险，特别在高投入、高风险的海洋石油勘探中。 随着常规油气勘探开发形式越来越严峻，走向海洋、走向西部，开发深层油气藏和非常规油气资源成为当前国内油气勘探主方向。 PCR 及其衍生技术的发展和应用必将为石油勘探开发提供新的手段和思路，特别在以 “ 三高 ” 为特点的海洋石油勘探开发中，可为海上勘探有利区优选、油藏生物降解风险评估、海上稠油油藏的高效开发提供新的研究手段。

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瑞典纪事: 实验记录DNA提取/PCR/毛细管电泳

zjlcas 2013-2-7 22:30

以下是在瑞典的实验记录, 之前, 操作都是靠口授心传, 加上自己操作. 我将这些步骤详细记录下来. 共分为: DNA提取(离心柱法), 浓度测定, DNA提取的电泳检验, PCR, PCR产物的凝胶电泳检验,毛细管电泳, 96孔板进行DNA提取以及检验等. 全部内容, 均根据自己所做实验整理而成. 实验一 用试剂盒提取植物的全DNA 目的： 从针叶或种子提取裸子植物全DNA，用于SSR，Barcoding等进一步分析。 准备： 1. 取冰。冰在UPSC 二楼049房间。 2. 将Elution buffer 在65℃烘箱中预热。 操作步骤： 1. 每个待提取DNA样品取2枚针叶，在实验记录本上按照统一编号记录，并誊写样品标签上的所有信息。将2 mL圆底离心管按顺序编号，放在32孔板上。取约60mg针叶（Pinus sylvestris两针），剪碎（长宽不超过3mm），放入圆底离心管中。 2. 加入600μL SP1溶液，加入1μL RNase（在4℃冰箱中） 和 2粒瓷珠。 3. 在mixer mill上充分破碎，一般2min即可，若未打碎，继续破碎2min。 4. 将圆底离心管放在65℃ 金属浴，10min － 15min ，中间混合1－2次。 5. 加入210μL SP2，放冰上5min。 6. 14000rpm离心，5min。 *7. 取上清液到绿柱子，12000rpm，1min （对于种子，步骤可以省略） 8. 将上清液移到2mL新的圆底离心管，加入1.5倍体积的SP3（一般为500 － 700μL），混合均匀。 9. 将700μL上清液转移到蓝柱子（放在新的无盖离心管中，注意柱子和离心管都要标号）， 12000rpm， 1min，倒掉离心管下的液体。 10. 将第8步剩余的上清液继续转移到蓝柱子，12000rpm，1min，倒掉离心管下的液体。 11. 加入500μL的Washing Buffer到蓝柱子，12000rpm，1min，倒掉离心管下的液体。 12. 重复第11步。 13. 将蓝柱子放回原离心管离心，14000rpm，2min。 14. 取干净的EP管，标号。将蓝柱子放入干净的EP 管中，加入90μL 65℃ Elution Buffer洗脱，等候约4min， 12000rpm， 离心1min。 15. 丢弃蓝柱子，将EP管（下面的溶液即为提好的DNA）贴好标签，写上实验纪录上的编号，放入4℃冰箱保存。 如果为种子： 发芽至外露1－2cm，除去种皮， 整粒种子放入2mL圆底离心管。以下程序同。 最后洗脱用100μL Elution Buffer。若需要洗脱完全，则考虑用50μL进行第二次洗脱。 实验二 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳检测 目的： 用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取是否成功 准备：烘箱65℃，打开 操作步骤： 1 在电子天平上称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶。 2 用量筒量取120mLTBE溶液，倒入锥形瓶。 3 将锥形瓶在微波炉中加热三分钟，在沸腾后，轻摇几次，使得琼脂糖全部溶化。 4 放在常温冷却，待65℃左右，（至外边仍然比较烫手，但没有蒸气散出时）。加入8μL EB（溴化乙锭），摇匀。 5 将胶槽两端用不干胶封好，倒入30mL左右的溶液，插入胶孔成型用的梳子，待15到20分钟冷凝。将锥形瓶用多层保鲜膜盖好，并用铝箔封口，放在65℃的烘箱中。 6点 Loading Buffer。每一次取10μL的红色Loading Buffer，分成五份，每个约两μL，点在事先固定在tip盒盖的石蜡膜上。按照样品的数量，点出相应数量的Loading Buffer水珠。 7 点Lambda标准样（试剂公司合成的特定浓度的DNA样品），2μL，若是两排胶孔，应该点两个Lambda标准样。 8 吸取DNA样品，每个吸取2μL，为防止DNA样品的污染，每一次都要换枪头。按照次序点入Loading Buffer水珠中。 9 将胶放置在电泳槽中，令电泳液将其浸入。注意，胶孔一端要放在负极（黑色电极）一端。 10 点样，先在最左侧的胶孔中点入lambda样，将移液器的量程调至4－5μL，按照顺序，吸取水珠，点入胶孔中，此时不必每一次都换枪头。 11 将电泳仪电压调到80－110V之间，电泳15分钟。 12 取胶：先关闭电源，戴上蓝色在Techtum Lab AB凝胶成像系统中拍照。拍照时用MVPILOT软件，点击摄像机的图标，调整对比度和明暗效果，在左侧MITSUBISHI打印机上打印。保存图像时，点击照相机的图标。 13 完成拍照后，将凝胶丢弃，仪器擦拭干净，并保持Techtum Lab AB的门打开。 实验三 用Nanodrop检测DNA浓度 目的： Nanodrop分光光度计测量提取的DNA浓度 操作步骤： 1. 双击打开Nanodrop管理界面，点击Nucleic Acid Measurement。将Nanodrop的探测器旋臂抬起，用蒸馏水擦拭干净。 2. 用移液器吸取1μL 双蒸水（量程可调至1.2μL），点在探头上，盖好，点击Initialize按钮。 3. 打开探测器旋臂，用移液器点一滴Elution Buffer（这是由于之前用的是Elution Buffer，待测的DNA溶于什么溶液，就应该用相应的溶液作为本底对照），点击Blank按钮 4. 抬起旋臂，擦拭干净，换枪头，吸取1.2μL的待测样品，点Measure按钮，记录右下角的DNA浓度。 5． 依次重复步骤4，直至所有样品的浓度都测定完。 实验四 PCR 反应 步骤： （1） 将引物成对摆放，9对引物一定要两两放在一起，并排号。在冰板上，放置9个 ep排管，用以9个不同的引物体系。因每排管由8个小ep管组成，每个96孔板上只能做8个DNA样品（8 *9 ＝ 72组合）。 （2） 将待检测模板DNA用ddH2O稀释到10ng /uL ，贴上标签，放在4℃保存。 （3） 按照DNA样品的数量，计算每对引物各组分的体积。每个组分扩大的倍数，取决于模板DNA的数目（实际情况下的体系的体积倍数要比DNA的数量稍多，每个1.5mL 的ep管内各组分需要到达足够的体积，才能准确量取以及混合）。 （4）取9个1.5mL的ep管，分别按照顺序，添加表1中除DNA模板外的组分。 表1 16uL PCR反应体系 order Constituents Storage Volume Per PCR Tube × 1 ddH2O RT 11.85uL uL 2 PCR buffer 10× 4℃ 1.6uL uL 3 dNTP (25mM/uL) 4℃ 0.1uL (0.156mM) uL 4 Ordinary Primer (10uM) 4℃ 0.2uL (0.125uM) uL 5 With Dye Primer (10uM) 4℃ 0.2uL (0.125uM) uL 6 TopTaq (5 Unit/uL) －20℃ 0.05uL (0.25unit) uL 分装到各ep管，每管14uL 7 DNA template 2uL (10-20ng) 每个样品吸取2uL 模板DNA Total 16uL （5） 将混合好的体系，按照行，分装到同一排管的小ep管中，每个14uL。 （6） 从稀释过的DNA（约10ng/uL），吸取2uL，按照列，添加到排管的小ep管中。 （7） 手动混合反应体系，离心。 按照所需退火温度不同，分成三组： 第一组 LOP1和SsrPt_ctg4363，touch down 温度为 64 – 54℃ 第二组 PtTx3107和PtTX4001，touch down 温度为55－45℃ 第三组PtTX2146，PtTX3025，PtTX3116，SsrPt_ctg1376, SPAC12.5，touch down为60－50℃。 ?（8）每个PCR反应耗时约2－2.5h。注意，PCR仪在最后的延伸完成后，会降到15℃，应该尽快将产物转移到4℃冰箱中， 并尽快检测。 Table 2. Primers and PCR conditions for each locus (Part I) version 0.3 ID 1 2 3 4 5 Locus LOP1 PtTX2146 PtTX3025 PtTX3107 PtTX3116 Dye Cy5.5 green D2 Black D2 Black D2 Black Cy5 Blue Forward(5-3) GGCTAATGGCCGGCCAGTGCT CCTGGGGATTTGGATTGGGTATTTG CACGCTGTATAATAACAATCTA AAACAAGCCCACATCGTCAATC CCTCCCAAAGCCTAAAGAAT Reverse(5-3) GCGATTACAGGGTTGCAGCCT ATATTTTCCTTGCCCCTTCCAGACA TTCTATATTCGCTTTTAGTTTC TCCCCTGGATCTGAGGA CATACAAGGCCTTATCTTACAGAA Ta Touch down 64-54°C Touch down 60-50°C Touch down 60-50°C Touch down 55-45°C Touch down 60-50°C size range 153-189 176-264 211-305 150-174 115-169 PCR Conditions 1 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 18 cycles 2 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 3 30 S from 64 °C to 54 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 55°C to 45 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 4 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 25 cycles 5 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 6 54 °C 30s 50 °C 30s 50 °C 30s 45 °C 30s 50 °C 30s 7 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s Final extention 8 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min Preservation 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- Date: 2012-3-13 Jinlong Table 2. Primers and PCR conditions for each locus (Part II) version 0.3 ID 6 7 8 9 Locus PtTX4001 SsrPt_ctg1376 SsrPt_ctg4363 SPAC12.5 Dye Cy5 Blue Cy5.5 Green Cy5 Blue Cy5.5 Green Forward(5-3) CTATTTGAGTTAAGAAGGGAGTC CGATATTATGGATTTTGCTTGTGA TAATAATTCAAGCCACCCCG CTTCTTCACTAGTTTCCTTTGG Reverse(5-3) CTGTGGGTAGCATCATC AAATGCATGCCAAACTTAAATAC AGCAGGCTAATAACAACACGC TTGGTTATAGGCATAGATTGC Ta Touch down 55-45°C Touch down 60-50°C Touch down 64-54°C Touch down 60-50°C size range 198-229 88-124 95-106 118-184 PCR Conditions 1 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 18 cycles 2 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 3 30 S from 55°C to 45 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 64 °C to 54 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 4 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 25 cycles 5 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 6 45 °C 30s 50 °C 30s 54 °C 30s 50 °C 30s 7 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s Final extention 8 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min Preservation 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- Date: 2012-3-13 Jinlong 实验五 PCR产物的检测 步骤： 一 治胶 1 在电子天平上称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶。 2 用量筒量取120mLTBE溶液，倒入锥形瓶。 3 将锥形瓶在微波炉中加热三分钟，在沸腾后，轻摇几次，使得琼脂糖全部溶化。 4 放在常温冷却，待65℃左右，（至外边仍然比较烫手，但没有蒸气散出时）。加入0.8μL EB（溴化乙锭），摇匀。 1 － 4 仅适用于首次做胶时参考。 5 将胶槽两端用不干胶封好，倒入30mL左右的溶液，插入胶孔成型用的梳子，待15到20min冷凝。将盛有剩余溶胶的锥形瓶用多层保鲜膜盖好，并用铝箔封口，放在65℃的烘箱中。 二 点样 6点 Loading Buffer。每一次取10μL的红色Loading Buffer，分成五份，每个约2μL，点在事先固定在tip盒盖的石蜡膜上。按照样品的数量，点出相应数量的Loading Buffer水珠。 7 点Ladder DNA标准样，5μL，若是两排胶孔，应该点Ladder DNA标准样。 8 吸取DNA样品，每个吸取4μL，为防止DNA样品的污染，每一次都要换枪头。按照次序点入Loading Buffer的水珠中。 9 将胶放置在电泳槽中，令电泳液将其浸入。注意，胶孔一端要放在负极（黑色电极）一端。 10 点样，先在最左侧的胶孔中点入lambda样，将移液器的量程调至4－5μL，按照顺序，吸取水珠，点入胶孔中，此时不必每一次都换枪头。 三 电泳 11 将电泳仪电压调到80－110V之间，电泳15分钟。 四 紫外光检测 12 取胶：先关闭电源，戴上蓝色在Techtum Lab AB凝胶成像系统中拍照。拍照时用MVPILOT软件，点击摄像机的图标，调整对比度和明暗效果，在左侧MITSUBISHI打印机上打印。保存图像时，点击照相机的图标。 13 完成拍照后，将凝胶丢弃，仪器擦拭干净，并保持Techtum Lab AB的门打开。 实验六 用96孔板提取Scots Pine种子DNA 准备： SP1 在使用前，每200μL加入1uL的RNAse， 如研磨2×96材料，则取SP1 40mL，加入200uLRNAse。 放在65℃烘箱预热。 Elution Buffer 65℃预热 步骤： 1. 取96孔板，每个孔放1颗瓷珠，1粒Scots Pine种子，盖好。 2. 充分研磨破碎1min，在UPSC 6th floor。3700rpm离心1，使碎片落入管底，继续破碎1min。 3. 开盖加入200μL SP1，放65℃ 烘箱中10min，混匀两次，将壁上的液体离心到底部（2000rpm） 4 .加入70μL SP2，盖好，混匀，短离心， 5 .放入-20℃冰箱 10min 6. 3700rpm 离心10min 7. 将上清液移动到1.2mL管中（约200μL） 8. 加入1.5体积的SP3 （约300μL） 9. 盖好，混匀20s， 短离心（到3000rpm） 10. 将柱子板放方孔底座上，每孔加入150μL Equilibration Buffer， 混匀，静置4min， 3000rpm离心 2min 11. 每个管中取500μL样品移到 HiBind DNA柱子板上，置于方孔底座上。 12. 盖好尼龙膜，3700rpm离心 3min。 13. 去掉尼龙膜，倒掉方孔底座中的液体。 14. 加入800μL SPW Wash Buffer， 盖好尼龙膜， 3700离心3min，倒掉方孔底座中的液体。 15. 加入800μL SPW Wash Buffer， 3700离心5min，倒掉方孔底座中的液体，再离心10min，以彻底去掉乙醇，倒掉方孔底座中的液体。放在通风厨10分钟，晾干。 16. 将柱子板放在1.2mL排管上，用100μL 65℃ 预热的Elution Buffer洗脱。在65℃温箱中静置5min。 3700rpm离心 5min。 17. 1.2mL排管盖好，保存在4℃冰箱中，其余丢弃。 对DNA进行常规琼脂糖凝胶电泳检测， 2uLDNA， lambda标准样 2uL 20120329 实验七96孔板PCR 1 稀释模板DNA 将提取到的总 DNA 吸取到96孔板上，根据Nanodrop对DNA的测量结果，用ddH2O稀释到10-20ng/uL，需要根据PCR的次数和每次DNA样品量确定要吸 取的DNA量，保证取样量至少多15uL以上。作为模板DNA，写清楚模板DNA的序号，日期，标签如下 Plate-I，放在4°C保存。 2 准备模板标签 对于96孔板，每一格填写如下信息： 1 序号（1-96，一般按照列保存） 2 DNA序列号（如E4218） 3 树编号 （UID，即每棵树所取的哪颗种子 如 81-8，表示81号树的第8颗种子）。 3 模板DNA取样 用排枪取2μL的模板DNA，加入到到96孔板管底部。由于不带有荧光，模板DNA的枪头可收集起来，可以作为毛细管电泳时混合样品用的枪头，但是要做好标记。 4 混合反应体系 Master Mix No. Conponent Volume per tube Concentration ×25 Storage 1 ddH2O 10.95 - 273.75 RT 2 10×PCR buffer 1.6 - 40 -4°C 3 2.5mM dNTP 1 0.15625 25 -4°C 4 Forward Primer 0.2 0.125 5 -4°C 5 Reverse Primer 0.2 0.125 5 -4°C 6 Top Taq 0.05 2.5U 1.25 -20°C 对于任意一板的PCR反应，需要准备4个1.5mL的ep管，先放在冰盒上，按照1-6的顺序添加各组分到ep管中。盖好盖子，短离心，涡旋，短离心，确保体系混合均匀。 5 用电子移液器（该移液器每次可吸取100μL，由于需要加入的反应体系是14μL，因此只能加7次，注意第一次吸取的液体要打掉，长音表明是最后一次），吸取反应体系，每管加入14μL。 6 在96孔板的边缘标记好Plate号，引物名称等，之后贴Bio-Rad的PCR厚膜，用手柄压实，确保每一管的封口都严密。 7 在振荡器上涡旋4-5下，确保反应体系和模板DNA充分混合。短离心，达到2000rpm以上。 8 按照如下条件，设定touch down PCR: Tab.1 LOP1 TD 64 to 54 Tab. 2 PtTX2146 TD 60 to 50 Tab.3 PtTX3025 TD 55 to 45 Tab. 4 PtTX3107 TD 55 to 45 Tab.5 PtTX3116 TD 60 to 50 Tab. 6 PtTX4001 TD 60 to 50 Tab.7 SsrPt_ctg1376 TD 60 to 50 Tab. 8 SsrPt_ctg4363 TD 64 to 54 Tab.9 SPAC12.5 TD 55 to 45 9 每个PCR需要耗时2.5h左右。反应结束后，将产物放到4°C冰箱中保存。 10. 对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，一般每板随机抽检16个样品，点样的量一般为： Loading Buffer 2.5 μL PCR产物 3μL Ladder DNA 5μL 实验七96孔板PCR 1 稀释模板DNA 将提取到的总 DNA 吸取到96孔板上，根据Nanodrop对DNA的测量结果，用ddH2O稀释到10-20ng/uL，需要根据PCR的次数和每次DNA样品量确定要吸 取的DNA量，保证取样量至少多15uL以上。作为模板DNA，写清楚模板DNA的序号，日期，标签如下 Plate-I，放在4°C保存。 2 准备模板标签 对于96孔板，每一格填写如下信息： 1 序号（1-96，一般按照列保存） 2 DNA序列号（如E4218） 3 树编号 （UID，即每棵树所取的哪颗种子 如 81-8，表示81号树的第8颗种子）。 3 模板DNA取样 用排枪取2μL的模板DNA，加入到到96孔板管底部。由于不带有荧光，模板DNA的枪头可收集起来，可以作为毛细管电泳时混合样品用的枪头，但是要做好标记。 4 混合反应体系 Master Mix No. Conponent Volume per tube Concentration ×25 Storage 1 ddH2O 10.95 - 273.75 RT 2 10×PCR buffer 1.6 - 40 -4°C 3 2.5mM dNTP 1 0.15625 25 -4°C 4 Forward Primer 0.2 0.125 5 -4°C 5 Reverse Primer 0.2 0.125 5 -4°C 6 Top Taq 0.05 2.5U 1.25 -20°C 对于任意一板的PCR反应，需要准备4个1.5mL的ep管，先放在冰盒上，按照1-6的顺序添加各组分到ep管中。盖好盖子，短离心，涡旋，短离心，确保体系混合均匀。 5 用电子移液器（该移液器每次可吸取100μL，由于需要加入的反应体系是14μL，因此只能加7次，注意第一次吸取的液体要打掉，长音表明是最后一次），吸取反应体系，每管加入14μL。 6 在96孔板的边缘标记好Plate号，引物名称等，之后贴Bio-Rad的PCR厚膜，用手柄压实，确保每一管的封口都严密。 7 在振荡器上涡旋4-5下，确保反应体系和模板DNA充分混合。短离心，达到2000rpm以上。 8 按照如下条件，设定touch down PCR: Tab.1 LOP1 TD 64 to 54 Tab. 2 PtTX2146 TD 60 to 50 Tab.3 PtTX3025 TD 55 to 45 Tab. 4 PtTX3107 TD 55 to 45 Tab.5 PtTX3116 TD 60 to 50 Tab. 6 PtTX4001 TD 60 to 50 Tab.7 SsrPt_ctg1376 TD 60 to 50 Tab. 8 SsrPt_ctg4363 TD 64 to 54 Tab.9 SPAC12.5 TD 55 to 45 9 每个PCR需要耗时2.5h左右。反应结束后，将产物放到4°C冰箱中保存。 10. 对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，一般每板随机抽检16个样品，点样的量一般为： Loading Buffer 2.5 μL PCR产物 3μL Ladder DNA 5μL 实验八在CEQ 8000上进行毛细管电泳 一 准备Excel 作为样品的Label 每一板混合样的侧面，应该用记号笔标注清楚 ，例如2012-03-29-Plate-I-a 标签 文件，应该保存在Excel中，待毛细管电泳时，直接拷贝到CEQ8000的界面中。 表 2 96孔板标签的排列 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 69-1-a 69-2-a 69-3-a 69-4-a 69-5-a 69-6-a 69-7-a 69-8-a 69-9-a 69-10-a 69-11-a 143-4-a B 71-1-a 71-2-a 71-3-a 71-4-a 143-1-a 143-2-a 71-7-a 71-8-a 143-3-a 71-10-a 71-11-a 71-12-a C 73-1-a 73-2-a 73-3-a 73-4-a 73-5-a 73-6-a 73-7-a 73-8-a 73-9-a 73-10-a 73-11-a 73-12-a D 74-1-a 74-2-a 74-3-a 74-4-a 74-5-a 74-6-a 74-7-a 74-8-a 74-9-a 74-10-a 74-11-a 74-12-a E 81-1-a 81-2-a 81-3-a 81-4-a 81-5-a 81-6-a 81-7-a 81-8-a 81-9-a 81-10-a 81-11-a 81-12-a F 82-1-a 82-2-a 82-3-a 82-4-a 82-5-a 82-6-a 82-7-a 82-8-a 82-9-a 82-10-a 82-11-a 82-12-a G 84-1-a 84-2-a 84-3-a 84-4-a 84-5-a 84-6-a 84-7-a 84-8-a 84-9-a 84-10-a 84-11-a 84-12-a H 86-1-a 86-2-a 86-3-a 86-4-a 86-5-a 86-6-a 86-7-a 86-8-a 86-9-a 86-10-a 86-11-a 86-12-a 二 待检 样品的混合 1 取96孔上样板和PCR中吸取过DNA的10μL枪头。 2 按照顺序排好PCR产物，按照以下量, 用10uL排枪分组添加如下产物到管底部。 注意，每个上样板都由三种产物混合，每次DNA吸取后，都要换枪头。 Table 1 Information for the labeld primers Primer Label PCR frag length Color Group Volume (uL) SsrPt_ctg1376 Cy5.5 88-124 Green 1 a 2 PtTX4001 Cy5 198-229 Blue 1 a 0.5 PtTX3107 D2 150-174 Black 1 a 4.5 SPAC12.5 Cy5.5 118-184 Green 2 b 2 SsrPt?_ctg4363 Cy5 95-106 Blue 2 b 0.5 PtTX3025 D2 211-305 Black 2 b 4.5 LOP1 Cy5.5 153-189 Green 3 c 2 PtTX3116 Cy5 115-169 Blue 3 c 0.5 PtTX2146 D2 176-264 Black 3 c 4.5 3取塑料纸盒，一般每板需要两个2mL ep管的HD，倒入纸盒内。取黄色枪头，每一管，加入30uL 已经混合好的Hi-Di (HD)，无需换枪头。 4 用新的黄枪头，将每一列孔的样品反复吸放几次，以混合均匀。 贴96孔板塑料膜。 5 短离心到2000rpm。 6（如有必要，每个孔滴入染料包内附带的一滴矿物油，防止样品蒸发）。 二 准备Separation Buffer板 地点：UPSC ，B3-28-48 1 取Buffer取样槽，倒入已经稀释好的Separation buffer，用电子排枪每个Separation buffer板孔中放入250uL的separation buffer。 确认无误后，将剩余Separationbuffer倒回瓶内。用双蒸水冲洗Buffer取样槽，用吸水纸擦干，放回原处。 2 取PAGE胶（在4°C冰箱），形如注射器，注意要事先将包装剪开。 三 从CEQ 8000中拷贝上一次运行的数据 1 双击打开CEQ CEQ Main Database(屏幕正下方中央倒数第五个图标) 在新开启的窗口下的导航栏中，选择对应的文件夹(Jinlong), 点击右键，选择 set as working database. 2 回到Jinlong 用户下，选择Default Sample Data ，在右侧显示的窗口中，将文件按照时间排序。 3 选择要导出的文件，右键export，选择scf作为导出格式。 4 将导出的文件拷贝到桌面Jinlong 文件夹中，新建一个文件夹，命名按照如下规则 例如: 2012-03-27-Plate-I-a （a表示第一组， 即SsrPt_ctg1376, PtTX4001和PtTX3107的混合样） 2012-03-28-Plate-I-b （b 表示第二组， 即SPAC12.5, SsrPt_ctg4363和PtTX3025的混合样） 2012-03-29-Plate-I-c （c表示第三组，即LOP1, PtTX3116 和PtTX2146的混合样） 2012-03-29 即日期 2012年3月29日 Plate-I 表示是第一板DNA的扩增产物。 5 将整个文件夹拷贝到USB Flash Disk中。 五 上样及运行： 注意： 一定要按照CEQ8000操作系统中的提示，换Separation Buffer， DNA sample 及 Wetting Tray， Gel Catridge。 1 打开CEQ CEQ Main Database (屏幕正下方工具栏的倒数第五个图标) 选择Jinlong右键 set as working database 2 洗Wetting tray。点击工具栏的Run图标，在新界面的菜单中，点击Replenish Replenish wetting tray，提示 Do you want to replesh the wetting tray? 点OK。当出现上面的对话框显示为绿色时，可以打开上盖，wetting tray两端的卡子，取下Wetting tray， 打开后，倒掉里面的水及胶的混合液，用双蒸水冲洗。擦干后放回。 3 安装样品，在里面的支架上放样品，放好后再揭开贴膜，在外面的支架上放separation buffer，盖好separation buffer板的盖子, 点Done。 4 如果之前已经将胶卸载，并安装了黄色的Plug，则必须要从 Install gel catridge开始（Release gel catridge为灰色）。点击Install gel catridge，稍等几分钟后，“没有胶或者胶已经泄露”等信息，点击release gel。如果前面的胶未卸载，则直接点击Release gel catridge即可换下前面剩余的胶柱在注射器中。 5若提示 “Do you wish to release the gel cartridge?”,点OK。待出现“you may now open gel access and change gel catridge”的对话框，则可以打开下面的盖子，卸下已经安装好的黄色塞子（plug），将盛满胶的注射器的安装好。点击 ReplenishInstall gel catridge,等待新胶柱安装好。 6. 用Direct control打出一些胶，目的是防止胶柱前端的空气进入毛细管中。一般需挤出为0.2mL路径： 菜单 Direct control Manifold Purge 输入0.2mL即可。 7. 在屏幕正下方的控制界面中，点击Sample setup（工具条第一个），选择Create a new sample，从excel中拷贝96孔板的样品标签。 在出现的表格中，将96孔板的名称标签粘贴到两个view中（在页面最上面的check point）。第一个界面，每一列的最下方，都要选取Frag3，两个页面核对无误后保存，文件名参照统一命名格式 如 2012-03-29-Plate-I-a。表格将从白色变成蓝色。 8. 点击右上角的Run sample Plate 若出现对话框 Capillary Array usage exceeded. Do you want to continue? 选择 Yes Select a sample plate to Run，选择刚刚保存的2012-03-29-Plate-I-a， 9 新弹出的屏幕左侧显示的是Buffer，右侧显示样品，高亮部分表明该板对应位置应该有样品和缓冲液。点击左下角的 Start开始进行毛细管电泳。 10 样品完成后的卸载和塞子安装。96孔板的毛细管电泳大约耗时10h，注意查看Log文件。全部结束后，冲洗wetting tray， Replesh Replesh wetting tray, 冲洗好后，放回。点击Replenish Release gel catridge , 提示 “Do you wish to release the gel catridge?” 点OK,等待1 – 2min， 胶柱卸载。 11. 换下用过的多半管胶，塞入黄色的塞子（Plug In），关好门后，显示点击 ReplenishInstall Gel catridge 出现对话框，Install Plug In. 将没用用过的胶放回4°C冰箱保存。

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[转载]PCR的小女孩——原著安徒生

热度 1 pkucarer4300 2012-12-16 12:53

实验室里冷极了，没有窗户，不知道是白天还是黑夜。这是一周的最后一天——周 末。在这又冷又黑的晚上，一个蓬头散发的小女孩在试验台前坐着。她从家里出来的时候 还穿着一件外套，但是有什么用呢？那是一件很大的外套──那么大，不知是哪一年买 的。她工作的时候的，就穿上白大褂了，实验室的师弟嘲笑说，何必穿实验服呢，你的破大衣都可以当抹布了。 小女孩只好一个人做实验，一双小手被PE手套捂得苍白。她的面前的胶板上有一串点样孔，还有好几管菌落pcr产物。这一整天，目的基因还是没连上质粒，谁也没帮过她。 可怜的小女孩！她又冷又饿，哆哆嗦嗦地点样。灯光落在她的干枯的长头 发上，那头发卷曲着披在肩上，看上去很久没梳，不过她没注意这些。每个桌上都堆满 了文献，实验室飘着一股LB培养基的香味，因为这是老板催要结果的时间——她可忘不了这 个。 她在上完出某个样后停了下来，蜷着趴在桌子上。她觉得更冷了。她不敢跟老板说，因 为她试了所有的taq酶，试剂盒，质粒，没p出阳性的菌落，老板一定会骂她的。再说，换做别的题目跟这个一样难。她们头上只有paper，虽然网上有好多类似的文献，但到她这里就是不work。 她的头脑几乎绝望了。啊，哪怕一次小小的成功，对她也是有好处的！她敢把上万 块钱的酶全丢进去连接载体，能够把基因转进去吗？她终于又拿出一块跑完的胶。紫外光照上去了！一个一个样点在胶板上出现了！她把小手拢在紫外灯下。多么温暖多么明亮的小点啊，简直像一支小小的蜡烛。这是一道奇异的火光！小女孩觉得自己好像坐在一台测序仪的显示器前面，显示器还是全新锃亮的，颜色鲜艳，字迹清晰，上边的显示的序列明明就是目的基因，多么舒服啊！哎，这是怎么回事呢？她刚把头伸过去，想看的仔细一些，她坐在那儿，眼前的胶板上显出一行刺眼的阴性、引物二聚体、模板，就是没有阳性菌落。 她又上了一遍样。用150v跑完又用100v再跑。紫外灯的光落在桌子上，那儿忽然变得像打印出来的paper那样洁白工整，她可以一直看到paper上的字迹。Nature的logo，Abstract和Instroduction。更妙的是这篇paper的一作，赫然署着自己的名字！看上去那么诱惑，一直向这个穷苦的小女孩走来。这时候，新跑完的胶板上还是只有阴性的样点，她面前只剩一张又硬又旧的桌子。 她p了十几个菌落，又跑了一块胶。这一回，她感觉自己坐在布置整齐的会议室里。条幅上写着“毕业答辩”，比她去年师姐毕业时用的条幅还要大，还要美。红色的条幅上贴着那几 个白色的黑体字，投影仪屏幕上许多幅美丽的彩色画片，跟顶级会议里的presentation一个样，在向她眨眼睛。小女孩向画片伸出手去。这时候，板子又爬好了，不出意外，没新点。只见ppt上的图片越升越高，最后成了在天空中闪烁的星星。有一颗星星落下来了，在天空中划出了一道细长的红光。 “有一个什么人快要死了。”小女孩说。唯一疼她的师姐毕业前的时候告诉过她：一颗星星落下来，就有一个灵魂要到沃森和克里克那儿去了。 她又连接了一管载体。这一回，她把所有的酶的量都加大了。师姐出现在灯光里，是 那么温和，那么慈爱。 “师姐！”小女孩叫起来，“啊！请把我带走吧！我知道，反应一结束，您就会不见的，像那漂亮的跑胶，发表的paper，布置好的答辩会议室一个样，就会不见的！” 她赶紧拿出所有的胶板，放在紫外灯下，要把师姐留住。一大堆胶板在紫外灯下放出明亮的光，把实验室照得跟白天一样明亮。师姐从来没有像现在这样高大，这样美丽。师姐把小女孩抱起来，搂在怀里。她们俩在光明和快乐中飞走了，越飞越高，飞到那没有PCR，没有论文，也没有毕业的地方去了。 第二天清晨，这个小女孩坐在实验台前上，两腮通红，嘴上带着微笑。她死了，在周末 的实验室累死了。新一周的太阳升起来了，照在她小小的尸体上。小女孩坐在那儿，手 还握着正要上样的EP管。 “她想自己转一个基因……”人们说。谁也不知道她曾经看到过多么美丽的东西 ，她曾经多么幸福，跟着她师姐一起走向新世界的幸福中去。

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屈武斌 设计的第二代PCR引物质量评估软件MFEprimer-2.0已可用

热度 3 zcgweb 2012-9-6 01:07

第二代PCR引物质量评估软件：MFEprimer-2.0，可以针对全基因组数据库在1-3s内预测任意PCR引物对的特异扩增产物和非特异扩增产物： http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/MFEprimer-2.0/ 该工作已发表在今年6月份的核酸研究(NAR)上，欢迎大家使用该工具，论文参考信息如下： Qu W, Zhou Y, Zhang Y, Lu Y, Wang X, Zhao D, Yang Y, Zhang C* . MFEprimer-2.0: a fast thermodynamics-based program for checking PCR primer specificity. Nucleic Acids Res . 2012 Jul;40(Web Server issue):W205-8. Epub 2012 Jun 11. QuWB 2012 MFEprimer-2.0 NAR.pdf 第一代MFEprimer于2009年发表在Bioinformatics上： Wubin Qu, Zhiyong Shen, Dongsheng Zhao, Yi Yang*, and Chenggang Zhang* . MFEprimer: multiple factor evaluation of the specificity of PCR primers, Bioinformatics , 2009, 25(2):276-278 QuWB 2009 MFEprimer Bioinformatics.pdf 这两篇论文都是由我们实验室 屈武斌 完成的，两篇论文PDF版本均见附件。

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生态学文献9：用蚂蟥来探究动物多样性

热度 1 mengchanghe 2012-5-23 16:39

Baerholm Schnell et al 2012- leech blood screening mammals .pdf 很多珍稀的，害羞乃至神秘的物种用常规的手段都很难检测（如人工调查、摄像头拍摄），以至于他们极其难以评估。而蚂蟥血提供了很好的依据！一个蚂蟥体内的血通常20 days到几个月都有，而且一般都很单一，即消化了再去吸取新的血，而且血本身也会降解。由此，本研究测量了25个蚂蟥体内的血，发现21个含有6个珍稀物种的血，技术用的是PCR技术，由此，本研究充分证明了蚂蟥血可以作为一个很好的指标。 这文章很短，2页，但是观点确实新颖，当然不足之处是 数据真实性很难判定，21个就有6个珍稀动物，F表示impossible,然后样本量确实有待提高，杀蚂蟥的方法还有两种不统一，总之，本文是观点很好，可以被推广~

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pcr product length calculation by primer premier

graceguan9 2012-3-30 22:29

How to find the pcr product length, when the primer pairs are known by primer premier 1 F primer Ctrl V as is to get the seq NO 2 R primer Ctrl V reverse complement to get the seq NO and the length 3 the length of pcr product is seq NO(R primer)+ the length(R primer)-seq NO(F primer)

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PCR protocol

热度 1 qin13696 2011-10-3 15:57

先把标题写出来 空了来补充 哈哈

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用PCR板建造我的“中华世博馆”

热度 17 Macrofungi 2011-6-3 15:35

PCR板建造我的“中华世博馆” 材料： PCR 板 300 块左右，大剪刀一把， 502 胶水三瓶共 15mL ，尺子一把。 工时： 8 小时。 作品：中华世博馆，以上海世博会中国馆为模型。 大小：与世博馆的比例为2000：1左右，实际高33cm左右，底座33×33cm。顶层56×56cm。 工作现场， 8个小时，两个人的努力下，终于初见成效 俯视图 仰视图 臭美一个，O(∩_∩)O哈哈~ 这张也是我答辩ppt的致谢图片， 好搭档，我的！ 三年的PCR实验材料，300块左右的96孔板。

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[转载]用叶片直接PCR（非试剂盒）

edisonlou 2011-4-28 15:55

LEAF PCR PROTOCOL (Klimyuk et al., 1993, TPJ 3: 493-494) 1) Samples are harvested in 1.5 ml tubes and stored on ice. 2) 40ul of 0.25N NaOH was added and the samples boiled for 30 sec. 3) 40ul of 0.25N HCl then 20ul Tris mix was added and the samples boiled for another 2 min. -tissue samples can then be used immediatly or stored at 4 C for several weeks. -The amount of tissue used in each PCR reaction should not exceed 2mm2 or the reaction will not work. A small amount of treated material can be excised for use in a PCR reaction with a sterile Gilson tip. PCR reaction conditions are as follows: total volume= 50ul for 5.5 reactions 10X buffer 5ul 27.5uls 10mM dNTPs 1.25uls 6.875uls primer A 2.5uls 13.75uls primer B 2.5uls 13.75uls dH2O 38.75uls 213.1uls taq poly 1.0ul 5.5uls 95 C 10min 1X 95 C 30sec 55 C 30sec 72 C 45sec 30X 72 C 10min 1X run 15ul on a 2% agarose gel note: 2.5 times more primer is used and 2 times more taq polymerase in the leaf PCR protocol. If you could get by with less, Jonathan Jones would have done so! Stocks 0.25N HCl 0.25N NaOH Tris buffer: 0.5M Tris pH 8.0 0.25% Nonidet P-40 LEAF PCR ON ARABIDOPSIS TISSUE WITHOUT ALKALINE TREATMENT Preparation of Master mix: 1 x Taq-buffer 1.5 mM MgCl2 200 mM of each dNTP 1 mM each primer 0.5 ml 20 x Taq polymerase The mix is stored on ice until use. Preparation of leaf tissue: Put the leaf in a small Petri-dish. Make a hole in a leaf with the narrow end of the Pasteur pipette (a forceps might be helpful) and place the leaf in a PCR-tube, if necessary by blowing. On ice, add 50 ml the Master mix. Running the cycles: Transfer the tubes directly from ice to the prewarmed 94 C block on the Robocycler and run the following cycles: 94 C for 3 min 1 x 94 C for 30 s; Tann.* for 1 min; 72 C for 1 min-1 min 30 s 35 x 72 C for 10 min (optional) 1 x Appropriate controls: Positive Negative For screening transgenics: plasmid ColO ColO with endogenous primer-set g DNA gDNA with endogenous primer-set - DNA *The annealing temperature (Tann.) should be 2-3 C below the calculated Tann..

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LAMP技术的优缺点

热度 3 SNPs 2011-1-19 01:10

我最早知道LAMP技术还是在2003年非典期间。当初我们做了一个多重PCR分子鉴别诊断，同时检测十多个呼吸道细菌和病毒病原体（包括非典病毒），而和我们合作在国内做临床报批的单位，因为手头有较多的病人标本，也在给日本的那家公司做LAMP非典诊断的临床。 这几年，LAMP技术在国内推广得很好。我走到那里都有人跟我讲LAMP的应用。的确，LAMP技术有许多明显的优点： （1）恒温扩增，扩增阶段对仪器的要求低。 （2）视觉直观检测，不需要检测仪。 （3）反应速度快，敏感性高。 （4）用多个引物，特异性好。 （5）价格便宜。 这么多优点，就是该技术能“热”起来的根本原因。 不过，仔细分析这个技术，你就会发现它的一些问题： 首先，一个最突出的问题就是它 没有办法做多重扩增 ，两三个靶点可以，再多难度就非常大了。 其次，它在敏感性上，定量能力上,封闭系统等方面不如实时PCR。 还有，说是恒温扩增不需要仪器，可是大多数人做LAMP都用PCR仪器保温。 对那些不需要多重检测的应用，LAMP不失为一种可行的方法。但是，（因为没有封闭系统）避免污染造成的假阳性是一个问题。（因为没有多重）如何设立反应体系的内外对照，也是问题。还有就是和上游的标本处理，核酸提取步骤如何整合的问题。 如果LAMP技术出现早10年，出现在九十年代初，而不是00年代初，那它的市场前景一定很好。毕竟，它是对传统PCR专利的一个挑战。可是现在，常规PCR的专利已经过期，LAMP技术既要和常规PCR竞争，又要和实时PCR竞争。仅靠“恒温”来竞争就显得比较单薄了。 价格便宜也是相对的，因为现在常规PCR试剂已经很便宜了，常规PCR仪器也便宜到不能再便宜了。还有，便宜，对用户是好消息，可是对厂家就是悲歌了。没有相应的利润率，如何把前期的研发费用赚回来？如何给厂家和投资人换得应有的回报？如何成为一个可持续发展的公司？ 对那些在LAMP“平台”上开发产品的公司来说，和当初PCR技术一样，一个主要的问题就是如何建立竞争壁垒？太容易做的东西，你能做，他人也能做，你如何胜出？尤其对那些跟大流后期参与进来的公司和开发者来说就更难：能开发的人家都已经开发完了。又晚了一步。 核酸扩增技术有许多种（如Rolling circle, branched DNA, NASBA等），许多方法都是研究人员想出来去绕开原始的PCR专利的。所以我们在选择技术平台以前，一定要问问自己：“这个平台比现有的标准PCR技术到底好在那里？我是否值得在这个技术上投入我的精力？这个技术是否是我的机会？如果我在这个技术平台上做研发，结果是一个论文？还是一个产品？一系列产 品？这些产品能赚钱吗？有多大的市场？能支撑一个公司吗？” 选择技术平台有点象寻找有潜力的股票，选好了大有益处，选不好可能满盘全输。科研人员这一辈子能“赌”几回？所以我们在全身心投入进去以前，最好是多问几个为什么。

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【转载】PCR防污染方法大全

han5 2010-12-3 18:44

一． 污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。 （一）划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求 实验 操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： 1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备； 2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增； 3. 产物分析区，凝胶 电泳 分析，产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备PCR扩增产物分析产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 （二）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的 DNA 和其他来源的DNA： 1． PCR用水应为高压的双蒸水； 2． 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制； 3． 引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 (三) 实验操作 注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： 1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； 7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 8. 重复实验，验证结果，慎下结论。 二． 追踪污染源 如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。 （一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等） 检测 阴性的标本中检测出极微量的靶 分子 。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。 （二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。 +^,z}( Ak 环境污染中常见的污染源主要有： 1. 模板提取时真空抽干装置； 2. 凝胶电泳 加样器； 3. 电泳装置； 4. 紫外分析仪； 5. 切胶用刀或手术刀片； 6. 离心机； 7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等； 此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。 8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。 三．污染处理 （一）环境污染 1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤； 2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。 （二）反应液污染 可采用下列方法之一处理： 1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列； 2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR；  3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法； 4. g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。 （三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。 1. 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对 RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。 2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。 3. dU引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR产物中仅5ˊ端带dU。UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。 4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。 5. 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。 （四） 固相捕获法 用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一 生物 素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。 （五）RS-PCR法（RNA-specific PCR） 也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A区）有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0个核苷酸（C区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使 cDNA与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。 （六）抗污染引物法 该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。 转载自： http://bbs.biogo.net/read.php?tid=168253

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管理好PCR实验室

qwangbio 2010-11-30 16:32

最近学习的过程中总是能碰到Y. M. Dennis Lo! 可能是人家的影响太大了，也可能是我这些天就一直在人家精通的领域里瞎溜达。 前几天同事张晶遇到PCR污染的问题，这个问题确实让人郁闷。头儿组织大家学习PCR实验室的管理，认识PCR污染的严重性......我最后的体会就是由于我这边平台的一些特殊条件和限制，整个实验室里我这边重蹈覆辙的可能性最大！ 唉，突然感觉PCR就像媳妇听话时，你先想让她干什么，她就干什么；不听话时，你不想让她干什么，她就越干什么，还整天和你干仗！但所有人都会告诉你，责任不在她，是你这个男人平时对她不够好...... 这么多年来积累了一个思维惯势复杂问题简单化，简单问题复杂化！ 今天看到Lo编著的第二版 Clinical Applications of PCR 里面关于建立PCR实验室的章节 Setting up a polymerase chain reaction laboratory ，就顺便学习一下，以后肯定用得着！ PCR的最重要优势就是极度敏感，同时最大的弱点也是极度敏感（这里不能再说媳妇了，其实研究表明男人比女人更容易敏感......），因外来污染容易造成假阳性的出现（这里用男女关系来比喻再恰当不过了，哈哈）！所以建立PCR实验室时，首先就要考虑防止污染，尤其在临床诊断实验室里，人命关天啊。 PCR污染主要来源有样品交叉污染；实验室环境的重组质粒污染；还有先前PCR引物和产物的携带污染(carry-over contamination)；最后是在DNA提取和PCR的过程中从个人和试剂过程中导致的DNA模板在实验室中无所不在。其中样品污染的波及范围毕竟有限，携带污染和模板污染的影响就很严重了。列举个数字看看，即便一管含有2个分子模板的50 l 的PCR反应体系经历40个循环扩增后，理论上靶分子数可达到 1 099 511 627 776 个,即10 12 个分子。其中0.05 l 里也含有10 9 个分子，足以引起下一个相同PCR反应的大混乱...... 那么这0.05 l 的体积又是从什么途径传播的呢？我们熟悉的试剂、移液器、实验室表面，甚至还在某个 操作人员的脸部上皮细胞上 ...... Lo在文中提出了防止PCR污染的原则 1.严格的物理分离 建议将PCR间分成3个区域：样品制备去 (sample preparation stage)、 PCR配制区 (PCR setup stage)、 后PCR区 (post-PCR stage) 。无论多么小的仪器都必须限制在所在区域内，包括实验记录本也不能在不同区域内携带。如果必须要传送，方向也必须是从 pre-PCR 至 post-PCR， 决不能反方向传送。 a.样品制备区是用来处理样品原料的，例如DNA和RNA的提取。PCR产物是不允许进入此区域的。包括移液器和实验服在内，用于样品制备的仪器和试剂也要单独存放。进入人员必须佩戴手套，并要时常更换。总之，样品处理过程越简单，引入污染的可能性就越小。冰箱等储藏设备要单独放置，仅用于样品准备。 b. 建议PCR配制区是用来在洁净工作台中配制PCR反应的，必须保持此区域的洁净。仪器和储藏设备应放在靠近PCR配制区的位置。向PCR试剂中添加样品（模板）必须在一个单独的区域，DNA或RNA样品决不允许进入PCR配制区。 c. PCR仪的位置取决于详细的扩增需求。包括单轮PCR和不需要中间取样分析的PCR反应来说PCR仪可以放在 post-PCR 区域。对于必须开盖的 PCR ，如 nested PCR，PCR 仪应放在除这三个区域以外的第四个单独隔离区域。移液管等也随之单独分配。 d. 后PCR区域是用于分析PCR产物的，包括电泳、酶切和质谱分析。后PCR区域的物品不允许回到前面提到的区域，包括实验记录本和笔。 2. 制定PCR实验室规定，是污染的风险降到最低。 a. 所有的PCR试剂都要小量分装。可以高压灭菌的试剂都要做灭菌处理。 b. 经常更换手套，建议使用帽子和口罩，因为某些个体更容易造成污染。 c. 建议使用防气溶胶移液管。 d. 当配制多个反应时，配制 Master Mix 有助于减少加样的次数，也就减少了污染的可能性。 e. PCR 的循环数保持尽量最少，因为过度敏感的试验更容易污染。 f. 假如有的选择，最好使用一次性耗材。 g. 如果有可能，不同的人员分配到项目的不同区域中。如不可行，最好安排项目时间表或工作周，如 pre-PCR 和 post-PCR 在不在同一天操作。 h. 采用封闭PCR体系，如Taq man体系用荧光信号检测PCR产物，不必开盖处理PCR后样品处理。所以这种体系的携带污染比传统体系少很多。这一点对临床诊断特别重要。 3. 专门的防污染方法 a. 在加入DNA模板前，紫外照射可以破坏任何污染的DNA。因为这个方法是基于邻近胸腺嘧啶的交联，所以PCR的序列对去污然的效率有部分影响。某些引物对紫外的破坏作用更加敏感，就需辐射后再添加。干粉DNA对紫外有更强的抵抗力。这就意味着紫外去除实验室表面的DNA污染的能力是有限的！总之，洁净室的实验室和物理分区才是最有效的防污染方法，紫外照射只能提供一个额外的保护。 b. 限制酶切处理 在加入模板DNA之前，加入限制性内切酶抑制任何污染。排除污染之后，添加模板之前热变性破坏酶活性。 c. Dnase I处理 d. 掺入dUTP，用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)处理 由于先前的PCR扩增实验中的携带PCR产物是PCR污染的首要来源，所以应先减少PCR产物污染，而不是DNA模板污染。Longo在PCR期间用dUTP替代dTTP，含有dU的携带PCR产物在以后的扩增实验之前就被UNG孵育破坏了。需要注意的是，dUTP替换dTTP时，经常需要重新调整MgCl 2 的浓度，一般情况下，600mM dUTP使用3mM MgCl 2 。在起初开始热变性后，UNG活性被破坏，所以新合成的PCR产物不会被降解。然而当温度低于50度时，UNG会复性，所以必须用50度以上温度退火。

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[转载]PCR的小女孩

oyjenvol 2010-11-20 09:43

实验室里冷极了，没有窗户，不知道是白天还是黑夜。这是一周的最后一天 周末。在这又冷又黑的晚上，一个蓬头散发的小女孩在试验台前坐着。她从家里出来的时候还穿着一件外套，但是有什么用呢？那是一件很大的外套 ── 那么大，不知是哪一年买的。她工作的时候的，就穿上白大褂了，实验室的师弟嘲笑说，何必穿实验服呢，你的破大衣都可以当抹布了。 小女孩只好一个人做实验，一双小手被 PE 手套捂得苍白。她的面前的胶板上有一串点样孔，还有好几管菌落 pcr 产物。这一整天，目的基因还是没连上质粒，谁也没帮过她。 可怜的小女孩！她又冷又饿，哆哆嗦嗦地点样。灯光落在她的干枯的长头发上，那头发卷曲着披在肩上，看上去很久没梳，不过她没注意这些。每个桌上都堆满了文献，实验室飘着一股 LB 培养基的香味，因为这是老板催要结果的时间 她可忘不了这个。 她在上完出某个样后停了下来，蜷着趴在桌子上。她觉得更冷了。她不敢跟老板说，因为她试了所有的 taq 酶，试剂盒，质粒，没 p 出阳性的菌落，老板一定会骂她的。再说，换做别的题目跟这个一样难。她们头上只有 paper ，虽然网上有好多类似的文献，但到她这里就是不 work 。 她的头脑几乎绝望了。啊，哪怕一次小小的成功，对她也是有好处的！她敢把上万块钱的酶全丢进去连接载体，能够把基因转进去吗？她终于又拿出一块跑完的胶。紫外光照上去了！一个一个样点在胶板上出现了！她把小手拢在紫外灯下。多么温暖多么明亮的小点啊，简直像一支小小的蜡烛。这是一道奇异的火光！小女孩觉得自己好像坐在一台测序仪的显示器前面，显示器还是全新锃亮的，颜色鲜艳，字迹清晰，上边的显示的序列明明就是目的基因，多么舒服啊！哎，这是怎么回事呢？她刚把头伸过去，想看的仔细一些，她坐在那儿，眼前的胶板上显出一行刺眼的阴性、引物二聚体、模板，就是没有阳性菌落。 她又上了一遍样。用 150v 跑完又用 100v 再跑。紫外灯的光落在桌子上，那儿忽然变得像打印出来的 paper 那样洁白工整，她可以一直看到 paper 上的字迹。 Nature 的 logo ， Abstract 和 Instroduction 。更妙的是这篇 paper 的一作，赫然署着自己的名字！看上去那么诱惑，一直向这个穷苦的小女孩走来。这时候，新跑完的胶板上还是只有阴性的样点，她面前只剩一张又硬又旧的桌子。 她 p 了十几个菌落，又跑了一块胶。这一回，她感觉自己坐在布置整齐的会议室里。条幅上写着 毕业答辩 ，比她去年师姐毕业时用的条幅还要大，还要美。红色的条幅上贴着那几个白色的黑体字，投影仪屏幕上许多幅美丽的彩色画片，跟顶级会议里的 presentation 一个样，在向她眨眼睛。小女孩向画片伸出手去。这时候，板子又爬好了，不出意外，没新点。只见 ppt 上的图片越升越高，最后成了在天空中闪烁的星星。有一颗星星落下来了，在天空中划出了一道细长的红光。 有一个什么人快要死了。 小女孩说。唯一疼她的师姐毕业前的时候告诉过她：一颗星星落下来，就有一个灵魂要到沃森和克里克那儿去了。 她又连接了一管载体。这一回，她把所有的酶的量都加大了。师姐出现在灯光里，是那么温和，那么慈爱。 师姐！ 小女孩叫起来， 啊！请把我带走吧！我知道，反应一结束，您就会不见的，像那漂亮的跑胶，发表的 paper ，布置好的答辩会议室一个样，就会不见的！ 她赶紧拿出所有的胶板，放在紫外灯下，要把师姐留住。一大堆胶板在紫外灯下放出明亮的光，把实验室照得跟白天一样明亮。师姐从来没有像现在这样高大，这样美丽。师姐把小女孩抱起来，搂在怀里。她们俩在光明和快乐中飞走了，越飞越高，飞到那没有 PCR ，没有论文，也没有毕业的地方去了。 第二天清晨，这个小女孩坐在实验台前上，两腮通红，嘴上带着微笑。她死了，在周末的实验室累死了。新一周的太阳升起来了，照在她小小的尸体上。小女孩坐在那儿，手 还握着正要上样的 EP 管。 她想自己转一个基因 人们说。谁也不知道她曾经看到过多么美丽的东西，她曾经多么幸福，跟着她师姐一起走向新世界的幸福中去。 （Quoted from:http://bbs.bioon.net/bbs/home.php?mod=spaceuid=658238do=blogid=13001)

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A very good Real-Time PCR manual for beginners

jones 2010-6-24 20:35

这两本手册是美国Applied Biosystems公司7300-7500型实时定量PCR仪的使用说明书，对于Real-time PCR新手入门很有帮助。很不容易在网上找到pdf版，并稍做修正，需要做这方面的朋友可以参考一下。 手册包括相对定量与绝对定量两部分，下载地址如下： 点击这里下载

个人分类: 实验点滴|3800 次阅读|0 个评论

多重PCR用户的福音：MPprimer and MFEprimer

zcgweb 2010-4-17 23:59

最近我们实验室在BMC Bioinformatics上发表了多重PCR引物设计程序MPprimer，对于提高PCR实验的效率具有一定帮助，有兴趣的朋友可以看看： http://www.biomedcentral.com/1471-2105/11/143/abstract Software MPprimer: a program for reliable multiplex PCR primer design Zhiyong Shen , Wubin Qu , Wen Wang , Yiming Lu , Yonghong Wu , Zhifeng Li , Xingyi Hang , Xiaolei Wang , Dongsheng Zhao and Chenggang Zhang BMC Bioinformatics 2010, 11 : 143 doi:10.1186/1471-2105-11-143 Published: 18March2010 Abstract (provisional) Background Multiplex PCR, defined as the simultaneous amplification of multiple regions of a DNA template or multiple DNA templates using more than one primer set (comprising a forward primer and a reverse primer) in one tube, has been widely used in diagnostic applications of clinical and environmental microbiology studies. However, primer design for multiplex PCR is still a challenging problem and several factors need to be considered. These problems include mis-priming due to nonspecific binding to non-target DNA templates, primer dimerization, and the inability to separate and purify DNA amplicons with similar electrophoretic mobility. Results A program named MPprimer was developed to help users for reliable multiplex PCR primer design. It employs the widely used primer design program Primer3 and the primer specificity evaluation program MFEprimer to design and evaluate the candidate primers based on genomic or transcript DNA database, followed by careful examination to avoid primer dimerization. The graph-expanding algorithm derived from the greedy algorithm was used to determine the optimal primer set combinations (PSCs) for multiplex PCR assay. In addition, MPprimer provides a virtual electrophotogram to help users choose the best PSC. The experimental validation from 2x to 5x plex PCR demonstrates the reliability of MPprimer. As another example, MPprimer is able to design the multiplex PCR primers for DMD (dystrophin gene which caused Duchenne Muscular Dystrophy), which has 79 exons, for 20x, 20x, 20x, 14x, and 5x plex PCR reactions in five tubes to detect underlying exon deletions. Conclusions MPprimer is a valuable tool for designing specific, non-dimerizing primer set combinations with constrained amplicons size for multiplex PCR assays.

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MgCl2 vs MgSO4 for PCR

jones 2009-5-19 16:28

(Text adoptedfrom www.protocol-online.org ) I often wondered, why some companies supply their PCR Ingredients with MgCl2 and some with MgSO4. Is there ANY difference between them ? -Fedex- Not much difference, won't affect normal PCR, where the key is the amount of available Mg2+. I think that SO42- might be useeful in methylation PCR, but I am not sure. -bob1- Recipes using Tris-HCl tend to use MgCl2, while recipes employing Tris-SO4/(NH4)2SO4 tend to use MgSO4. -tfitzwater-

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PCR常用优化策略

热度 1 jones 2009-5-2 12:33

(Collected from the INTERNET) PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时改变已知对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。 1、降落PCR（Touch Down PCR) 降落PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法，它不是用许多反应管和每管用不同的试剂浓度和循环参数，而是用一个反应管或一小组反应管，在适合于扩增目的产物而不得到人为产物或引物二聚体的循环条件下反应；设计多循环反应的程序，使相连循环的退火温度越来越低、由于开始时的退火温度选择高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平。这个策略有利于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中一直处于主导地位。由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在降落PCR中必需应用热启动技术。 当引物和模板的同源性未知时，降落PCR尤其有价值，当引物是根据氨基酸序列设计的简并引物时，或者扩增多基因家族成员时，或者想进行进化PCR时经常会碰到这种情况。编设降落PCR程序的目的是要设定一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃左右。目前大多数的PCR仪上都可以很方便地进行降落PCR。 2、加入增强剂 一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲胺酰（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100g/mL）等都可以作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。 3、Mg2＋浓度调整 Mg2＋浓度是一个最容易控制的参数，因为所有的浓度变化都可以在不同的反应管中同时进行。Taq DNA聚合酶的供应商现在除了提供标准缓冲液外还单独提供MgCl2溶液，以简化Mg2＋浓度的调节。一个典型的两步优化过程可以首先包括Mg2＋浓度增幅为0.5mmol/L的从0.5mmol/L到5mmol/L的一系列反应；当Mg2＋浓度范围缩小以后再做第二轮优化，采用几个增幅为0.2或0.3mmol/L的Mg2＋浓度。 4、优化退火温度 退火温度的优化首先要采用几种方法中的一种来计算引物－模板对的Tm值，其中最简单的方法是Tm＝4（G+C）+2（A+T），一个单一碱基的错配大约降低Tm值5℃。也可以采用更加复杂的公式，但实践中由于Tm值受缓冲液中各个成分甚至引物和模板浓度的不同影响，所以任何计算的Tm值都应该看作是大致值。进行退火温度的摸索时有一定间隔（2～5℃），从高到低直到低于Tm值5℃的一系列反应可以大致估计出给定条件下的最佳退火温度。 5、循环数和再扩增 增加循环数可以增强反应物的不足时的反应，但这样会导致产生假带以及富含单链DNA的高分子量成片产物。对于再扩增，总的原则是，如果第一次PCR反应在凝胶上见到条带，再扩增时只能用1l第一次PCR产物的1：104到1：105稀释物。 6、热启动PCR (Hot start PCR) 把PCR混合物在显著低于Tm值的温度下，哪怕是作简短的保温，也可能产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR方法则可以大大减少这些麻烦。其目标是在第一个循环中等温度升到超过反应物的Tm值以后才允许反应中的一或两种关键成分进入反应。例如在覆盖有矿物油的小实验中，所有反应管中的一种公用成分（如Taq DNA聚合酶）可以先不加，而到第一个循环的变性阶段温度超过80℃以后再加。 For more information, please visit: http://www.pcrstation.com/pcr-types/

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“每千美元测定一个人的基因组”——您有妙计吗？

biotrader 2008-10-5 11:52

目标：每千美元测定一个人的基因组 一、DNA测序发展综述 1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型以来，随着各种新技术和新理论的不断诞生，人类开始在分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，并由被动适应自然界转向主动改造和重组自然界。尤其是自1990年人类基因组计划正式启动，在美国、英国、日本、法国、德国和中国科学家的共同努力下，这项工作在新世纪到来之际提前完成，得到人类全基因组序列，标志着人类已从基因组时代步入后基因组时代。由于人类基因组计划的顺利进行，使得DNA序列数据库的容量呈指数增长，提供了以往不可想象的巨大的生物学信息量。在这些巨量的序列信息基础上，就可以在分子层面上探索人类健康和重大疾病的防治，开展生物技术在各个领域的应用，使人类生存的健康质量和预防疾病的能力发生革命性的飞跃。在这段时期生命科学的迅速进步得益于许多分子生物学新技术的不断涌现，而且很快就被广泛地应用。包括1975年Southern杂交方法的创立；1977年Sanger和Maxam、Gilbert先后发明了两种DNA序列的快速测定法；1980年基因合成仪的发明使核酸的化学合成从手工发展到全自动合成；1985年Cetus公司Mullis等发明的聚合酶链式反应（PCR）的特定核酸序列扩增技术；1992年Affymatrix公司Fodor小组原位合成制备了世界上第一块基因芯片；1995年第一台全自动核酸序列测定仪在ABI公司问世，这些里程碑性质的新技术对分子生物学的发展起到了重大的推动作用。 基因组学的迅速发展加快了DNA分析仪器的系统化和模块化进程，使多层次的基于DNA技术的综合生物学分析成为科研和临床工作的常用工具。尽管目前DNA分析仪器采用的技术原理基本相同，但存在主要设备功能单一，高水平仪器、配套试剂和软件等均来源于进口且费用高于市场平均价数倍等严峻问题。DNA分析平台包括寡核苷酸原位合成、PCR实时定量分析、DNA杂交和DNA测序等基本模块，既可单一模块应用，又可以组合使用。 近年来，随着电子科学与技术的不断进步，生命科学分析仪器也得以飞速的发展。最普遍应用的PCR技术从单一的定性PCR衍生出半定量、定量和实时定量等新的应用技术，相应开发成功了一系列用于高通量、高速的PCR仪以及自动化进行的实时定量PCR仪，而且实验周期从数个小时缩短至20～30分钟，极大提高了工作效率。基因芯片技术由于其高通量的先天优势，被广泛应用于科研工作的前期筛选，特别是原位合成技术的发展使早期仅能在芯片上制备20个碱基长的寡核苷酸发展到可以达到100个碱基长的寡核苷酸，有效的提高了芯片应用上的灵敏度和特异性指标，从而实现更高效的研究目的。DNA序列测定技术发展的更为广阔，Sanger技术的局限性（主要是对电泳分离的依赖和无法再进一步地并行和微量化）造成对高等生物基因组进行序列测定的规模限制和代价高昂，而新的利用酶促扩增和原位监测的基于合成法测序（Sequence by synthesis）的新技术单次运行已经可以达到4Gb的序列读取数量，且单位成本大大降低。以美国科学界和企业界为引领的研发活动有一个既定目标，那就是每千美元测定一个人的基因组。由于总体的技术门槛不高，目前已经有四种新型仪器投放市场，数个不同原理的技术和设备都在研发之中。 国内对于仪器设备的总体研究活动和实力相对偏弱。目前仅在PCR相关和芯片设备方面有所建树，但仍不能达到国际流行先进设备的技术水平。但是，从技术本质考察此类貌似迥异的设备仪器可以发现，其所涉及的技术方向不外乎温度循环控制、微量液流控制、光学信号探测、表面化学工艺、DNA相关的酶促反应以及高容量数据分析处理等几方面。 二、商业测序仪市场比较 国际市场主要为Roche公司（454/ Genome Sequencer FLX System）、Applied Biosystems公司（SOLiD System）和Illmina公司（SOLEXA/Genome Analyzer System）所垄断，加之2008年3月问世的Helicos BioSciences公司的HeliScope单分子测序仪，代表了国际先进的大规模DNA测序系统的技术水平和发展趋势，以下对其功能技术参数和预期成果做一比较。 GS 454 SOLiD SOLEXA HeliScope 单运数据产量 0.1Gb 1.5～3Gb 1.3Gb 7.5Gb 覆盖人基因组 0.1 1 0.5 2.5 平均读长（bp） 250～310 35 32 20～35 样品准备 2天 7天 11小时 未知 2天 运行时间 7.5小时 8天 3天 14天 精确度 99.5％ 99.94％ 98.5％ 99.4％ 设备价格 350万元 413万元 301万元 945万元 单次运行价格 14万元 2.38万元 2.1万元 12.6万元 日本滨松光子学株式会社 EMCCD 制造商 500张/秒 http://www.hamamatsu.com/ 三、基于De Bruijn 图的基因拼接 http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/velvet/ GPL下的自由基因拼接软件 http://genome.cshlp.org/cgi/content/short/18/5/821 原理文献 四、著名公司 https://www.celera.com/ 测序公司 Knome公司 个人基因组测序 https://www.23andme.com/ google创始人布林的妻子开的测序公司 欢迎各位读者发表能够降低个人DNA测序成本的奇思妙想，或和作者联系, 您的智慧将为全人类的健康做出贡献！ MSN：z_yubin AT hotmail DOT com

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PCR技术的发现历史

lifei 2008-7-6 00:00

PCR技术是体外大量扩增核酸序列的技术。人类基因组大约为30亿个碱基对，假设某基因A为2万个碱基对，在PCR技术发现之前，所有针对基因A的研究工作都同时对30亿个碱基对进行操作，因此研究工作举步维艰。PCR技术帮助研究人员特异性地大量获取基因A的2万个碱基对，研究工作变得简单，可操作性强。 发现PCR技术的穆利斯是化学家，获诺贝尔化学奖，但却是对分子生物学产生革命性影响。PCR技术有多么重要？两件事情说明，一是发明人被授予Nobel奖外，二是霍夫曼－拉夫什公司出资3亿美元购买PCR技术。 来看一下PCR技术发现的有趣历史，这些事情注定不会发生在中国。 1983年4月或5月，七叶树花开的季节， 穆利斯想到PCR原理的原型。当时他很奇怪，为什么这么简单的想法没有人想过？他问了许多人和在图书馆查了许多资料，确证这一想法的确没有人做过 1983年8月，穆利斯在西斯特公司正式作一个关PCR原理的学术报告，几乎没有人相信。仅几个实验技术人员有些兴趣 1983年9月8日，利用人体基因DNA作为模板，采用撞大运的方式进行了世界上第一次PCR实验，编号PCR 01，没有成功 1983年10月，进行了PCR 02号实验， 1983年圣诞节后，重复了PCR，改用简单的pBR 322质粒，后改用噬菌体（一种细菌病毒）系统为模板 1984年1月，用自己合成的长寡核苷酸做模板 1984年春，扩增人beta珠蛋白基因的58个碱基对，自己认为获得了成功 1984年6月，西斯特公司在加利福尼亚的蒙特雷举行科技年会，穆利斯与一个名为麦格根的科学家吵架，最后两人互相推搡和谩骂。凌晨1－3点，穆利斯打电话骚扰公司总载怀特，怀特让警卫强行带穆利斯去海边散步。 几周后，西斯特公司开会讨论是否开除穆利斯。原因，他的创新性想法几乎没有实现，在公司制造混乱，与实验室其他雇员发生性关系，拿枪威胁与他女朋友约会的同事，等等。最终决定，留下穆利斯，成立PCR组，给他一年时间完成PCR技术开发任务 1984年11月15日，PCR实验获得了成功 1985年3月28日，申请有关PCR的第一个专利 1985年9月20日，一篇关于PCR应用的文章关交《科学》杂志，11月15日接受发表。 1985年12月，一篇正式介绍PCR的原理的论文送到《自然》杂志，拒稿。所有作者都感到震惊。重投给《科学》，仍拒稿。他们认为只是技术革新类的东西。只好改投吴瑞为主编的《酶学方法》杂志。 1986年5月，穆利斯去冷泉港实验室举行的人类分子生物学专题研讨会上介绍PCR技术 1986年9月，穆利斯离开西斯特公司，得到1万美元奖金 1991年12月12日，霍夫曼－拉夫什公司出资3亿美元购买PCR技术。西斯特公司倒闭 1993年10月13日，穆利斯因发明PCR技术获诺贝尔化学奖。

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