科学网—标签

相关帖子	版块	作者	回复/查看	最后发表

lvanmorison 2019-2-28 15:00

酶联免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作，可以简单地回答样本中有多少蛋白质/多肽/抗体这一基本问题，是实验室比较常用的一种检测方法。而这种简单的分析方法的核心，就是标准曲线。没有它，我们的实验就变成了一个二元的“是/不是”测试。有了它，我们可以深入研究生物反应的细节。那么，是什么使得标准曲线如此强大呢?让我们在ELISA的背景来讨论这个问题。简单地说，标准品就是一系列已知目标蛋白数量的阳性对照。例如，如果对人类IgG进行ELISA检测，标准曲线将包含逐渐减少的已知量的人类IgG，它会让你立刻得出一系列的结论。 1.我的ELISA实验有效吗? 是否可以看到标准品的信号？如果可以，实验是好的；如果没有，就应该进行故障排除。也许抗体问题，或者系统中的其他东西没有得到优化。 2.我的ELISA检测正常吗? 这是一个比较棘手的问题。当标准浓度下降时，信号是否减少？如果答案是肯定的，那就是一个好的开始。如果答案是否定的，可能在某些步骤引入了一些背景，或者移液管可能需要校准。 3.是否在系统中引入了背景? 一组适当的标准品总是以空白结束，在空白孔中不存在标准品。如果空白孔OD值为0.1，说明可能引入了一些背景。计算未知数标准曲线的真正能量在于它能够测定未知样品的浓度。如果我们观察IgG反应，我们可以将样本的OD值与标准的OD值进行比较，并根据相对OD值得出一些结论。例如，如果我们知道一个333 ng/mL的标准品OD值在2.1左右，而一个111 ng/mL的标准OD值在1.7左右，那么我们可以假设一个未知的OD值在1.9左右应该在200 ng/mL左右。直到我们把它画在曲线上，然后得出一个方程。当我们检测到更多的目标时，OD值上升，当我们检测到更少的目标时，OD值下降。那么，曲线一定是线性的吗？这看起来不太对。坦白地说，这和我们的眼睛告诉我们的并不相符。如果我们有1200ng /mL的浓度，OD值会是3吗?当然不是。数据看起来接近一条水平渐近线——曲线不会通过这个值。所以不管浓度有多高，都不会超过2.5左右。类似地，这条曲线似乎表明，如果浓度为负，可以生成OD值在0.5左右。 4.参数对数曲线使用图1的数据来拟合，得到如下s曲线。这条曲线非常清楚地显示了水平渐近线，同时也显示了标准浓度增加或减少时的良好的、与剂量相关的响应。四参数方程的拟合函数表达式为：在这个方程中，“a”和“d”分别表示可以得到的最小值和最大值——我们的渐近线。“c”表示拐点——曲线的中点，“b”表示曲线在“c”处的斜率。根据这个方程，我们现在可以反算出一个样本的未知浓度。大多数ELISA阅读器都可以自动完成这项工作。它不仅限于竞争法, 夹心法也可以用它。它的形状, 根据情况, 可能是一个单调上升的类似指数, 对数, 或双曲线的曲线, 也可能是一个单调下降的上述曲线, 还可以是一条 S 形曲线。它要求 X 值不能小于 0 (因为指数是实数, 故有此要求)。在很多情况下它都可以拟合 ELISA 的反应曲线, 所以它也成了 ELISA 中应用最广的模型之一。当使用4参数拟合曲线时，记住一些实用的技巧是有帮助的。由于以渐近线开始和结束，曲线范围之外的数据可能会产生不准确的结果。更进一步说，试着在S中间标准曲线的线性范围内工作。一般来说，未知计算在曲线的线性范围内更准确。可以稀释超出标准曲线范围的样本，根据标准曲线计算浓度，然后根据初始稀释值乘以相应倍数。文章来源于 http://www.bio-review.com/elisa-standard-curve-2/ 更多相关信息请关注微信公众号：每日生物评论，或Bio-review

505 次阅读|0 个评论

2012年12月 FlowJo苏州会议回顾

FlowJo 2012-12-13 10:10

12 月 8 日 -9 日， FlowJo 参加了在苏州市会议中心举办的“肿瘤免疫基础与临床研究进展”全国继续教育研讨班。会议期间为各位老师介绍了 FlowJo 的常用用法及特色功能。根据大家的要求，对软件的一些常用功能进行了演示与讲解，比如 FlowJo 采集后荧光补偿。期间还为大家介绍了免疫学中另外几款非常好用的软件，比如 ELISA 数据分析软件 ReaderFit 、免疫组化作图软件 Cytosketch 、统计作图软件 Graphpad Prism 6 。

个人分类: FlowJo 会议及讲座安排|4023 次阅读|0 个评论

ELISA数据分析专业软件MasterPlex ReaderFit

Armon 2011-10-17 10:50

软件简介 MasterPlex ® ReaderFit 是一款高效省时的ELISA数据软件，它可以分析所有的ELISA数据。软件配有专门的曲线模拟功能，帮你轻松模拟标准曲线，得到样本结果。并提供多种报告输出方式，包括样本测试结果，标准曲线及图表的输出。开发者 Hitachi Solutions America, Ltd. MiraiBio Group 软件版本 ReaderFit (Desktop Edition)： PC版本，下载安装后使用，可以免费试用15天。 ReaderFit (Security Edition)：符合（GMP/GLP/GCP）规范，可以免费试用15天。 ReaderFit (Online Edition)： ELIS数据在线分析软件，可以免费使用。功能特性简单易用，功能齐全 ReaderFit可以分析所有的ELISA数据，可以统一分析不同机器、不同试剂得到的ELISA数据，实现分析标准化。软件基于大量研究者的使用习惯设计，具有直观的用户界面。简便易学，操作者能即学即用。只需4个简单步骤，便可获得：　　1.准确的标准曲线　　2.完整的测试结果　　3.多样化的图形图表输出超强的标准曲线拟合功能对于ELISA数据分析里面经常遇到的标准曲线模拟的问题，ReaderFit运用4参数和5参数的算法，极大的增加了准确性和可靠性。ReaderFit能自动选择最优的拟合方程进行拟合，得到最准确的标准曲线。用户也可以自己选择拟合方程进行手动拟合。质量控制功能通过软件的质量控制功能，ReaderFit可以根据用户的设定，对ELISA数据中的异常值（outlier）进行标记。ReaderFit能根据用户的选择，在计算的过程中对异常值进行计算或者将其排除在外。模板功能用户可以将某次ELISA数据分析设为模板，在下次进行相同类型的数据分析时，直接套用该模板便能自动得到数据分析结果，省去了许多重复操作。如果您需要重复进行很多次相同类型的数据分析，ReaderFit的模板功能将能为您节省大量的时间。多参数、多类型的结果输出 ReaderFit提供的多参数、多类型结果输出可以直接用于发表论文。用户可以将数据表格保存为Excel文档输出，也可以保存为HTML，PDF等格式。支持多种图片输出格式，包括bitmap,png, html, pdf, excel等，满足不同需求。

11522 次阅读|0 个评论

一例特殊的疑似狂犬病死亡病例的实验室检测和确诊

热度 1 yanjx45 2010-12-22 14:36

（原载中国人兽共患病学报， 2008 ， 24 （ 5 ）： 461 － 464 ，图表等有删节）作者：明平刚 1 ，徐葛林 1 ，严家新（通讯作者） 1 ，吴杰 1 ，任长庆 2 ，董平国 2 摘要：目的采用实验室检测方法确诊一例特殊的疑似狂犬病病例。方法利用荧光抗体（ FA ）试验、双抗体夹心 ELISA 和逆转录 - 聚合酶链式反应（ RT-PCR ）方法对一例死亡的疑似狂犬病人的脑组织和此脑组织经乳鼠脑内接种传代后的鼠脑组织分别进行检测和分析。结果死亡病人脑组织的直接 FA 试验和双抗体夹心 ELISA 检测为阴性，但 RT-PCR 检测结果为阳性。将该病人脑组织经乳鼠传代后对鼠脑组织用上述三种方法检测的结果均为阳性。对该街毒株的 RT-PCR 产物中的核蛋白基因序列进行测定，用 Mega3.1 软件进行分子进化关系分析，证实所分离的街毒株为基因 Ⅰ 型狂犬病病毒，与以往在该地区所分离的街毒株有较近的遗传关系。结论该病例可确诊为狂犬病死亡病例，其主要和决定性的死因为狂犬病，但并发的肺部感染可能加速了死亡的进程。 WHO 认为 FA 技术是狂犬病诊断的金标准，但本病例说明，在某些复杂情况下，只有将多种实验室检测方法联合运用才能确诊狂犬病，而且病毒分离和 RT-PCR 可能比 FA 试验更敏感。关键词：狂犬病病毒；荧光抗体（ FA ）试验； ELISA ； RT-PCR * 国家高技术研究发展计划（ 863 计划）资助项目（ 2007AA02Z402 ）作者单位： 1. 武汉生物制品研究所基因工程室 430060 ； 2. 重庆市巫山县疾病预防控制中心世界卫生组织（ WHO ）狂犬病专家磋商会 2004 年报告中明确提出：只有实验室检查才能确诊狂犬病。因为仅靠临床表现诊断狂犬病比较困难，也不可靠，除非出现了特异性的临床体征，如怕风和极度恐水等特异性症状。狂犬病病例中有约 60% 为狂躁型，有十分典型的临床症状；对于此类病例，仅根据临床症状和曾被狗或猫抓咬的病史资料，通常能较有把握地诊断为狂犬病。但即使是此类病例，也不排除有与破伤风、多种病毒或细菌性脑炎、癔病等混淆的可能。而近年来随着狂犬病实验室诊断技术应用范围的扩大，发现可能有高达 40% 的狂犬病病例的临床症状并不典型，表现为麻痹或 Guillain-Barre 氏症状，属于麻痹型或哑型狂犬病，这些病例在缺少实验室检测结果的情况下常被错误地归类为其他疾病。我们对一例合并有肺部感染的特殊的疑似狂犬病死亡病人的脑组织样本采用多种方法进行了全面的检测和综合分析，最终得到了明确的结论。结果说明，实验室检测在狂犬病的诊断中确实具有决定性的作用；在某些复杂情况下，仅仅依靠狂犬病诊断的金标准――荧光抗体（ FA ）试验的结果还不足以下最后结论，只有多种实验室检测方法的联合运用才能确诊狂犬病，而且病毒分离和 RT-PCR 可能比 FA 试验更敏感。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病史资料 2007 年 5 月 25 日，重庆市巫山县发生一例特殊的疑似狂犬病死亡病例。死者李某， 5 岁，于 2007 年 5 月 7 日（死亡前 18 天）被邻居所养家犬咬伤手臂部位，Ⅲ度暴露，后立即被家人送至其所在的乡镇卫生院进行了挤压出血、冲洗、消毒等处理，并同时接种狂犬病疫苗，未注射抗血清。死者于 2007 年 5 月 22 日（被狗咬伤后第 15 天）发病，发病时已注射疫苗 4 针，未完成全程疫苗注射。发病时表现有烦躁、抽搐、流涎、合并有肺部感染等临床症状，被其所在的某县级医院临床诊断为狂犬病。 2007 年 5 月 25 日，患者死亡。对其死亡原因当事各方存有争议。为科学地确定死因，巫山县疾病预防控制中心将死者脑组织样品送至我所基因工程室进行狂犬病的实验室检测。 1.2 方法 1.2.1 荧光抗体（ FA ）和双抗体夹心 ELISA 。 1.2.2 病毒分离：取死者脑组织海马回部位的样品 0.3g ，加研磨成 10 ％悬液，颅内接种 1 日龄昆明鼠，每只乳鼠注射 10l 。 1.2.3 RT-PCR 。 1.2.4 DNA 序列分析：对所获得的 N 基因序列利用 MEGA3.1 软件与已发表的相关毒株一同构建 neighbor-joining(NJ) 系统进化树。研究中用于比较分析的其他狂犬病毒 N 基因序列来源于 GenBank 。 2 结果 2.1 荧光抗体法检测抗原直接对疑似狂犬病人脑组织进行荧光抗体检测，结果为阴性；对此脑组织进行乳鼠颅内接种传代后，再对传代乳鼠脑组织进行荧光抗体检测，结果为阳性。对死者脑组织进行荧光抗体检测并未发现脑组织细胞浆中有特异性荧光颗粒，检测结果为阴性。对传代鼠脑组织进行荧光抗体检测，可见含明亮的苹果绿或黄绿色荧光颗粒，呈不同形状和大小。较大、圆形或椭圆形的、在其周边有较强烈的染色者为内基氏体。 2.2 双抗体夹心 ELISA 检测狂犬病毒抗原直接对疑似狂犬病人脑组织进行双抗体夹心 ELISA 检测，结果为阴性；对此脑组织进行乳鼠颅内接种传代后，再对传代乳鼠脑组织进行双抗体夹心 ELISA 检测，结果为阳性。对死者脑组织样品用双抗体夹心 ELISA 法检测，结果表明此脑组织狂犬病毒核蛋白阴性（ A 450 值仅为 0.061 ）；对传代乳鼠脑组织样品用双抗体夹心 ELISA 法检测，结果表明此乳鼠脑组织狂犬病毒核蛋白阳性（ A 450 值达到了 2.091 ）。 2.3 病毒分离：将死者脑组织样品接种 1 日龄乳鼠后，所接种的乳鼠于 12 天后出现拱背、松毛、麻痹等狂犬病发病症状，出现症状至死亡为 1-3 天。处死发病乳鼠，取其脑组织分离得到狂犬病毒，命名为 CQH07 。 2.4 RT-PCR 后电泳鉴定结果用狂犬病毒特异性引物对死者脑组织进行 RT-PCR 以及对传代鼠脑组织进行 RT-PCR ，两者的产物经电泳鉴定后，在 1500 bp 处均可见特异性目的条带。 2.5 分子进化树分析对所分离毒株进行 N 基因测序后，选取第 1-363 位核苷酸，采用 MEGA3.1 软件，将 Genebank 中已发表的重庆地区分离的街毒株以及相关固定毒株的对应序列一同构建 NJ 系统进化树。由图中可知本次分离的街毒株 CQH07 与在该地区分离的其他 5 株毒株在进化树上遗传关系较近，它们同 CTN 在一个分支，其他固定毒株在另一个分支。 3 讨论 WHO 狂犬病专家磋商会建议，对于狂犬病的 III 级暴露，即一处或多处皮肤的穿透性（即出血性）咬伤或抓伤，或被可疑的疯动物的唾液污染粘膜，暴露后预防除了包括正确的伤口处理和使用狂犬病疫苗以外，还包括使用抗狂犬病血清（免疫球蛋白）。从本病例的病史资料来看，从狂犬病暴露后的处治方法方面考虑，造成本病例死亡的主要原因是未注射抗血清。此外，对病人进行伤口处理时采用的挤压出血，也不符合针对狂犬病的伤口处理规范。目前，与狂犬病相关的实验室检测方法主要有以下四类 , 其中以前三种方法较常用：一，抗原检测，包括荧光抗体（ FA ）法检测抗原和快速狂犬病酶联免疫吸附法（ ELISA ）检测抗原；二，核酸检测，即 RT-PCR 法扩增并鉴定狂犬病毒核酸；三，病毒分离，包括细胞培养分离病毒和乳鼠接种分离病毒；四，抗体检测，包括特异性抗体检测和中和抗体检测。　　荧光抗体（ FA ）技术是诊断动物和人狂犬病的一种快速而敏感的方法。 WHO 认为 FA 技术是狂犬病诊断的金标准，但其准确度依赖于检查人员的专业经验、荧光标记抗狂犬病病毒抗体的质量以及荧光显微镜的质量。酶联免疫吸附试验（ ELISA ）检测狂犬病病毒核壳体抗原已使用多年，该方法快速且廉价， WHO 认为可用于流行病学调查。关于病毒分离， WHO 认为，要确认抗原检测试验的结果和进一步明确毒株的特性，有必要进行病毒分离。可通过成神经细胞瘤细胞或小鼠颅内接种进行病毒分离。目前， WHO 不推荐使用多聚酶链式反应（ PCR ）和其他扩增技术来进行狂犬病的常规死后诊断，但认为在有严格质量控制措施和在这些技术方面有专业经验的实验室，可采用这些分子技术进行流行病学调查。在本病例中，我们对该死亡病人的脑组织样品首先进行了抗原检测和核酸检测，抗原检测（ FA 和 ELISA ）显示为阴性，而核酸检测（ RT-PCR ）却显示为阳性。在这种情况下，我们进一步采用了第四种方法即乳鼠的颅内病毒分离法。将病人脑组织悬液接种乳鼠后，乳鼠发病。在随后对乳鼠脑组织的检测中，上述抗原和核酸检测的三种方法检测的结果均为阳性。分析此病例，综合病史资料和全部实验室检测的结果，首先可以确定该病例为狂犬病死亡病例，这可以从以下几个方面来判断： 1 ，从流行病史上看，有被犬咬伤的经历； 2 ，从发病和死亡时间上看，被咬后 15 天发病，发病后 3 天死亡，符合狂犬病发病的临床诊断标准； 3 ，从实验室检测结果上看，病毒分离和随后的抗原检测以及 RT-PCR 检测的结果均可以证实为狂犬病毒感染； 4 ，对该病毒分离株的 N 基因序列与相关街毒株和疫苗株的系统进化树分析表明，新分离的毒株属于基因 Ⅰ 型狂犬病毒，与早先在同一地区分离的街毒株有较密切的亲缘关系但又不完全相同，这进一步确证有狂犬病病毒存在同时排除了实验室污染的可能。但是，此病例又有它特殊的地方，从发病到死亡的时间较短（仅为 3 天），临床症状不是特别典型，同时显示有肺部感染的症状。我们推测可能是患者肺部并发的细菌感染或其他病毒感染加速了此狂犬病病人死亡的进程。由于死者脑组织中狂犬病毒繁殖时间偏短，病毒的拷贝数可能偏低，结果导致用常规抗原检测方法未能检测出抗原，而检测灵敏度更高的 RT-PCR 方法却可能检测到极微量的狂犬病毒核酸。另一种解释是病人脑组织的各个部分病毒复制的数量可能有差别，特别是在病毒复制的时间较短的情况下，对病毒感染在脑中的数量分布规律尚了解不多，取样的随机误差也可能造成检测结果的差别。所以在检测结果为阴性时，多次取样、重复检测可能进一步降低漏检的发生率。当然，由于与本病例类似的复杂病例在国内还未见报道，可能还需要更多的病例来证明上述诊断原则的合理性。我们对本病例的综合诊断结论是，该病例可确诊为狂犬病死亡病例，造成患者死亡的决定因素是狂犬病，但并发的肺部感染可能加快了死亡的进程。 WHO 认为， FA 技术是狂犬病诊断的金标准；但本病例说明，对荧光抗体（ FA ）法阴性的样品也应持慎重态度，病毒基因组的 RT-PCR 检测法和病毒分离方法可能较 FA 法和 ELISA 法更灵敏。在某些复杂情况下，只有多种检测方法的联合运用和综合分析才能得到狂犬病检测的更可靠的结论。由于狂犬病是一种致死性疾病，一旦发病， 100% 死亡，所以狂犬病的诊断结果往往关系重大，必须持特别慎重的态度。本实验室根据以往的大量临床检测实验的经验，目前已初步建立了疑似狂犬病脑组织样品实验室检测的常规程序：首先对疑似狂犬病脑组织样品进行 FA 和 ELISA 试验（这两项试验通常可在半天内完成），若 FA 和 ELISA 试验结果均为阳性，则可以判定为狂犬病，可在当天发出检测报告；若这两种试验的结果有一种或两种均为阴性时，则对疑似狂犬病脑组织继续进行 RT-PCR 试验和 / 或病毒分离试验。只有当后两种方法的检测结果也均为阴性时，才作出狂犬病毒阴性的结论。对疑似狂犬病脑组织样品进行 FA 和 ELISA 试验结果均为阳性的病例，我们通常在当天就作出确诊狂犬病的结论并发出检测报告。对于这类样品，因狂犬病病毒分子流行病学科研工作的需要，我们在发出检测报告后，会对全部样品继续进行大量的检测和分析工作，包括病毒分离、 RT-PCR 、病毒基因序列测定和分析等。全面回顾这些后续检测的结果，迄今未发现有需要更改当初发出的检测报告的情况。

个人分类: 狂犬病防治|12793 次阅读|3 个评论

[转载]ZZ： ELISA 常见问题

liangqunlu 2010-5-3 20:07

ELISA 常见问题（上海联硕生物科技有限公司，国内免疫学产品主要供应商之一） ELISA 操作常见问题 ELISA 方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但 ELISA 测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。引起 ELISA 测定错误结果的原因主要有： ① 标本因素； ② 试剂因素； ③ 操作因素。下面就一些常见 ELISA 操作过程中的问题一一分析。 1 ．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取 10l 样品进行稀释，个别用户取 5l 甚至 1l 样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。 2 ．试剂盒平衡试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温 ( 约 25 ℃ ) ，一般需在室温放置 20 ～ 30 分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短， ELISA 反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒置 37 ℃ 温箱 20 分钟。 3 ．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。 4 ．加样在现在的 ELISA 商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。 5 ．温育温育是 ELISA 测定中影响测定成败最为关键的一个因素。 ELISA 作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有 37 ℃ 和室温，其次是 43 ℃ 和 2 ～ 8 ℃ 。一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。 6 ．洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证 ELISA 测定的特异性。洗板对于 ELISA 测定来说，也是极其关键的一步。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置 1 分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。 7 ．边缘效应使用 96 孔板的 ELISA 测定中，常发现有边缘效应，即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规 ELISA 测定中，将板从室温（通常在 25 ℃ 左右）置于 37 ℃ 温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如 37 ℃ ），就可以很容易地排除边缘效应，并且可提高测定的重复性。 8 ．显色显色一定要控制时间 , 根据试剂盒说明操作即可。一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。 9 ．比色比色要注意波长的选择。以 TMB 为底物和以 OPD 为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为 450nm ，后者为 492nm ，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。其次，单波长或双波长比色选择的问题。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如 450nm 或 492nm 进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如 450nm 和非敏感波长如 630nm 下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。由于 ELISA 测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在 ELISA 测定比色时，最好是使用双波长比色。综上所述，尽管 ELISA 测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。操作过程中可能出现的问题和解决方法问题可能原因解决方法显色淡，灵敏度偏低 1 、试剂盒在运输途中时间太长，温度太高尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温 2 、试剂盒未充分平衡试剂盒从 2 ～ 8 ℃ 冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少 20 分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约 25 ℃ ）。 3 、培养箱温度不足 37 ℃ 注意培养箱温度，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定，非隔水式培养箱尤其应注意 4 、保温时间不足校正定时钟准确定时 5 、洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加按说明书要求保留洗涤时间，准确记住洗涤次数 6 、移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，最好一次性使用 7 、蒸馏水水质有问题使用新鲜合格的蒸馏水 8 、底物作用时间不足准确定时背景深，全部呈有色 , 1 、洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留浓缩洗液准确配制； 10 倍浓缩洗涤液如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释；充分洗涤，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染 2 、样品污染样品应新鲜采集，或低温保存，防止污染 3 、培养箱温度超过 37 ℃ 或反应时间过长调整培养箱温度，准确定时 4 、吸嘴重复使用，未洗净或消毒不彻底吸嘴尽可能一次性使用 5 、蒸馏水被污染使用新鲜蒸馏水 6 、酶等试剂混用不同批号试剂勿混用 7 、一次实验的标本量过多，加样时间太长，导致实际反应时间延长合理安排实验，避免几块酶标板同时加样重复性不佳 1 、样品数量多少不一，加样时间有长有短重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近 2 、保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性 3 、加样量不一致样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴出现白板，阳性对照不显色显色液变质更换新的显色液洗涤液配制有误请按说明书所示稀释倍数配制未加酶结合物而认为已加入注意不要漏加终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用每次加液前均应看清标签

个人分类: 名家名言|2062 次阅读|0 个评论

帐号		自动登录	找回密码
密码			注册

关闭安全验证

标签: ELISA

相关帖子

相关日志

关闭 安全验证

标签: ELISA

相关帖子

相关日志

关闭安全验证