第一章 芽孢杆菌的简要介绍 第二章 枯草芽孢杆菌的转化系统 第三章 芽孢杆菌表达系统发展简史 第四章 枯草芽孢杆菌转录翻译系统的简要介绍 第五章 芽孢杆菌常用的宿主和载体 第六章 芽孢杆菌表达系统几个成功应用实例 第七章 芽孢杆菌其他产品 第八章 结语 附录 致谢 第一章 芽孢杆菌的简要介绍 芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。芽孢杆菌是一个泛泛的概念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如168菌株及其大量的衍生菌株。枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株。 一 第一节：芽孢杆菌的分类： 目前，芽孢杆菌属很多菌株的全基因组序列已经报道，截至2011年10月，在kegg上公布全基因组序列的芽孢杆菌属菌种有： Bacillus subtilis Bacillus subtilis subsp. spizizenii W23 Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-10 Bacillus subtilis BSn5 Bacillus halodurans Bacillus anthracis Ames Bacillus anthracis Ames 0581 Bacillus anthracis Sterne Bacillus anthracis CDC 684 Bacillus anthracis A0248 Bacillus cereus biovar anthracis CI Bacillus cereus ATCC 14579 Bacillus cereus ATCC 10987 Bacillus cereus ZK Bacillus cereus AH187 Bacillus cereus B4264 Bacillus cereus AH820 Bacillus cereus G9842 Bacillus cereus Q1 Bacillus cereus 03BB102 Bacillus cytotoxis NVH 391-98 Bacillus thuringiensis 97-27 Bacillus thuringiensis Al Hakam Bacillus thuringiensis BMB171 Bacillus weihenstephanensis Bacillus licheniformis ATCC 14580 Bacillus licheniformis DSM13 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 Bacillus amyloliquefaciens DSM 7 Bacillus atrophaeus Bacillus clausii Bacillus pumilus Bacillus pseudofirmus Bacillus megaterium QM B1551 Bacillus megaterium DSM 319 Bacillus selenitireducens Bacillus cellulosilyticus Bacillus coagulans Bacillus coagulans 36D1 目前应用最多的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种。 第二节：芽孢杆菌表达系统发展简史 芽孢杆菌表达系统是在70年代从枯草芽孢杆菌，又称枯草杆菌（Bacillus subtilis）开始，逐步扩展至其它种的。 枯草杆菌能发展成为芽孢杆菌中的第一个基因工程表达系统是与其早期的遗传学工作密切相关的。Spizizen于1958年发现枯草杆菌168菌株为可转化菌株以来，枯草杆菌的遗传学工作不断深入和发展。美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心（BGSC，http://www.bgsc.org/）至1999年保藏的168菌株的遗传突变株就有890个。它牵涉到了诸多营养要求、各种酶、芽孢形成和发芽、感受态、Sigma因子、DNA重组与修复以及正负调控等各方面基因的突变体。70年代发明了DNA重组技术以后，特别是发现金黄色葡萄球菌的带有抗性标志的质粒可作为枯草杆菌的载体以后，克服了枯草杆菌只有隐秘性质粒的困难，枯草杆菌基因工程的工作更是加速发展。迄今，已经在枯草杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核和真核基因，其中有的已应用于工业化生产，取得了不少成绩。 将携有外源基因载体导入宿主细菌中是细菌基因工程表达系统的必要条件。大肠杆菌（G-）的氯化钙转化法对枯草杆菌无效，所以枯草杆菌基因工程表达系统中的宿主菌株用的最广泛的就是在DNA重组技术发明之前就可以进行感受态转化（Spizizen 1958）的168菌株及其突变体。Spizizen感受态转化的基本原理：是细胞在Spizizen最低盐培养基中形成一段饥饿、易于摄取外源DNA片段的时期。一般步骤是先将其在较为丰富的培养基中培养，然后转接到贫瘠的培养基中，使其形成感受态（一般非常短暂）。有关感受态时期参与摄取外源DNA的几种蛋白及其摄取机制已有初步的研究。 第二章 枯草芽孢杆菌的转化系统 第一种方法：电转化（本人亲自验证，使用的菌株为WB600） 实验试剂： GM:LB+0.5M 山梨醇 ETM:0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油 RM：LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇 电转仪：eppendorf 方法： 1）新鲜平板挑单菌落（小一点为好）接种于5ml LB培养基中，过夜培养.。 2）测量摇管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。培养基为50ml GM。37℃，200rpm培养至OD600=1.0（大约3-4小时）左右。 3）取全部菌液冰水浴10 min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。 4）用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。 5）将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl. 6）将60μl感受态细胞中加入1-6 μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。电转仪设置：2.0kv（另外我还尝试过0.8kv，1.2kv）,25μF200Ω，1mm,电击1次. （持续时间4.5ms-5ms之间） 7）电击完毕立即加入1ml 复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养 第二种方法：Spizizen转化 取新鲜活化菌种一环接入装有5mLGM1培养基的试管中，37℃、200rpm培养过夜，取500μL菌液转接入相同的GM1培养基中，37℃、200rpm培养4-5小时使菌体生长达到对数期末期，然后取0.75mL GM1菌液接入装有5mLGM2培养基的试管中，37℃、200rpm培养1.5小时，制得感受态细胞，将待转化质粒DNA与1mL感受态细胞混匀后在37℃静置1小时，然后37℃，200rpm震荡培养1-1.5小时，取适量菌悬液涂布选择培养基，37℃培养24-48h后，挑选转化子。 10×Spizizen基本盐培养基(g/L)：(NH4)2SO4 2，K2HPO4 8.3，KH2PO4 6，柠檬酸钠1.2，无离子水配制。0.1Mpa压力下灭菌20min。 Spizizen基本培养基：10×Spizzen基本盐培养基100ml/L，50%(w/v)葡萄糖10ml/L，色氨酸母液（5mg/ml）10ml/L，琼脂1.5%（w/v）。0.06Mpa压力下灭菌20min。 GM1培养基和GM2培养基：母液0.1Mpa压力下灭菌20min后按下表混合。 母液 GM1培养基 GM2培养基 40%葡萄糖 100μL 100μL 20mg/mL酸水解酪素 100μL 50μL 50mg/mL酵母抽提物 100μL 0μL 20%(w/w)MgSO4.7H2O 5μL 40μL 10×Spizzen基本培养基 500μL 500μL H2O 3195μL 3310μL 总体积 5000μL 5000μL 第三种方法：原生质体法(Takashi) 1、活化：从活化24小时新鲜的CM平板上挑取单个菌落，接种于30ml CM液体培养基中，37℃过夜培养。 2、转接：次日取2%菌液接种于新的30ml CM液体培养基中，培养3h左右，至OD570为0.4~0.8。 3、收集菌体：取30ml菌液，4℃下3500rpm离心10min，弃上清。用10mlSMM洗涤两次。 4、制备原生质体：约用6ml SMM重悬，使OD570为2.0，加入溶菌酶（终浓度200μg/ml）在37℃慢摇作用30min，制备原生质体。 5、原生质体高渗悬液的制备：3500r/min离心15min，弃上清。用10ml SMM洗涤一次。原生质体重悬于300μl SMM中，得到“原生质体高渗悬浮液”。 6、转化：将待转化的40μl质粒DNA（约1μg）与10μl CaCl2溶液（2mol/l）混匀,再与50μL的2*SMM溶液混匀，加入100μl待转化菌株的“原生质体高渗悬浮液”，混匀后冰浴10min, 加入40%的PEG4000溶液1800μl，混匀后冰浴1min后立即加入30ml HCP-1.5溶液以终止PEG4000的作用；3500r/min离心15min，弃上清，收集转化后的原生质体；用5 ml HCP-1.5溶液重新悬浮，30℃静置培养3~5h.。 7筛选：取500μl菌液转至5ml HCP-1.5半固体培养基中,混匀。加入kann（50μg/ml）抗性HCP-1.5再生平板中，37℃夹层培养。 CM培养基 葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母抽提物2％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，pH7.2，115℃灭菌15min 2*SMM培养基 蔗糖342.4g（1M），顺丁烯二酸4.46g（0.04M），MgCl2•6H2O 8.12g（0.04M）加去离子水定容至1000mL，pH7.5，115℃灭菌15min HCP-1.5培养基 250ml琥珀酸钠（2M PH7.3），酪蛋白水解物5g，酵母抽提物5g, MgCl2•6H2O 1.9g,葡萄糖 5g， K2HPO4 3.5g , KH2PO4 1.5g, 聚乙烯吡咯烷酮15g ,115℃灭菌15min 再生培养基：HCP-1.5培养基加2%琼脂 半固体HCP-1.5培养基：HCP-1.5培养基加0.8%琼脂 溶菌酶（一般用途）用水配制成50mg/mL溶菌酶溶液，分装成小份，保存于-20℃。 第四种方法：原生质体转化之二 1、活化：从活化24小时新鲜的LB平板上挑取单个菌落，接种于30mL LB液体培养基中，37℃过夜培养。 2、转接：次日取10%菌液接种于新的30mL LB液体培养基中，培养3h。 3、收集菌体：取30mL菌液，4℃3000rpm离心10min，弃上清。用20mL SMMP洗涤一次。 4、破壁：制备原生质体：用1mL SMMP(含0.1mg/mL溶菌酶），在37℃作用20min，制备原生质体。 5、原生质体高渗悬液的制备：3000r/min离心10min，弃上清。用10mL SMMP洗涤一次。 原生质体重悬于500μL SMMP中，得到“原生质体高渗悬浮液”。 6、转化：将待转化的质粒DNA50μL（约1μg）与等体积的2*SMM溶液混匀，加入500μL待转化菌株的“原生质体高渗悬浮液”，混匀后冰浴30min, 室温放置10 min。 7复苏：取500μL菌液转至5mLSMMP摇管中,37℃,150rpm培养5h后，加入kann（50μg/mL）抗性再培养5h。涂布在kann（50μg/mL）抗性平板上挑选转化子。 2*SMM培养基： 蔗糖172.2g（0.5M），顺丁烯二酸2.23g（0.02M），MgCl2•6H2O 4.06g（0.02M）加去离子水定容至1000mL，pH7.0，115℃灭菌15min SMMP培养基： 蔗糖172.2g（0.5M），顺丁烯二酸2.23g（0.02M），MgCl2•6H2O 4.06g（0.02M），葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母抽提物1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，K2HPO40.5%加去离子水定容至1000mL，pH7.0，115℃灭菌15min CMR完全再生培养基： 蔗糖172.2g（0.5M），顺丁烯二酸2.23g（0.02M），MgCl2•6H2O 4.06g（0.02M），葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母抽提物1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，K2HPO40.5%，调pH7.2～7.5，而后加入1.5％的琼脂粉，115℃灭菌15min. 溶菌酶（一般用途）用水配制成50mg/mL溶菌酶溶液，分装成小份，保存于-20℃。 溶菌酶(原生质体转化)普通溶菌酶0.22μm过滤灭菌后，用SMMP调制成1mg/mL的终浓度。 第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐） Competence development in B. subtilis is one of several stationary phase processes triggered by a nutritional downshift. Since the pioneering work of Anagnostopolous and Spizizen, a number of protocols for preparing competent B. subtilis cells have appeared. The following method, modified by Ron Yasbin from protocols developed in the Frank Young lab at Rochester, was used routinely in Stan Zahler’s wonderful bacterial genetics course at Cornell. This protocol assumes that you use a spectrophotometer that accepts 16×125 mm test tubes. If your spectrophotometer, like mine, works only with cuvettes, simply increase the culture volume to 10 or 20 ml in a 250-ml Erlenmeyer flask. 1. Streak recipient strain on one-half of a Tryptose Blood Agar Base plate. Incubate overnight (18 hr) at 37°C. 2. Inoculate a few colonies into 4.5 ml of Medium A in a 16×125 mm test tube that lacks visible scratches. Mix the contents of the tube thoroughly. Read its optical density at 650 nm in the spectrophotometer. Adjust the OD650 to be 0.1-0.2, maintaining the volume at 4.5 ml. 3. Incubate at 37°C with vigorous aeration. Read the OD650 every 20 min, plotting OD650 against time on semi-log paper. After a brief lag, the OD should increase logarithmically—that is, they should fall on a straight line. Note the point at the culture leaves log growth—the graph points fall below the straight line. In B. subtilis genetics, this point is known as t0. It should take 60-90 minutes of incubation and occur at OD650=0.4-0.6. 4. Continue incubation for 90 minutes after the cessation of log growth (t90). Transfer 0.05 ml of this culture into 0.45 ml of pre-warmed Medium B in a 16×125 mm test tube. Set up one tube for each transformation you intend to perform, plus an extra for a DNA-less control. 5. Incubate the diluted cultures at 37°C with vigorous aeration for 90 min. At this point, the cultures should be highly competent. 6. Add 1 μg of DNA to the competent cells and incubate at 37°C with aeration for 30 minutes. 7. Plate aliquots of the transformed cells onto selective agar. 10× Medium A base: Yeast extract 10 g Casamino acids 2 g Distilled water to 900 ml Autoclave, then add: 50% glucose, filter-sterilized 100 ml 10× Bacillus salts (NH4)2SO4 20 g K2HPO4•3H2O 183 g KH2PO4 60 g Na+citrate 10 g MgSO4•7H2O 2 g Water to 1000 ml Medium A Sterile water 81 ml 10× Medium A base 10 ml 10× Bacillus salts 9 ml Medium B Medium A 10 ml 50 mM CaCl2•2H2O 0.1 ml 250 nM MgCl2•6H2O 0.1 ml 第三章 芽孢杆菌表达系统发展简史 生物安全性要求我们的宿主菌最好具有非致病性。而绝大多数芽孢杆菌恰恰能满足这一要求，而且还具备了一些其他菌株所没有的优良特性。事实表明，芽孢杆菌可以作为一些原核生物、真核生物和哺乳动物等的外源蛋白的表达宿主。有的已经大规模投入生产。 蛋白质分泌（Protein Secretion）是指蛋白质经由细胞膜向细胞外运输的过程，又称为易位（Translocation）。蛋白质分泌是Bacillus的一大特点，蛋白质组学研究表明，.subtilis中至少有4种蛋白质分泌途径，大约有300个蛋白质可以被分泌到胞外。B.subtilis中主要的蛋白质分泌途径主要包括（1）Sec分泌途径和（2）Tat分泌途径，其它分泌途径有ABC转运子途径（ABC Transporter），主要用于细菌素等分子的输出；Com分泌途径，它与B.subtilis细胞感受态形成有关，负责此过程中外源DNA的结合和摄取，该过程是通过ComGC、ComGE、ComGD和ComGG这四个蛋白质实现的，经由该途径输出的蛋白质其前体信号肽由第四类信号肽酶（Type IV SPase）切割。微生物将蛋白质分泌到胞外是为了实现所需的生理功能。因B.subtilis蛋白质分泌功能发达，其主要的分泌途径可被用于外源蛋白质的高水平分泌表达。蛋白质分泌机理和应用技术是B.subtilis研究的重要课题。深入研究其分泌途径的机理，有可能克服其中存在的分泌瓶颈，将B.subtilis改造成为一个优秀的外源蛋白质分泌工厂。 第一节：芽孢杆菌表达系统的优点-----相对于大肠杆菌 1、非致病性：除个别种（炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌）外对人畜无害。 2、转化外源DNA的感受态系统也同样适用于转化重组DNA。 3、质粒和噬菌体都可以作为克隆的载体。 4、细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷璧质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟的。 5、能够大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单。例如：α淀粉酶、蛋白酶及杀虫晶体蛋白等。 6、良好的发酵基础和生产技术，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。 7、没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体：在E.coli表达系统中，若重组表达的外源蛋白质中含有大量连续的稀有密码子，则常常造成表达量低，或者翻译提前终止；而目标蛋白质产物形成包涵体会导致蛋白质不可溶，给分离纯化和回收目标蛋白质造成麻烦。而B.subtilis表达系统在这两个方面都不存在问题。 第二节：芽孢杆菌也有它的缺点如下： 1、能够产生大量的胞外蛋白酶，往往造成表达产物的大量降解。 2、能自发形成感受的的菌株极少，感受态持续时间短暂，分子克隆效率低。 3、存在限制和修饰系统，重组质粒不稳定。 第三节：助表达系统 芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统（参考文献：Tjalsma H, Bolhuis A, Jongbloed JDH, Bron S, Dijl JM (2000) Signal Peptide-Dependent Protein Transport in Bacillus subtilis: a Genome-Based Survey of the Secretome. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 515–547.），利用好这些有用的元件，就可以完成目的蛋白的高效分泌表达，从而避免讨厌的包涵体的形成！ 第四节：芽孢杆菌基因表达的主要特点： 1、对数生长期后进入芽孢形成期，不同的芽孢形成阶段所表达的基因不尽相同。 2、多Sigma因子：RNA聚合酶全酶由5个亚基（α 2 β β’ ）组成。 σ因子的主要功能是帮助核心酶识别特定的启动子而结合到转录的起始部位，转录开始后就不起作用了。芽孢杆菌中已发现的σ因子有7种，而大肠杆菌只有2种。因而，大多数阴性菌的基因不能够在芽孢杆菌中直接表达而需要更换启动子等元件。 3、核糖体结合为点（RBS）：枯草杆菌最典型的SD序列是“GGAGG”，而大肠杆菌的为“AAGGA”。 4、大肠杆菌分泌蛋白往往分泌到两层细胞膜之间，而芽孢杆菌只有一层细胞膜，因而可以大量分泌蛋白至培养基中。通过计算机分析，枯草杆菌有将近300个N端具有信号肽用来跨膜的蛋白。不过用来表达和分泌克隆基因的信号肽主要来自蛋白酶、淀粉酶和细胞壁表层蛋白等。 总的来讲，人们选择不同种的芽孢杆菌作宿主，一般都有着极强的应用研究的目的。目前许多实验室现在也在自主开发野生的芽孢杆菌表达系统，一是看中了其高效分泌表达的能力；另外，对于菌剂产品来讲，将外源基因在芽孢杆菌中表达，可以大大延长产品的货架期。 第四章 枯草芽孢杆菌转录翻译系统的简要介绍 构建表达载体常用的启动子序列比较 启动子名称 －35区 间隔序列长度 －10区 Ptrp TTGACA 17 TTAACT Ptyr-tRNA TTTACA 16 TATGAT Plac TTGACA 17 TATGTT PrecA CTGATG 17 TATAAT Para TTGACA 17 TACTGT λPL TTGACA 17 GATACT λPR TTGACA 17 GGTAAT SPO1 TTGACT 17 CATAAT P43 AGAAAT 15 GCGATT GTGAAA 17 TAAAAT SacB TTGCAA 17 TAGAAT consensus TTGACT 17 TATAAT 枯草芽孢杆菌中的σ因子 σ factor Gene(s) Function -35 spacer -10 σA(σ43,σ55) sigA,rpoD Housekeeping/earlysporulation TTGACA 17 TATAAT σB(σ37) sigB General tress response RGGXTTRA 14 GGGTAT σC(σ32) unknown Postexponential geneexpression AAATC 15 TAXTGYTTZTA σD(σ28) sigD,flab Chemotaxis/autolysinflagellar gene expression TAAA 15 GCCGATAT σH(σ30) sigh,spoOH Postexponential geneexpression;competence andearly sporulation genes RWAGGAXXT 14 HGAAT σL sigL Degradative enzyme geneexpression TGGCAC 15 TTGCANNN σE(σ29) sigE,spoIIGB Early mother cell geneexpression ZHATAXX 14 CATACAHT σF(σSPOIIAC) sigF,spoIIAC Early forespore cell geneexpression ZHATAXX 15 CATACAHT σG sigG,spoIIIG Late forespore cell geneexpression GHATR 18 GGHRARHTX σK sigK,spoIVCB:spoIIIC Late mother cell geneexpression AC 17 CATANNNTA 其中H指A/C;N指A/G/C/T;R指A/G;W指A/G/C;X指A/T;Y指C/T;Z指T/G. 第一节：转录系统 枯草芽孢杆菌σA因子所识别的启动子-35区和-10区与大肠杆菌类似，保守序列分别为“TTGACA”和“TATAAT”。σA因子识别的启动子两区域之间的间距为17~18bp，而其他RNA聚合酶的则不定，多为15~16bp。一般来说，当该距离偏离17bp，无论大或小时，启动子都会变弱。 在枯草芽孢杆菌中，许多启动子的-35区上游富含AT，该AT丰富区被称为转录增强区，对基因转录非常重要；在-10区的上游含有一个重要的TGTG基序（-16），这个区域的突变会显著的减弱启动子的强。 另外，在-10区到+1之间通常也富含AT，该特点主要是便于转录起始时促进DNA的局部解链。对很多依赖于σA因子的枯草芽胞杆菌的启动子的研究表明，它们带有规范的存在与大肠杆菌启动子中的-10和-35序列。 至少在枯草芽胞杆菌中，有很多启动子在-10区的上游都含有一个重要的TGTG基序（-16）。这个区域的突变会显著的减弱启动子的强度。 上述启动子在-35区的上游还保留了很多的多聚A和多聚T的区域。虽然这个-16区在大肠杆菌中发现，但是这样的启动子常常缺乏-35区，而在枯草芽胞杆菌中则有-35区。 迄今发现的枯草芽孢杆菌启动子主要有两种形式：一是单个的启动子，多数在快速生长期表达；另一类为复合启动子（最常见的例如P43），它包括串联启动子和重叠启动子。重叠启动子有这样一些特征：（1）不同类型的两个启动子重叠；（2）两个启动子有不同的转录起始位点或相同的起始位点；（3）启动子可能受时序调节。这类启动子在枯草芽孢杆菌感知外界环境变化，孢子形成等诸多方面发挥着重要作用。 终止子：一旦RNA聚合酶起始了转录，就会不停的合成核酸直到遇到转录终止位点。细菌DNA有两类转录终止位点：因子依赖型和非因子依赖型。在枯草芽孢杆菌基因转录终止方面，仅有少数基因得到很好的研究。它们的终止区都富含GC的倒转重复，后面跟着一串A(T)，即非因子依赖型的转录终止。有资料显示，枯草芽孢杆菌的终止子在结构和序列上与大肠杆菌相似，并发现大肠杆菌的终止结构在枯草芽孢杆菌中同样起作用。目前外源基因表达中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tφ。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。 第二节：翻译系统 1. 枯草芽孢杆菌mRNA的核糖体结合位点（RBS），也称为SD序列。其典型的SD序列为“GGAGG”，与大肠杆菌的“AAGGA”有所不同。一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述4个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低。 2. 核糖体的16S rRNA3’端参与识别mRNA并起始翻译，而枯草芽孢杆菌的16SrRNA 3’端序列与大肠杆菌是不相同的，枯草芽孢杆菌的核糖体只能识别同源的mRNA, 大肠杆菌的核糖体可以支持革兰氏阳性和阴性菌的mRNA指导蛋白质合成。因此，作为革兰氏阴性菌的大肠杆菌，其基因除个别的以外，一般的不能直接在属于革兰氏阳性菌的芽孢杆菌中表达，而芽孢杆菌的基因可以在大肠杆菌中表达。注：这是因为革兰氏阳性菌的核糖体30S亚基缺少S1蛋白，这可能涉及到核糖体结合位点的问题，另外阴性菌的启动子枯草芽孢杆菌不能够识别。 SD序列与起始密码子之间的序列也影响翻译效率，通常富含A+T的间隔区比富含G+C的翻译效率高15-50倍。SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成分对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌β-半乳糖的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，酶的表达水平低20倍。SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。一般的，“GGAGG”的最后一个G和起始密码子的距离为7~9个碱基。在此间隔少一个或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。 起始密码子在枯草芽孢杆菌中，多数基因的起始密码子为AUG，少数为GUG或UUG，AUG仍为起始密码子的最优选择。大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，这一序列不能与mRNA的5’端非编码区形成茎环结构，否则会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。 第五章 芽孢杆菌常用的宿主和载体 目前，芽孢杆菌中常用的载体主要有自主复制质粒、整合质粒和噬菌体三种。从芽孢杆菌中分离的自主复制质粒，除极少数以外（例如pBC16），均为无抗性标志的隐秘质粒。带有抗性标志的自主复制质粒主要来自其它G+细菌，特别是来自金黄色葡萄球菌的质粒。可复制质粒的复制子（Replicon）类型可分为滚环型复制子（Rolling-circle Replicon，或Rolling-circle Mechanism Replicon，简称RCM Replicon）和Theta型复制子（Theta Replicon）。RCM复制子质粒较典型的有pUB110、pC194和pE194，而Theta复制子质粒较典型的有pAMβ1。最近发现的B.subtilis内源质粒pBS72含有一种新型的Theta复制子。除个别质粒外，RCM复制子质粒通常不稳定，在不含抗生素抗性基因的条件下易丢失，而Theta复制子质粒则要稳定的多，是重组表达系统构建的良好材料。迄今，已在上述质粒的基础上构建了双标记质粒、芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭质粒、表达质粒、整合质粒和探针质粒等。绝大多数的载体在阳性菌中的拷贝数都相对低。 采用整合质粒将克隆基因整合到宿主染色体，是克服芽孢杆菌质粒不稳定性的一个有效的途径。整合的目的一般通过同源重组或者转座子插入来实现。这种质粒的基本结构是在大肠杆菌质粒的基础上增加一个芽孢杆菌的抗性标志，以及待整合的目的基因。它在大肠杆菌中进行基因克隆或亚克隆操作。整合质粒导入芽孢杆菌后，由于它没有芽孢杆菌质粒的复制起点而不能自主复制，只有插入到宿主体后，随着细胞复制而复制。在含有整合质粒中芽孢杆菌抗性标志的抗生素的培养基上，就可以很容易挑出这种整合体。整合质粒另一个重要的用途是用于目的基因的敲除。 1. 整合型质粒是一类具有选择性标记并以限制性复制为特点的质粒，它是在对枯草芽孢杆菌分子遗传学研究的早期阶段发展出来的一种非常有用的克隆载体。选择性标记一般为对某种抗生素的抗性，限制性复制通常是指这类质粒在大肠杆菌中具有自主复制的功能，而在革兰氏阳性细菌（如枯草芽孢杆菌）中不能自主复制。因此在有选择性压力存在的条件下，当这种质粒被转化入枯草芽孢杆菌后，所有的转化子都将质粒整合进染色体或其他能够自主复制的DNA单元中。一般整合型质粒都带有和枯草芽孢杆菌染色体同源的DNA序列，并在同源位点处整合入染色体。如果整合型质粒中只带有一段同源DNA序列，它将通过坎贝儿机制和染色体发生一个单交换而全部整合到染色体中；当它带有两段在染色体上相距比较近的同源DNA序列时，则还可以和染色体发生双交换而部分整合在染色体中。整合型质粒在枯草芽孢杆菌分子遗传学的研究中通常有以下几种用途： 1）.带有目的基因部分序列的整合型质粒可以通过单交换方式插入所研究的目的基因中而破坏其功能，因此可以用来构建目的基因的缺陷株，通过缺陷株的表型变化来研究目的基因的功能 (如图3-1所示)。 2）.染色体步移。用合适的限制性内切酶处理带有整合型质粒的染色体后，然后将酶切处理过的染色体片段自连，往往可以得到带有旁侧序列的“新”整合型质粒。在早期的枯草芽孢杆菌遗传学研究中，这种载体在确定染色体图谱方面是非常有用的。 3）.报告基因的融合。利用整合型载体可以很方便地将报告基因整合在染色体上，从而研究目的基因在单拷贝的自然状态下的转录和表达水平。 4）.基因的异位整合。利用双交换整合，可以方便地把不同的基因整合在染色体的同一个“中立”位点上来比较它们在“中立”位点的转录和表达水平，这可以有效地排除不同的整合位点对转录所造成的干扰。 5）.染色体上DNA序列的扩增。整合型质粒通过坎贝儿机制整合入染色体后，在所插入的质粒两侧具有同向重复序列，利用这种序列可以实现插入质粒在染色体上的串联扩增。因此仅仅通过提高抗生素的浓度，就可以筛选到目的基因剂量增加的菌株。当细胞内的染色体进行复制时，其中一条染色体因为偶然发生分子内重组而使整合质粒从该条染色体上脱落下来，一旦脱落的质粒通过坎贝儿机制而整合入另一条染色体中，就导致了整合型质粒在该染色体上的串联扩增。随着扩增程度的增加，细胞内两条染色体之间在重复序列处的双交换重组也能导致其中一条染色体上重复序列扩增程度增加，而另一条染色体上的扩增序列则丢失。 不少噬菌体都可用作载体，如Φ105噬菌体，SPβ噬菌体及其它噬菌体。其中 Φ105噬菌体应用较多，它是一个温和噬菌体，基因组约为39.2Kb，从中发展了不少载体。目的基因一般在体外“包装”之后，经噬菌体介导（转导）而进入宿主菌进行表达。 第六章 芽孢杆菌表达系统几个成功应用实例 1、中国 全球最大的EGF（表皮生长因子）供应商——中国百胜斯（总部上海） 首席专家烫懋竑教授：百胜斯的产品：化妆品伊丽白露 百胜斯公司，是国内专业从事生物产品研究与开发的高科技公司，公司首席专家汤懋竑先生为中国科学院遗传研究所研究员，最终解决了EGF芽孢杆菌基因工程系统的蛋白酶多、不稳定等世界性技术难题，研究开发出了具有世界领先水平的“汤氏芽孢杆菌基因工程系统”。采用该系统，EGF获得了高效稳定表达，大大降低了生产成本，从而占领了世界生物技术领域中的一个新技术制高点，为环保、工业、农业、医药业下游产品的进一步开发奠定了基础。 2、日本：文章很多，做得非常出色----短短芽孢杆菌表达系统 主要是运用了一段胞壁蛋白的信号序列来做表达，对各种表达瓶颈进行优化。他们也是主要用于生产EGF用于化妆品。日本人的短短芽孢杆菌的表达系统精细图示：五个串联启动子，两个SD序列，还有信号肽序列+结构基因。实际上后面应该还有强Terminator以防止通读。他们用本系统做过的蛋白：最高可达3.7g/L。很有意思，日本人还把EGF用在了羊身上！这样会使羊的表皮细胞快速分裂生长，最终结果导致羊毛变细！产出优质羊毛！ Brevibacillus brevis（短短芽孢杆菌）：做得最早和做的最早的当属日本的 S Udaka。有兴趣的可以搜索一下他所发表的文章。他对短短芽孢杆菌进行了一些非常详尽的研究，同时也建立了几套高效的转化方法，形成了自己特有的高效表达系统（后面实例将详细述及）。日本人还把短短芽孢杆菌的可以介导外源蛋白高效分泌表达的信号元件申请了N多专利保护了起来。 概念划分：短芽孢杆菌属是近年来刚刚从芽孢杆菌属独立出来的一个新属，地位与芽孢杆菌属是相当的，形象地来讲：已经不再是芽孢杆菌属的下级了, 短短芽孢杆菌自然也独立出来形成一个新种。短短芽孢杆菌作为表达菌株的几个优点：1、几乎不向胞外分泌蛋白酶（枯草芽孢杆菌至少分泌8种不同的蛋白酶），利于目的蛋白的稳定性。2、细胞壁相对于枯草杆菌来讲更薄，有利于外源蛋白的分泌。3、据研究其发酵液中存在着可以促进蛋白中二硫键形成的因子，可以促进外源蛋白的折叠。等等。 3、加拿大：Dr. Sui Lam Wong ，Associate Professor (加拿大卡加利大学 ) 可以说是我们华人的骄傲！祖籍应该是香港，科研工作非常出色的前辈，发现了枯草芽孢杆菌的新的蛋白酶，分子伴侣研究等。构建了敲除了8个蛋白酶基因的非常出色的枯草芽孢杆菌宿主菌WB800。 Dr. Sui Lam Wong 的研究方向和正在进行的内容： RESEARCH INTERESTS 1、Regulation of gene expression. 2、Molecular chaperone assisted protein folding. 3、Extracellular proteases. While the development and improvement of this microbial expression-secreted system are in progress, several medically important proteins including single-chain antibody, bacterial plasminogen activators (blood-clot dissolving agents) and interleukins are selected to evaluate this production system. Certain novel and desirable properties will be introduced into these molecules through genetic and protein engineering. 第七章 芽孢杆菌其他产品 第一节：核苷类产品 随着60 年代对呈味核苷酸研究的开展,发现枯草芽胞杆菌等可以在发酵液中积累核苷类物质,随后相继得到了一系列积累肌苷、鸟苷、腺苷、黄苷等嘌呤核苷的微生物菌株,并阐明了芽胞杆菌嘌呤核苷(酸) 的代谢途径,随后围绕菌种的选育和工艺的优化也进行了相当多的研究,取得了很大成就,形成和建立了完善的核苷(酸) 工业,成为继氨基酸发酵之后又一重要的产业。 核苷生产株常见的缺陷及抗性有：组氨酸缺陷，硫胺素缺陷，腺嘌呤及黄苷酸缺陷（可选），8-杂氮鸟嘌呤抗性，6-巯基嘌呤抗性，磺胺胍抗性，蛋氨酸亚砜抗性等。 国内研究单位：华东理工大学，江苏微生物研究所，天津科技大学 国内企业：广东肇庆星湖 第二节：核黄素 微生物发酵法生产核黄素至今已有约60年的历史，它具有生产工艺简单、原料廉价、对环境无污染等优点。真菌和细菌均可用于生产核黄素，主要生产菌种有棉囊阿舒氏酵母（Ashbya gossypii）、解朊假丝酵母（Candida famata）、阿舒氏假囊酵母（Eremothecium ashbyii）、酿酒酵母(Saccharomyces sp.)、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和产氨棒状杆菌（Corynebactia aminogensis）等。 生产核黄素的枯草芽孢杆菌一般为经过基因工程改造后的菌株。 核黄素生产株一般在获得良好的鸟苷酸积累的性能后，通过获得8-氮鸟嘌呤(8-AG)、8-氮腺嘌呤(8-AA)、6-巯基鸟嘌呤(6-SG)、德夸菌素、甲硫氨酸亚砜和磺胺类药物等抗性，然后继续诱变获得核黄素结构类似物玫瑰黄素(roseflavin)的抗性突变株。最后将核黄素合成操纵子连接到质粒转入宿主菌表达，或者整合进入染色体上进行表达，最终得到能够积累核黄素的生产菌株。 常见的缺陷及抗性有： 8-杂氮鸟嘌呤抗性，6-巯基嘌呤抗性，磺胺胍抗性，蛋氨酸亚砜抗性等。 国内研究单位：天津大学 国内企业：湖北广济药业 第三节：饲用微生物/益生菌 芽孢杆菌是一类好氧菌，在一定条件下产生芽孢，和常用的乳酸菌等益生菌相比，芽孢杆菌具有以下优点和特点：①具有耐高温、耐酸碱、耐压等特点，能够耐受颗粒饲料加工的影响；②在贮藏过程以孢子形式存在，不消耗饲料的营养成分，可以保持饲料的质量；③进入肠道后，在肠道上部迅速复活，复活率接近１００％；④芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸；⑤芽孢杆菌可以消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，抑制致病菌的生长，维持肠道正常生态平衡；⑥具有平衡和稳定乳酸杆菌的作用。 目前使用的菌株有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、东洋芽孢杆菌（Bacillus toyoi）等。 第八章 结语 总之，随着研究的不断深入，枯草杆菌蛋白分泌机制将得到更清楚的了解，许多新的分泌元件和蛋白酶都会被认识。相信在不久的将来影响枯草杆菌表达系统发展的问题会很好地被解决。除了上述的内容,关于芽孢杆菌分泌表达系统尚有其他问题有待进一步研究。首先需更深入地探索其分泌机制,透彻了解蛋白转运及折叠过程,尤其是分泌限速因素,对基因工程菌株的构建工作有重要的指导作用。其次,应利用先进的发酵技术和蛋白的优化设计,补偿菌株自身的某些缺陷,提高目的蛋白的产率。另外,将各种改进策略有机地结合使用,应能更显著地提高外源蛋白的分泌效率。总之,近年来对在芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的研究取得了很大进展,建立了一系列有效的外源蛋白表达系统,尤其是B . subtilis 和B . brevis 表达系统,已在一些有价值的多肽生产上获得了成功 ,显示出良好的应用前景。 今后它还会向着不断完善和扩大芽孢杆菌宿主/载体表达系统，提供越来越多价廉物美的产品造福人类的方向前进。 据文献报道，已应用芽孢杆菌，但这些菌还不是基因工程菌的有以下领域：洗涤剂、食品工业、苎麻脱胶、纸浆、纺织、污水处理、原油降解、石油增产、除臭剂、浸提金属、利用秸秆产丙酮等、降解低密度乙烯塑料、角蛋白降解、几丁质降解、木材处理、降解木质素、生产高麦芽糖浆、酱油渣做鱼饲料、植物生长刺激物、草地、根结线虫的防治、抗真菌、控制小麦和其它作物的根瘤、增产菌、芽孢杆菌固氮、细胞壁表面蛋白、杀软体动物、耐热蛋白酶抑制剂质慢性肝炎、病毒病和艾滋病、抗肿瘤、降低酒后血液酒精浓度、抗高血脂等等。 附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 WB600的构建： Engineering a Bacillus subtilis Expression-Secretion System with a Strain Deficient in Six Extracellular Proteases 枯草芽孢杆菌全基因敲除：Essential Bacillus subtilis genes 常用的枯草芽孢杆菌抗性盒： Antibiotic-resistance cassettes for Bacillus subtilis P43启动子的介绍：Overlapping Promoters Transcribed by Bacillus subtilis sigma55 and sigma37 RNA Polymerase Holoenzymes during Growth andS tationary Phases 翻译，RBS的介绍： The influence of ribosome-binding-site elements on translational efficiency in Baciiius subtiiis and Escherichia coii in vivo 无抗性标签质粒的整合：New integrative method to generate Bacillus subtilis recombinant strains free of selection markers 全基因组测序：Computerized genetic map of Bacillus subtilis 枯草芽孢杆菌的工业应用：Developments in the use of Bacillus species for industrial production 枯草芽孢杆菌的代表性综述：The Genus Bacillus—Nonmedical 最常见的枯草电转化方法：High osmolarity improves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis 附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心http://www.bgsc.org/ B.subtilis168的基因型查找：http://www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=T00010 芽孢杆菌调控元件数据库：http://dbtbs.hgc.jp/ 枯草芽孢杆菌专业论坛：http://www.xiaozhouzhang.com/BacillusBBS/ 本人博客：http://blog.sina.com.cn/hkfced 致谢： 参考文献： 枯草杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立及应用，张晓舟博士，南京农业大学 枯草芽孢杆菌食品级表达系统的构建和分泌表达研究，夏雨博士，江南大学 产核黄素枯草芽孢杆菌ribAH基因在ccpA基因位点的表达, 叶碧莲,天津大学 特别感谢南京农业大学张晓舟博士，本文以他在2004年在论坛上发表的一篇文章作为基础，综合了国内一些高校所作的成果，再加上本人这几年对枯草芽孢杆菌的粗略理解，整理了这篇文章，如有不当之处，请指正。欢迎讨论，积极交流是推动学术发展的主要动力。 河岸hkfced，2011年10月
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