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全细胞记录的液接电位liquid junction potential (2018-01-30 15:30:08)
zhouli08 2019-4-1 01:23
原发于新浪博客。 标签: 膜片钳 电生理 液接电位 liquid junction 分类: 神经科学或者说脑科学“—— 这几个为了liquid junction potential伤透了脑筋,看了一些技术资料,问了些人,终于想明白了! 膜片钳电生理使用的AXON公司的放大器700B,标准操作流程是,电极入外液之后,点击Pipette Offset。这时,系统减去了液接电位,以及其它影响较大的电位(金属与溶液等)。但是当形成全细胞记录之后,电极内液不再与外液有直接的接触,于是,之前的PipetteOffset的操作多补偿了一个液接电位! 假设液接电位是10 mV(以内液为零,外液是10mV),没有补偿之前,系统会检测到 - 10mV(axon系统以外液为零)。而当Pipette Offset之后,对于电压钳而言,为了让基线归零,系统给予一个-10 mV的钳制电压;对于电流钳而言,系统要注入正向的电流,使电压提高归零。 于是,形成了全细脑记录之后,电压钳的电压值会与(-10mV)叠加,即软件上给的是X电压,实际给的是X-10 mV;电流钳下记录到的电压也比实际值高,需要减去10mV。 感谢Axon公司的资料(AxonGuide; 700Bhelpmanual; Axonbit39; 技术支持Jeffrey Tang),以及中科院神经所师兄Jiang Man, LiTun的指点。 1.29.2018于旧金山
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研究侧前额叶的一点儿失败教训
热度 4 Joshua3769 2017-9-21 09:35
研究侧前额叶的一点儿失败教训 一年前,我博二刚开学。那时候我们将一个电极阵列成功地植入了动物的侧前额叶(上图红框所示)。手术很成功,一年过去了,电极阵列依然有大概三分之一可以采集到动作电位,不得不说这是一个令人愉快的例外,因为按照以往的经验,三个月以后电极阵列的信号就会变差。 但尴尬的是,纵然我拥有天时地利人和,我预期的实验结果却没有出现。这非常出乎我的意料,根据我的了解,侧前额叶的神经元动作电位发放率可以编码各种各样的信息,包括图形刺激、图形类别、任务规则、知觉决策、行为选择、工作记忆、时间长短、刺激顺序、注意、奖惩、联结等等信息,几乎是一个全能脑区,可谓大脑中最高级的地区。我想当然地认为,我所研究的内容也会在这个脑区出现,但经过至少四次不同的尝试,我没有得到我想要的结果。而我只是把电极阵列打在了侧前额叶的一个很小的部分,所以我还不能得出结论说:侧前额叶不能编码我想要的现象,只能说我所考察的部分不能编码。 预定的计划无法实现,而电极阵列信号又没有变得很差,所以我尝试用不同实验探索这个脑区,企图获得一些新发现,但正如科研领域中经常发生的一样,我能发现的都是别人已经发现过的或没有多少新意的东西,比如侧前额叶当前试次的动作电位能编码过去试次的行为选择、正确与否、刺激内容,也能在任务切换时编码当前进行的任务,这都不是什么新东西了。 虽然我没有发现新的现象,但我还是得到了一些成长和收获。 第一、我学会了在“耕耘以后没有收获”的状况下坚忍。我的确羡慕那些一入这行就收获得盆满钵满的人,如果我也能快速突破课题、顺利毕业,那该多好。不过每个人虽然都懂得如何去面对成功和顺境,却并非都懂得面对阻碍和停滞,而这才是更具挑战性的课题。我为当前科研上的停滞不前而感恩,我的信仰给我力量在“不结果的年份”不至沮丧和惊慌,让我以积极的态度面对自己的处境,接下来会面临什么我不知道也无法预测,但我知道我所信的那位必为我预备道路。 第二、我们将要观察到的会比论文表面所呈现的要复杂得多。这是理所当然的,但并非人人都会把这当作一个警示,从而促使自己在阅读论文时带着警惕或敏锐的判断,以及对研究过程的设想和发问,没有这些积极深入的阅读习惯,我们很可能被论文的表面结果所满足从而对真实的研究对象产生误解。以侧前额叶为例,研究的论文一大堆,结果也很丰富,当我把许多论文阅读完以后,在头脑中形成了一个对侧前额叶的大概印象,并且形成了一个对自己的实验的预期,但当我自己真正开始采集数据时才发现,我的电极阵列下面所记录的神经元编码的内容不均质,以至于当我想寻找编码同类信息的神经元时,我能找到的数量非常少,无法进行统计,也不方便写入论文。这与低中级视觉皮层不同,同一电极阵列下的细胞基本上编码相近的信息。我后来的反思是:我没有仔细推敲别人的论文背后所面临的困难以及所暗示的这个皮层的复杂性。既然这个脑区可以编码各种东西,那么我的电极阵列一旦打下去,很可能不同电极下的细胞编码不同事物,最后就无法统计。如果我当初能想到这个难处,并且重视这个难点,我当初就不至于到侧前额叶来开辟战场。了解研究对象的各种复杂性是很重要的预备。 第三、传统的研究手段可能无法帮助我们有效理解侧前额叶。侧前额叶的第一个特点是神经元的动作电位发放率具有严重的变异性,我往往需要150个试次的数据才能绘制出一条比较可靠的PSTH曲线,这也为神经解码带来了阻碍。为什么这个脑区的变异性如此严重?这种变异的源头是什么?我的初步猜测是:因为每个试次中神经元都同时编码了当前的多种信息以及过去试次的一些信息,所以变异很高。第二个特点是缺乏明确的感受野。研究FEF和VPA的人都或多或少能在视野空间中为所记录的细胞找到一个有限的感受野,并有办法绘制出一个边界来,但我所记录的侧前额叶没有明确的感受野。一些细胞有对视觉刺激响应最强烈的视野位置,但能区分两个刺激的位置却在视觉刺激响应较弱的位置,一些细胞对全屏响应,一些细胞对半侧的屏幕响应(见图二),但对另一侧也有较弱响应,总之,我无法用椭圆来绘制感受野。第三个特点是大杂烩。一个电极下的细胞可能编码工作记忆,但它旁边的电极下的细胞可能不编码工作记忆,而是编码运动方向(见图三),再旁边的一个可能会编码目标位置,我无法看到这样的理想情景:编码运动方向的电极在一处,编码目标位置的在另一处。我的48道电极相当于许多不同种类的水果散乱摆放,这使得统计难以进行。所以侧前额叶是不是真的在功能组织上是散乱的、没有规则的?如何能描绘出一个侧前额叶的清晰拓扑图来?如果我们不清楚在侧前额叶的哪个位置集中埋藏了编码哪些信息的细胞,我们植入电极时便会非常盲目。第四个特点是PSTH不规则。我说不规则是与视觉皮层相对的,视觉皮层的PSTH一般先有一个initial peak或dip,然后逐渐走向平稳,但侧前额叶有的电极下的PSTH形状五花八门。研究视觉皮层时,有时人们会直接计算一段时间内的spike总量在两个条件下是否有差异,但在侧前额叶,有的细胞在总量上没有显著差异,而在这段时间内的PSTH波形却显著不同,这使得许多传统的电生理数据呈现方式无法得以运用。第五个特点是难以发现有些细胞的功能。有些电极信号本来还不错,但绘制出PSTH后无法区分我所尝试的任意两种条件,有人认为脑子里本来就有很多这类不具有区分力的细胞,但我在V4的电极阵列并没有遇上,而在侧前额叶则比较多,而且相对集中在电极阵列的右上侧,所以我怀疑是我们的研究方法不足以显示这群细胞的功能。假如我们说每个试次都会导致视觉皮层喊一嗓子,那么在侧前额叶则可能是要唱一首歌,一个试次的信息可能会在这个脑区反复流窜,对于这样一个脑区,研究视觉皮层的传统手段不再管用。 尽管有许多人研究了侧前额叶,但这个脑区至今没有被划分出明确的小区域来,各种不同的信息如何在这里进行整合?这里又是如何在整合信息以后指导行为、指导记忆或指导其他高级脑区对感觉皮层进行自上而下的影响?这些问题如果不能回答,我们无法理解侧前额叶的功能和工作机制。
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动物大脑神经元活动胞外记录经验总结
热度 2 Joshua3769 2016-4-1 00:23
动物大脑神经元活动胞外记录经验总结 动物 装 chamber 实验动物异氟烷麻醉状态下实施开颅,移除 实验 目标脑区的颅骨 (勿动脑膜) ,留出圆形开孔,在开孔上通过牙科水泥和小螺钉将一个钛合金的 chamber 固定在开孔处,然后拧上 chamber 盖子 ,缝合皮肤,恢复一个月,期间注意观察是否感染,若有化脓,可以注射 3 天 头孢或撒上磺胺晶体。 动物预备 Chamber 如果保持 3 天以上不开启, chamber 脑膜表面就会生长出息肉和血豆腐,因此在 chamber 安装后第一次开启 chamber 时需要清理 chamber 。清 chamber 主要用脑膜刮勺轻轻地刮脑膜表面,直至露出微白色、平整光滑、富有弹性的脑膜。整个过程需要在无菌环境下操作,第一次清理耗时长,需要在用氯胺酮麻醉的状况下清理。每天实验前都要进行这个操作。 频繁刮脑膜会刺激脑膜增生,因此在实验一段时间以后可能会出现脑膜增厚、电极穿刺时弯折的情况,此时就需要来一次撕脑膜的过程。需要将动物在手术台上用异氟烷麻醉,然后在立式显微镜的辅助下观察脑膜的增生状况,然后用刮勺与小镊子清除多余的脑膜。增生的脑膜在显微镜下是纤维状,纵横交错,不平整,韧性大,比较坚硬。刮的时候需要在边缘处刮开一个小口,然后用镊子夹住口子,用刮勺向上撩拨,直到一大片脑膜被拨起来,然后用眼科剪剪掉,露出平整的脑膜。注意刮勺不要向下用力,以免捅破脑膜,也不要用镊子撕扯,以免撕开脑膜。整个过程需要耐心、细心和手感。 神经元活动记录与采集系统 神经元电活动胞外记录主要采集神经 spike 信号,电压在数十个毫伏左右。采集信号时将包裹有玻璃的金属电极刺破脑膜扎入脑膜下,神经 信号传入电极,电极信号经 headstage ,前端放大器,然后通过光纤传给 BlackRock Cerebus (一台信号采集设备), Cerebus 将信号通过以太网线传给用户电脑,电脑中配套的 Cerebus Central Suit软件 可以呈现信号,用户也可以通过该软件来选择、观察和存储信号。 - headstage 玻璃金属电极在使用前需要将尖端浸泡在生理盐水中测电阻,电阻在 2-5 兆欧可用。此外还可以辅助以显微镜下观察,能看到尖端是否弯折,一般尖端如削尖的铅笔。电极扎入脑前需要先用酒精浸泡 10 分钟消毒。 电极需要用 guid tube 来引导扎入, guid tube 能保护电极尖端在用手操作时不至因碰触而折弯,也能在电极扎入脑时起到一定的支撑作用。 Guid tube 可以用长长的针管制作,需要刚好插进去电极。 Guid tube 在使用前也要消毒十分钟。 Guid tube 和电极需要安装在 NAN drive 上, drive前端 是一根铅笔样的不锈钢杆子,能以缓慢的速稳定地推进电极, drive 连在 NAN 主机上,主机与用户电脑通过 NAN 软件交互,用户可以通过软件控制 driver 的推进速度。 Driver 通过 adaptor (一个自制的环形金属部件,能套在 chamber 上固定)固定在 chamber 上。 Chamber 、 Adaptor 、 Driver 、电极,都固定在了颅骨上,因此能稳定地推进电极。据说某些情况下为了防止电极随脑膜的轻微震动,可以在chamber中灌注琼脂,起到压抑脑膜振幅的作用。 前端放大器能将微小的信号放大,因此在电极下行过程中和采集过程中如果需要用手碰触电路,需要关闭放大器操作,以免烧坏放大器。 Headstage 上有电极 channels 孔,也有 GND 和 REF 孔,即地线和参考电极。如果只扎一个电极,则需要将一个 channel 与电极尾相连, GND 与远离 chamber 的其他躯体位置相连, REF 可以连在 guid tube 上, guid tube 的尖端要碰触到脑膜,可以在chamber内滴入生理盐水,保证tube和脑膜稳定联通,如果tube和脑膜之间很近,一会儿贴住一会儿松开,会带来规律振荡的噪音,可以把tube往外一些,使二者不要太近。此时,电极与地、 REF 与地就形成两个电压,二者之差就是神经活动电压。 电极如同天线,对空间中的电磁波很敏感,如前端放大器电源发出的辐射、附近台灯发出的辐射、红外灯发出的辐射等、即使将一个金属靠近电极,也能将空间的电磁波引导投射到电极。因此需要在电极和 driver 周围加铜网来屏蔽,铜网与 GND 相连,也需要把铜网接实验室的地,铜网可以做很大,完全罩住动物脑袋及周围,方便省事。注意不要让铜网与电极、 REF和drive杆子接触 。 Driver 的 NAN 主机后面的环形细线要悬空,外壳要接地,否则会带来很大的噪声,通过 Driver 的控制线传递到电极。为了使外壳良好接地,可以用锉刀搓掉一部分外壳漆皮,将裸露部分和实验室的地用铜网贴合 。给动物提供 water reward 的电磁阀在开合时能引发巨大的磁场变化,带来虚假的 spike 信号,可以考虑用厚的铁磁盒子隐藏电磁阀或将电磁阀拉远。 信号采集过程 1、 将动物 chamber 打开,清理 chamber ,露出脑膜。滴入几滴生理盐水。 2、 在 chamber 上安装 adaptor 。然后将动物推入记录室(屏蔽室)。 3、 将酒精浸泡过的电极和 guide tube 连到 driver 上,再将 driver 拧到 adaptor 上,然后将 guide tube 用镊子往下推,直至碰触到脑膜,可以发现能弹回来 。 4、 插上 driver 控制线,将 headstage 上的 channel 、 GND 、 REF 分别连到电极尾巴、离 chamber 远的某个躯体位置和 guidetube 上。 5、 罩上铜网,铜网连 GND以及实验室地 。 6、 打开前放和 NAN 主机,打开 Cerebus 软件和 NAN 软件,一边观察电极信号变化一边推进电极。 7、 当电极进入脑膜并靠近细胞时,噪声在 35mv 以内,同时能看到有 spike 波形 。如果将 cerebus 主机与 audio 联通,还可以通过 audio 的声音来考察 spike 。 Spike 的声音比噪声大,很短促,发出 pu pu pu 或 pa pa pa 的声音。一般细胞都有自发放,所以只要电极扎到脑中,大多数情况下是可以听到较为频繁的 spike 声音的。 8、 实验结束后,缓慢退出电极。将电极浸泡水中一夜。动物 chamber 清理后,拧好 chamber 盖子,放回笼子。
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与细胞亲密接触
小水獭 2010-11-26 02:55
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个人分类: 活色生香de生物科学|4266 次阅读|3 个评论
为什么眼睛里的感光细胞在有光的时候反而不兴奋
热度 1 小水獭 2010-9-28 10:17
为什么眼睛里的感光细胞在有光的时候反而不兴奋 一开始学习视觉机制,最搞的一点就是视感光细胞在暗条件下细胞内极化,膜电位上升,突触递质释放比较多。而在有光的时候,反而超极化,突触递质释放减少。以前我的理解是“暗”才是刺激信号,但是还是不那么解释的通。 过了一年,我忽然想起以前做大脑神经元的时候,神经元之间如果没有信息传递的‘休闲时间’,突触前细胞会有随机的递质释放,时不时丢给下级神经元一个数据包。以前我的理解是,这是大自然的“不完美”。但是现在我认为,这些低量的递质释放是有积极作用的。这个功能就是维持与下级神经元的联系。当有有价值的信息需要传递的时候,有畅通无阻的道路。 但是这个养兵期也是需要耗费能量的。进化肯定会选择大多数时间突触递质小泡释放量少。对眼睛来说,大部分时间是有光信号输入的,所以眼睛采取一种大部分时间省能量,小部分时间耗能量来编码视觉信息。所以有光的时候,反而突触释放量变少。当黑点黑线进入视野时,眼睛启用高能量来编码视觉信号。 以上的讨论是限于视锥细胞。眼睛中有两大类感光细胞:视杆细胞和视锥细胞。在夜晚和黎明的极弱极弱的光亮下,主要是视杆细胞发挥作用。而在清晨直至傍晚人主要使用的是视锥细胞,视杆细胞已经饱和失活。可以这么说,视锥细胞活动的期间,是始终处于中等以上偏亮的时候,即始终处于亮环境下。 陆绮 2010-09-27 ========================================================= 这是一个旁门左道的想法,和主流观点是不一样的。主流观点认为“光抑制”的机制是为了提高信噪比。但是我任然保留在我的博客中,也许是错的,但是这毕竟是我自己想出来的。
个人分类: 活色生香de生物科学|9496 次阅读|5 个评论
剑道空手道离子道
热度 1 小水獭 2010-1-3 16:36
剑道 空手 道 离子道 通道所对应的英文词汇是 Channel 。刚拿到 Bert Sakmann Erwin Neher 合著的 Single-Channel Recording 时,我误以为是记录单个离子通道的教材。看了前言才知道,这里的单通道( Single-Channel )的意思是记录电极是单个的。将一个记录电极插入细胞,来记录活细胞的电生理活动,是为单通道记录。 在前言中,作者谈到了 Channel (英文), canal (法文), Kanal (德文)都来源于拉丁文 canalis 。 Canalis 在拉丁文中的意思是一根充满水的管子【 a small water-filled tube or pipe 】。 Channel 这个词在埃及人语言中,与特指用于制造书写纸张的芦苇 reed 相近。而更加有趣的是, canon 【 a set of rules that have reached the status of official truth 】用以接近真理的一系列原则准则,在词汇起源上是多么的相近。 回到中文的道。道理朝闻道夕死可矣道高一尺魔高一丈这些道,和其他文化起源的 channel 是那么的相像。都是在前人,或是同时代的他人工作的基础上,使每个普通人有了一条途径去了解世界、自然、历史、其他人以及自己。人生道路也有许多种,比较主流的有:红道黄道和黑道。红道就是政治(五星红旗,党旗的红色),黄道就是经济(黄金就是黄澄澄的),黑道么,嘿嘿嘿,就是学术啦(博士帽博士服不都是庄重的黑色么?明辨是非的白纸黑字。水墨诗画的墨水色也即是黑色。)小水獭么,目前就是黑道中一只傻乎乎滴小白(小白=小白痴=菜鸟)啦。 再回到 single-channel recording 。我觉得这个技术简直太棒太神奇了。它直接记录活色生香的鲜活细胞,通过获得活细胞的电生理数据这一条途径来获知活细胞在各种条件( conditions )下面的反应以及变化。
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GMT+8, 2024-4-19 17:37

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