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丝状真菌的生物矿化----菌丝的草酸钙结晶: Macrofungi 2013-11-13 22:30; 双孢蘑菇菌丝的草酸钙结晶过程和形态特征 1887 年， Bary 描述并阐明了四孢蘑菇菌丝的草酸钙结晶情况， Bary 指出：这些沉淀使菌丝呈现“ … 一个垩白的外观”，从他对这些结晶的手绘结果，我们可以看出：长长的一根菌丝上面有类似于针尖状的结构，这些结构与培养料上生长的菌丝上发现的结晶物比较相似。虽然说真菌细胞壁沉淀矿物质是比较常见的事情，但是，众多关于真菌结晶草酸钙的潜在作用还没有得到确切的答案：钙离子和草酸根离子是如何通过菌丝转移的？是什么促使在菌丝细胞壁上的结晶的发生？真菌结晶草酸钙在森林生态系统中的作用是什么？双孢蘑菇是一种重要的商业栽培蘑菇，与四孢蘑菇比较接近，同样在菌丝上也发生着草酸钙结晶簇。 Eger （ 1964 ）对双孢蘑菇氧分泌与担子形成做了研究，同时通过远红外光谱分析指出，双孢蘑菇菌丝上具有二水合草酸钙。 Wood （ 1985 ）描绘了双孢蘑菇的各种超微结构，详细的提及了菌丝上的草酸钙结晶沉淀情况。尽管目前有大量的关于双孢蘑菇菌丝结晶草酸钙的研究报道，但还没有关于草酸钙沉淀发育过程的有效研究。本文主要通过观察自然条件下或人工培养基上双孢蘑菇菌丝上草酸钙的形成过程，鉴定发生的草酸钙结晶晶种，并探讨这些结晶的可能功能。图版：图 1,2 稻草上的双孢蘑菇菌丝。 1 ，空气自然干燥后进行扫描电镜观察，显微观察显示，菌丝上呈现出大量的结晶物，像“奶瓶刷、试管刷”一样，标尺 10um ； 2 ，对生长在谷物上的菌丝进行低温断裂显示，生长结晶的菌丝生长在谷物果皮（ P ）的外表面，注意生长在果皮内部的菌丝，标尺 10um ；图 3,4 麦芽膏培养基上的双孢蘑菇菌丝扫描电镜照片。 3 ，能谱显微分析，对菌丝上面结晶物进行线扫描，横线表明电子束的移动路径，竖点表明随着扫描线上的钙离子浓度含量变化，标尺， 1um ； 4 ，气生菌丝上的草酸钙结晶物沉淀，菌丝上呈现大量的结晶物，结晶物与菌丝呈相切方向。箭头表明的可能是一个双晶体，标尺 10um 。图版：图 5-7 ， AC 培养基上双孢蘑菇菌丝的扫描电镜照片 5 ，双孢蘑菇气生菌丝上生长的长结晶早期生长情况，注意（括号内）菌丝细胞壁中隐匿着小的结晶体，标尺 1um ； 6 ，片状结晶的早期生长情况，标尺 1um ； 7 ，片状结晶，注意，片状结晶的大小，角度和沉淀重叠情况，标尺 1um 。结果：在麦芽浸膏培养基上，双孢蘑菇菌丝在 3 周的时间内长了大约 125px ，菌落由丰富的基内菌丝和稀疏的气生菌丝组成，偶尔，有菌丝表现出缕状，气生菌丝在某种程度上呈现垩白色，用体式显微镜进行仔细的观察发现，菌丝上面具有纤细的，长的结晶物。当通过一个正交偏光显微镜进行观察时，其表现出弱的双折射现象。当菌丝在营养丰富培养基上生长时，气生菌丝表现出不同的两种区域，一层是结晶物丰富的菌丝层，通过菌丝连接到培养基表面，另外的就是琼脂表面的松散交织状无结晶菌丝物。谷物培养基上的菌丝结晶情况和琼脂培养基上结晶情况极为相似。谷物培养基上的双孢蘑菇菌丝扫面电镜结果显示，结晶菌丝层覆盖在谷物的表面（图 1 ），谷物内部的菌丝似乎不产生结晶（图 2 ）。贴伏在谷物表面的菌丝通常也不产生结晶，这样的情况和 ME 琼脂培养基上类似。通过化学方法固定的谷物上的菌丝结晶比自然干燥的处理的样品上的结晶浓密程度要小，似乎是液体固定和脱水处理使一些长结晶脱落或损坏。在 ME 琼脂培养基上，扫描电镜照片显示，菌丝表面具有长的、针尖状到扁平状的结晶物。每单位菌丝长度上的结晶数量变化不一，一些位置非常多，而其他一些区域又极其松散。在图 4 中，几乎有超过 125 个结晶物（结晶体）存在，长的结晶有超过 10um 长， 0.2 到 0.5um 宽。偶尔也有双晶存在。结晶在菌丝上的位置有一些变化，现行的结晶与菌丝的长轴走向相垂直，且相切与菌丝的表面。琼脂表面的菌丝通常缺少结晶，而气生菌丝通常具有丰富的结晶簇。 X 射线显微分析证实结晶沉淀物种有钙离子的存在。 AC 培养基中菌丝上首先形成的结晶物和 ME 培养基上形成结晶物类似，都是有长的、尖状结晶组成（图 5 ）。结晶形成的最早期（图 5 ）显示，在菌丝细胞壁里面隐匿着一些结晶物，这一些幼嫩的结晶物相当的小，长度小于 1um ，宽度小于 0.1um ，随后，结晶在长度上开始变大，并在一定程度上相切与菌丝的表面。随着持续的增大，结晶物整个从菌丝表面分离出来。另外也有一些，长的、大的、片状的结晶形成于菌丝的表面（图 6,7 ）。片状菌丝的早期阶段表明他们是由细长的形式逐渐变化而来。片状结晶非常薄，波浪状到周角状的边缘，并且经常堆叠在一起形成大的聚集体（图 7 ）。对于不染色的切片进行透射电子显微镜观察显示，草酸钙结晶沉淀为电子不透明区域，其紧贴在菌丝体上。 ME 培养基上生长的菌丝在细长的腔室中有电子不透明沉淀（图 8a ）。而在 AC 培养基上，经常包含部分电子不透明扇形腔室（图 8b ）。超薄切片染色结果显示， AC 培养基上生长的菌丝具有大的片状结晶腔室，沿着晶体的四周扩张（图 9 ），在 ME 培养基上形成的晶体更加典型，典型的晶体同样也存在于 AC 培养基上。切片发现，这些晶体紧贴的或隐匿在菌丝的细胞壁上（图 10 ）。晶体看起来开始于具有一个中心的电子致密的矩形区域斑块（图 11 ），尽管大的片状结晶沉淀被一个单一的鞘环绕着，他们看起来是由单一的亚单位组成，（图 12 ），菌丝的细胞壁通常情况是薄薄的，由结晶腔室层所包裹（图 8a ， 9 ）。 X 射线能谱分析显示， ME 培养基菌丝上形成的结晶为二水合草酸钙。图版，图 8 ，双孢蘑菇透射电镜不染色结果。 8a ，麦芽浸膏培养基，注意长的晶体腔室（ c ）相切与菌丝表面（ h ），腔室中间的电子不透明片状结晶沉淀，标尺 1um ； b ， AC 琼脂培养基上，结晶腔室中的电子不透明物质（ c ）是结晶残余物，注意腔室中的条状分割形式， h 是菌丝，标尺 1um 。图版双孢蘑菇结晶透射电镜染色照片，图 9 ，一个气生菌丝和膨大结晶腔室（ c ）切片，有一个薄薄的鞘（箭头所指）覆盖在整个晶体腔室表面，标尺 1um ；图 10 ，杆状结晶腔室，电子密集层表明菌丝周围环绕着结晶腔室，标尺 1um ；图 11 ，结晶腔室和包被的鞘，标尺 1um ；图 12 ，高放大倍数下面，可能的早期结晶体，菌丝细胞壁外层电子密集物质环绕的一个矩形空白区域，标尺 0.1um 。讨论：双孢蘑菇菌丝细胞壁上形成的结晶物和 Arnott （ 1983 ）所描述的木腐担子真菌菌丝结晶物类似。双孢蘑菇菌丝上开始形成结晶以后，结晶物就开始向细胞壁外侧生长，逐渐形成一个类似的菌丝保护鞘。这样的菌丝鞘是否会扩大覆盖于整个菌丝还不太清楚。通过 TEM 对一些结构的研究发现有一些破裂的鞘，但不清楚这些破裂是自然状态下就是这样还是实验操作人为造成。双孢蘑菇气生菌丝上结晶的基本形式是长长的棒状结构，环绕生长在菌丝的一周，这种结晶形式是 ME 培养基和谷物培养基上双孢蘑菇菌丝结晶的主要形式。一些结晶特别是那些纤细弯曲的结晶体通过扫描电子显微镜进行了详细的观察分析，对于弯曲的结晶体而言，似乎是由于电子束的轰击所致，而并非是正常的结晶形态。双孢蘑菇菌丝细胞壁中结晶腔室的精确起源还不太清楚，但这似乎与菌丝细胞壁外层的电子致密区域有一定的关系（图 11 ），这些区域在结晶形成过程的准确角色仍需进一步研究。在营养丰富的培养基上，菌丝上所形成的片状结晶可能是从基本的棒状结晶体生长而来。无论是棒状结晶体还是片状结晶体都是以环周形式存在于菌丝上，所以可能的结论是结晶的形成倾向于形成于菌丝的表面。当棒状结晶体继续生长，对大部分结晶而言是在在长度上伸长形成长棒状结晶体，而如果在长度和宽度上都持续生长的话就会形成片状结晶体。草酸钙结晶将形成何种结晶体的机制不太明了，但这个过程可能如 Cody （ 1984 ）所述。 Cody 认为，草酸钙的结晶体的变化行为可能是由于化学杂质阻止了特定晶面的生长定向生长，因此导致没有超大的晶体的形成。从这个理论可知，双孢蘑菇的片状结晶体可形成有边缘的面状体，这样的面状体的表面是“不纯净的”，以至于晶体在厚度上没有或很少有变化。双孢蘑菇形成草酸钙结晶沉淀可能有几个功能，水玉霉目孢子囊上草酸钙结晶沉淀被认为是为其提供一个疏水层（ Buller 1934 ），双孢蘑菇气生菌丝当然也是疏水结构，以至于我们气生菌丝进行做电子显微镜前处理的固定过程中湿润菌丝时遭遇到大的困难。自然状态下，这样的疏水现象可以保护气生菌丝免受水浸的伤害，保持一个干燥的气生菌丝状态同时可以免受细菌和其他真菌的侵袭。另外的可能的功能是，这样的结晶沉淀可以组织节肢动物的侵袭，如 Thompson （ 1984 ）所述，气生菌丝表面形成草酸钙结晶沉淀，可以在一定程度上形成一个物理屏障，保护菌丝免受掠食。虽然对于高等植物中形成的草酸钙沉淀的普遍解释是移除草酸根离子（ Frey 1982 ），但仍有人普遍认为草酸钙的结晶是移除钙离子或钙离子的脱毒作用（ Arnott 1982 ， Borchert 1985 ）。事实上，最近有科学家指出，生物矿化可能是生物体在古海洋环境下清除体内有毒的高浓度钙离子的一种进化机制，正常的细胞内钙离子浓度是比较低的（ 10 -8 ~10 -5 M ），钙离子的脱毒效应似乎是真菌形成草酸钙结晶沉淀的一种原因。 Whitney （ 1986 ）认为，接合真菌草酸钙结晶沉淀可能是一种钙离子脱毒效应，双孢蘑菇草酸钙结晶沉淀也可能是降低环境中的钙离子浓度。真菌降解外界物质时毫无疑问的需要在微环境中释放了大量的相关离子，进一步而言，既然很多真菌酶解外来物质，控制菌丝周围微环境的离子浓度似乎是有必要的，以确保酶的最大活性。通过从环境中转移钙离子到气生菌丝，进而将钙离子以草酸钙的形式整合起来，以至于钙离子的浓度以及其他潜在的毒害效应得以有效的降低。点评， 1. 真菌草酸钙结晶不算是一个特殊的过程，很多物种都有草酸钙结晶现象，如双孢蘑菇，鬼伞，裂褶菌，木耳以及一些菌根真菌等，子囊菌，担子菌，接合菌都有。 2. 草酸钙不溶于水，在常规的制片显微观察可以很容易发现。不过也很容易被忽视。 3. 结晶体的形式也多种多样，有片状，长棒状，八面体型，四方体锥形等。菌丝上常见的是长棒状，片状和四方体锥形，子实体上似乎锥形占主要。 4. 除了菌丝结晶外，另一个常见的结晶区域是担子真菌的囊状体上结晶。对于囊状体上结晶功能推测，疏水作用可能是首当其冲。但情况并非这么简单，研究发现，没有菌丝的玻片上或菌丝周围的培养基上同样存在晶体，这似乎又是由于草酸离子和钙离子的外排凝集所致。 Whitney, K.D., H.J.Arnott. （ 1987 ） Calcium oxalate crystal morphology anddevelopment in Agaricus bisporus . Mycologia . 79(2):180-187; 个人分类: 科研笔记|11057 次阅读|0 个评论

羊肚菌菌丝培养研究: Macrofungi 2013-11-4 20:31; 普通羊肚菌单孢分离物的培养研究 Annette Hervey（1978）Cultural Studies of Single Ascospore Isolates of Morchella esculenta 如普通羊肚菌（ Morchella esculenta ）一样，尽管羊肚菌的种类繁多，在自然环境可以形成子囊果，但在可控的实验条件下还没有成功的栽培报道。实验室的研究通常都是开始于菌柄部位组织分离得到的菌丝，结束于培育健壮的营养菌丝阶段。羊肚菌营养菌丝的形态学、细胞生物学和营养特性是最为人们所熟知的。菌丝由隔膜隔开，每个细胞有多个细胞核。可以形成菌核结构，对于羊肚菌无性孢子的首次报道，也是唯一一次发生在 1904 年， Molliard 的研究报道，迄今别无他人，也无法证实（注：作者发表本文是在 1987 年）。普通羊肚菌营养菌丝的营养需求有大量的文献支撑。羊肚菌子囊果个体发生的研究只能通过对采集到的野生子囊果进行分析。 Greis （ 1940 ）的观点认为：胞质融合发生在子囊果发育的晚期，例如：子囊形成前的子囊层亚层细胞中，形态学分化的细胞进行融合，进而形成一个短的产囊细胞，产囊细胞中具有配对的细胞核（这里并不清楚是否在这两个融合的细胞之间只能形成一个子囊）。产囊菌丝的顶端形成子囊细胞，这里并不形成钩状细胞（锁状联合）。子囊的细胞学发育过程和其他子囊菌一样，形成八个子囊孢子。 Falck （ 1920 ）和 Buller （ 1934 ）对子囊孢子的释放进行过研究。本文将对羊肚菌的培养特性进行深入的分析，包括观察来自不同子囊果的单孢分离物的培养特性。本实验所用的子囊果采集自 1966 年和 1967 年春季的三个地点，三组被标记为 GB ， B 和 K 。每个地点都收集有多个子囊果。采集的子囊果在潮湿的盒子内放置几天时间，以便其成熟，之后通过在琼脂平板上约 1~3cm 处悬挂一块菌盖组织保持约 1~30 分钟，在琼脂平板上得到自由弹射的孢子，之后琼脂平板进行 24 小时的培养观察，每一组收集 25~30 个单孢萌发菌丝物转移到 PDA 斜面培养基上保存备用。子囊孢子的萌发试验：迄今对孢子萌发还没有相关的培养知识，因此对 GB 组进行多种培养基筛选萌发试验。包括 2% 麦芽浸出物琼脂培养基， 0.3% 酵母浸出物滤纸琼脂培养基和 2% 的细菌琼脂培养基。培养温度为 8 和 20 摄氏度， 24 小时之后进行检查分析。孢子在前两种培养基上， 20 摄氏度的条件下，能实现百分之百的萌发。 B 和 K 组的孢子在 2% 的麦芽浸出物琼脂培养基上， 20 摄氏度培育 24 小时之后也能达到将近百分之百的萌发率。 GB 组的菌落特征：这一组得到的 25 个菌株表现被证明是不太正常的， 25 个菌株在继代培养之后并不能很好的生存下去。例如，他们表现出有限的生长潜能。为了精确的验证每一个菌株的生长受限情况。 25 个菌株中的 19 个菌株进行了“测速管”培养试验，从接种第二天开始进行连续 17 天的观察记录。 19 个菌株之间，其中有 3 个不能生长， 2 个有一丁点的生长，剩余的菌株以每天 12~14 毫米的生长速度均匀的生长，直到第 11 天。这些菌株之间， 3 个菌株从第 11 天开始到 17 天，生长速度变慢；剩余的以先前的速度持续生长。对连续培养的菌株在停止生长时候，对菌落的边缘的菌丝进行显微观察发现，对比终止生长前的菌丝而言，菌丝顶端的细胞壁依旧完好，但是缺乏细胞核和细胞质。菌丝的生长终止是一件令人费解的事情，如果以线性生长速度作为是生长指数，生长速度减缓是不连续的，毫无规律可言。然而，如果用生长密度作为生长指数，生长减缓就变得更加有规律可言。在菌丝线性生长终止之前的这一阶段内，菌落密度稳定性的下降是由于菌丝分支或短分支频率的降低所致。 B 和 K 组：上面这种生长受限的情况使得 GB 组菌株不能用于后续的任何出菇试验。因此，在第二年，获得了 B 和 K 组 210 个单孢菌株，这些菌株没有表现出生长受限的情况，但也没有一个产生子囊果。为了确定是否单孢培养物不育是由于异核体真菌的自我不亲和性所致，我们做了几百组配对试验，这些配对杂交包括：子实体内部群体杂交，例如：来自于相同子囊果的单孢群体之间的杂交；子囊果之间的杂交，组分内的杂交和组分间的杂交。尽管没有任何一组形成子实体，但当两种类型的菌落相遇的时候出现同一种反应形式。如果配对的两个菌落是同一个单孢培养物，菌落交接处就和菌落的其他部位没什么两样（图 1A 和 D ）；在所有的非自我反应中，在菌落的交界处气生菌丝就会集结形成栅栏组织，无论是来自同一个子囊果（图 1B 和 E ）、还是不同的子囊果的单孢分离物之间（图 1C 和 F ）。这样的结果表明， 1 ）子囊融合的细胞核是具有一定遗传因素的杂合子， 2 ）单个子囊果得到的子囊孢子并非都是形成自相同配对的细胞核。其他的一些菌落特征：我们的细胞学观察也表明，菌丝是有隔的，多细胞核的。在所有的菌丝培养中没有观察到分生孢子或其他任何形式的无性孢子。尽管很多菌株都形成菌核，但菌核的大小和数量变化比较大。菌丝类型可以明显的区分两类： 1 ）绒毛状菌落类型，（图 1A ），特点是毛绒绒的气生菌丝； 2 ）颗粒状菌落类型（图 1D ），特点是气生菌丝比较少。在所有的单孢培养物中，这两种类型的数量是持平的。在不同的子囊果得到的群体之间，这种表型不尽相同。一些子囊果进行成绒毛状菌落的单孢群体，一些子囊果得到的单孢群体这两种类型的菌落接近一比一，而另一些子囊果得到的单孢群体大多都是颗粒状菌落类型。这样的结果再一次表明（但不是证明）普通羊肚菌在某个生活史阶段形成异核体。没有单一子囊得到的子囊孢子的分析，因此就没有关于异核体更进一步的结论。通过各种自然和合成培养基，以及在不同温度下进行培养，都没有得到任何子囊果。这种阴性的结果，对比为数不多的半人工栽培报道表明，我们在可控的实验室条件下还没有执行羊肚菌出菇的所有必须条件。众所周知，羊肚菌出菇发生冷气候区域带内，在春季的一个很短暂时间内当土壤温度回升到 10 摄氏度的时候。如果像我们实验结果表明的那样，子囊孢子并没有休眠阶段，他们可以在土壤温度在夏季达到 20 摄氏度的时候萌发和生长，菌核经历寒冷的冬季，在来年春天来临的时候，作为能源供给组织为出菇提供营养。我们没有通过试验获得子囊果的发生，因此不能得出到底普通羊肚菌是同宗结合还是异宗结合。总结与点评： 1，孢子萌发率。合适的培养基 20 摄氏度培育，普通羊肚菌的子囊孢子萌发率可以达到 100% 。子囊孢子没有休眠阶段可以在弹射后直接萌发。 2，子囊孢子之间的配对组合全部有拮抗现象发生，且这种拮抗发生在同一子囊果得到的子囊孢子之间，也发生在不同子囊果之间。自我配对没有拮抗现象。这种现象不太好解释，涉及到迄今都没有解决的问题：羊肚菌到底是同宗结合还是异宗结合，也可以简单地说，羊肚菌的子囊孢子是同核体还是异核体。 1 ）如果说子囊孢子都为异核体（杂交配对就属于体细胞不亲和类型，由体细胞不亲和位点所决定是否产生拮抗现象，表现形式为如果体细胞不亲和位点一样，则杂交配对不产生拮抗线；如果体细胞不亲和位点有一个不一样，则表现出不亲和现象。通常情况下，体细胞不亲和位点的数量比较多）。作者进行了几百组的配对试验，不应该都表现出拮抗的结果，至少应该会有一些，但因为体细胞不亲和位点比较多，也有可能出现作者描述的情况，大家都不一样。这可能是作者实验结果的最有可能解释。 2 ）如果子囊孢子都为同核体（拮抗则属于交配型因子所导致的不亲和反应，按理说应该形成不同的拮抗类型），一个假设的过程是：一个子囊形成八个子囊孢子，亚子囊中的两个 / 两类细胞核进行配对，细胞核融合形成一个杂合 2 倍体细胞核，之后进行减数分裂形成两个单倍体细胞核，再经过两次有丝分裂形成八个单倍体细胞核，之后单独进入到八个子囊孢子中，在子囊孢子中经过有丝分裂达到一个子囊孢子具有多个细胞核的最终状态。如果按照这种假设，每一个子囊形成的八个子囊孢子应该是两种类型的同核体。也就不至于作者所得到的，全部之间形成拮抗现象。实际上这种推论是不合理的。 3 ）如双孢蘑菇一样，孢子子代中既有同核体也有异核体，则产生的现象也应该如上面一条所述，不至于全部都产生拮抗现象。 4 ）最后一个假设：作者的试验方案有瑕疵，在挑取单孢萌发物的时候，可能得到的所谓的单孢萌发菌落已经是杂合的异核体。以至于产生大量的异核体不亲和现象。 3，菌丝生长受限。这是羊肚菌菌丝生长受限的首次描述，也是为数不多的一次。像动物细胞系细胞株一样，连续培养几十代之后就会出现细胞退化死亡的现象。但作者在文中没有对这种现象做深入的解释。我们也观察到了这种现象。 1978 菌丝老化羊肚菌.zip; 个人分类: 科研笔记|14095 次阅读|0 个评论

丝状真菌菌丝顶端生长: 热度 4 Macrofungi 2013-9-26 23:02; 真菌的菌丝是桶状结构，具有一个半球形或半椭圆形的顶端区域。菌丝呈顶端生长模式曾经被通过荧光抗体技术、外部标记、以及测量隔膜之间的距离等手段进行过证明，最有效的证明是通过放射性自显影技术对鲁氏毛霉（ Mucor rouxii ）真菌芽管生长进行的研究，结果表明，新形成的细胞壁仅在菌丝顶端 1um 以内的区域合成，菌丝的生长是通过在菌丝尖端凝集新的质膜、通过分泌囊包胞吐作用合成新细胞壁形成。菌丝的形状有细胞壁所支撑，生长极性仅发生在菌丝顶端。真菌的细胞壁组成主要是多糖和糖蛋白。内层（碱不溶性部分）是交织的几丁质小纤维组分、β（ 1,3 ） - 和β（ 1,7 ） - 葡聚糖，内层嵌入在碱可溶性多糖（β（ 1,3 ）葡聚糖）和糖蛋白（半乳甘露糖肽）组成的无定形态胶状基质中。证据表明，糖蛋白基质的合成是通过分泌途径、分泌小泡转运，之后通过胞吐镶嵌在细胞壁中，当然这个过程有细胞壁松弛酶（几丁质酶和β (1,3) 葡聚糖酶）和细胞壁合成酶同时参与。响应多糖合成过程的酶像一台纳米机器，据推测这些纳米机器定位于质膜上（图 1 ）。几丁质是通过一个完整的膜蛋白家族——几丁质合成酶（ CHS ）合成的，在细胞质一侧的质膜上，接收尿苷二磷酸 -N- 乙酰葡糖胺（ UDP-GlcNAc ）在质膜的外侧组装成β (1,4)- 乙酰葡萄糖胺（β (1,4)-GlcNAc ）的几丁质。丝状真菌比酵母有更多的几丁质合成酶家族，相应地在细胞壁中就含有更高的几丁质含量。 β (1,3)- 葡聚糖的合成是通过葡聚糖合成酶复合物（ GSC ）进行的， GSC 包含一个催化亚基（ Fks ）和一个调节亚基（ Rho1 ），在酵母中鉴定出四个 fks 基因，和酵母菌不同，在丝状真菌中，只有一个 fks 基因，当然了，它是看家基因。 FKS 是跨膜蛋白，在细胞质一侧接收尿苷二磷酸葡萄糖，在质膜外侧排出产物。 Rho GTP 酶—— Rho1 在内质网上合成，经历蛋白质修饰使其可以插入质膜中， Rho1 和 FKS1 都被转移到质膜中，成为一种没有活性的蛋白复合体，一旦定位于质膜上， Rom2 开始激活 Rho1-GDP ，在 GDP 结合的状态下激活 Fks1 。直到 CHS 和 GSC 被转移到质膜上，这两种酶才开始具有活性，以便它们在原位合成细胞壁组分：几丁质和β (1,3) 葡聚糖。α (1,3) 葡聚糖的合成使用过α - 葡聚糖合成酶合成的，α - 葡聚糖合成酶是内在膜蛋白，具有多个功能结构域，但对这个合成途径还研究的不是很透彻。顶体（ Spitzenkörper ， SPK ，图 2 ）的首次发现是在对鬼伞属真菌固定后进行苏木精染色时发现的，被认为是与菌丝的顶端生长相关的结构。之后通过相差显微镜观察发现在活跃生长的菌丝顶端区域有暗色小体，超微结构研究表明，顶体区域是有大小不等的囊泡、核糖体、微管、肌动蛋白、和一些无定型或不确定性质的颗粒物质聚集组成。顶体高度动态性和多形性的存在于菌丝顶端，对菌丝的生长起到核心作用，决定菌丝的形态建成。需要划归于顶体的一个作用是分泌囊泡在释放合成细胞壁之前先在顶体上凝集在一起。另外，因为发现微管在菌丝顶端凝集，且与顶体非常接近，因此推测顶体是微管凝聚组织中心。成熟的粗糙脉孢霉菌丝顶端具有顶体结构，而芽管却没有，一个解释是是由于菌丝生长速度比较慢的原因，菌丝长速比较慢，就没有足够的顶端分泌小泡的凝集，这个观点就被用于对那些长速比较慢的真菌没有顶体的解释。当细胞壁合成酶抵达顶体的时候，顶体直接参与到细胞壁的建成过程。一些证据表明，几丁质合成酶复合体存在于菌丝的顶端位置，然而他们的精确定位还不很明了。科学家们在粗糙脉孢霉中，用荧光蛋白探针技术鉴定出几丁质合成酶是在顶体的中心位置，这里是一个微囊泡凝集的核心（30~40nm大小的小囊泡），葡聚糖合成酶位于几丁质合成酶核心的周围，是一些大的囊泡区域（70~90nm直径大小的囊泡）。这样的结果表明，自然的囊泡物质组成顶体，构成一个形态功能不同于其他囊泡的结构。迄今为止，这种囊泡顶体的分布特点还没有其他真菌物种中的研究报道。 1. Harris, S.; Read, N., Roberson, R.,Shaw, B.; Seiler, S., Plamann, M., Momany, M. 2005. Polarisomemeets spitzenk ö rper:microscopy, genetics, and genomics converge . Eukaryoticcell 4 (2):225–229. 2. Meritxell Riquelme, 2013. Tip Growthin Filamentous Fungi:A Road Trip to the Apex. Annu. Rev. Microbiol. 67:587 –609; 个人分类: 科研笔记|22628 次阅读|8 个评论

真菌菌丝显微观察制片方法——插片培养法: Macrofungi 2012-9-19 20:06; 插片培养法真菌作为一种重要实验材料，在微生物实验中的应用是相当普遍的，正确的培养观察方法，可以如实地反映其本质特征。插片培养法是实验室观察真菌形态的一种基本方法。该方法简单易懂，应用范围广，在对真菌形态方面的显微观察中可以保证真菌的基本形态不被破坏，结构完整等特点。其基本步骤是： 1，倒平皿：将固体培养基倒入干净的培养皿中，厚度约 0.3~0.5mm ，待平皿凝固后进行后续试验； 2，接种：接种快接种于凝固的培养皿中央； 3，插片：用干净的镊子，将无菌的盖玻片以 45 度角的角度斜插入培养基中，插片位置与接种块之间距离一般为 1.0~1.5cm ； 4，培养：适宜于真菌生长的环境下，倒置培养。待菌丝铺展开来，长过插片的位置后，即可取出玻片进行后续试验； 5，制片：打开培养皿，用镊子轻轻将已经爬有菌丝的玻片取出，用软纸擦去玻片背面的菌丝及培养基，另取一个干净的载玻片，载玻片上滴一滴染料或蒸馏水，将玻片正扣在载玻片上。此时，菌丝在载玻片与盖玻片之间，避免制片过程中产生气泡。 6，封片：封片的种类很多，可以用甘油、树脂等封片。更为简单有效的是，用透明的指甲油在上面做好的玻片四周涂抹封片，此封片方法最为简单实用，密封好的话，可以保存很久不干燥。 7，观察：显微镜观察。插片培养示意图（侧看）注意事项， 1，制片前的所有步骤都要严格无菌操作，避免污染。 2，盖玻片的灭菌可以用湿热灭菌法，注意的是灭菌后要烘干处理，烘干的越彻底越好，这样能避免玻片间的粘连。 3，插片的数量可以根据实验而定，最好不少于两个。可以错落着插片 2~8 个不等。 4，以上制片方法，将染色和制片合二为一，根据具体实验而定。 5，封片不是必须的，只为长久保存之用。插片培养真实图片; 个人分类: 科研笔记|30938 次阅读|0 个评论

真菌菌丝是如何生长的？: 热度 1 Macrofungi 2011-6-11 22:47; 菌丝是如何生长的？压力促使菌丝生长的生物物理学研究（美文推荐）在一个菌落中，菌落前端的菌丝以寻找食物为目的向前生长，菌落中间的菌丝则结成三维网状结构，最大化地从菌丝周围的培养基上吸收营养物质供给生长（上图所示）。菌落的生长速度可以是很快的（大约 10-100um/min ，这要依赖于物种类型，可利用的营养物质，以及温度条件等），菌落的生长是一个涉及为使菌丝细胞快速扩张的所有细胞组分持续合成的过程。驱使真菌菌丝生长的主要作用力是——压力。压力是一个热力学特性，影响到各种生物的生命过程。对于缺乏细胞壁的生物来说，压力可能是致命的，将导致细胞的裂解和死亡。而对有细胞壁的生物来说（大多数的细菌，藻类，真菌以及植物），内部静水压力（膨胀压）对生物的一些独立结构提供支撑作用，以及对细胞扩张、物质的吸收和其他一些过程提供一种驱使力。一个特别的例子是，在一些子囊菌和接合菌门的真菌中，孢子释放过程可以产生巨大的张力 100000 × g （ g 为地球表面的重力加速度），对于一些寄生真菌来说，这样的膨胀压力足以使其穿过寄主组织。膨胀压是由于细胞内渗透物的浓度比细胞外高而产生的渗透作用所致。细胞的生长（扩张或分化）以及细胞壁的重塑过程需要增加细胞的总量。我们所知道的大多数细胞扩张经历的机制被认为是菌丝细胞顶端延伸管延伸的尖端生长机制所致。关于尖端生长的模式系统的例子有很多，如藻类，真菌，植物的花粉管和根尖的生长。菌丝尖端的生长模式是一个梯度生长的，菌丝的尖端扩展最快，紧挨着菌丝尖端的那些就开始减慢了。 1892 年 Reinhardt 就对这一些进行过认真的研究。这样的扩张模式（尖端生长）与膨压驱动的增长是一致的。这篇讲解菌丝到底是如何生长以及相关机制的研究的文章发表在 2011 年六月的 Nature Reviews Microbiology ，附原文，喜欢的随便下载。 How does a hypha grow? The biophysics of pressurized growth in fungi nrmicro2011.pdf; 个人分类: 文章推荐|24699 次阅读|3 个评论

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