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RFFIT适用于测定灭活狂犬病疫苗的效价(4)讨论
热度 10 yanjx45 2012-10-23 22:04
4. 讨论   腹腔注射不同稀释度的疫苗后,实验数据清楚显示了抗狂犬病毒中和抗体效价的剂量依赖性。多数的试验数据表明,免疫后第 14 天中和抗体效价达到最大值。无论是攻毒试验还是 RFFIT 检测血清抗体,该项试验结果是一致的。 我们进一步证明了检测狂犬病疫苗效价的两种方法之间具有很好的相关性。在对照性研究中,小鼠攻毒试验检测的小鼠存活率与血清学检测的平均中和抗体效价之间具有很好的相关性。其中,标准参考疫苗的相关系数 0.82 ,检测疫苗的相关系数 0.83 。在高可变性的动物试验中,这些统计数据都被认为是有效的。而且,我们已经证明小鼠攻毒试验中不能达到效价最小值的疫苗,在血清学检测中效价也是很低的。这对于狂犬病疫苗的检测上市是非常重要的。 我们的研究也证实了早期关于抗狂犬病毒中和抗体与脑内小鼠攻毒试验之间有很好的相关性的研究。尽管抗体效价不是评估免疫反应的唯一参数,但是它是用来评估免疫保护性的最广泛应用的检测指标以及免疫成功的可靠指标。我们发现免疫小鼠中和抗体效价(数据未显示)与早期的实验数据呈线性关系。我们也观察到有些试验小鼠完全没有产生中和抗体。这表明,在一定数量的实验动物中,有些对疫苗是高反应的,有些是低反应的,偶尔有些是不反应的。为了避免不反应实验动物带来的假阴性实验结果,在血清学检测中每组至少 6 只试验动物。只有当至少 5/6 的试验小鼠的中和抗体效价高于对照组实验动物,该疫苗才能够被认为有效。值得注意的是,小鼠攻毒实验检测受到个体免疫反应性的影响。然而,由于在该检测中每个实验动物只有 2 种可能的结果(死亡或者存活),所以检测结果的变异程度仍然没有血清学检测结果明显。 依据欧洲药典,两种效价检测方法要求采用不同的免疫途径:当小鼠攻毒试验采用腹腔注射时,血清学检测应该采用肌肉或者皮下注射。我们的实验数据表明免疫途径对抗体效价有明显的影响。腹腔注射途径抗体效价最高,肌肉注射途径抗体效价稍低,皮下注射途径抗体效价最低。这些实验结论证实了 Wunderli 等的研究。 Wunderli 等曾经证实在小鼠模型中,皮下注射途径是无效的。但是,与 Wunderli 等研究相反,我们不能推荐肌肉注射途径。依据我们的经验,在小鼠大腿背侧注射 100 μ l 剂量是相当困难的。一些动物实验指南中规定小鼠肌肉注射途径剂量为 50 μ l ,以及佐剂疫苗完全禁止肌肉注射,均证实了这种观点。因此,无论是小鼠攻毒试验还是血清学检测,我们常规实施腹腔免疫途径。我们觉得很难理解为什么对这两种检测方法要规定采取不同的注射途径。 RFFIT 被认为是一种可靠的重复性好的抗狂犬病毒中和抗体检测方法。 RFFIT 是目前为 WHO 、 OIE 以及欧洲药典推荐的检测方法。为了提高样本的检测量,我们建立了改良的 RFFIT 操作程序。改良 RFFIT 用微量滴定板替代细胞培养板。这样检测价格更加便宜,样品量更少。我们已经证实了改良 RFFIT 与标准 RFFIT 实验结果一样可靠,这 2 种方法是等价的。 与小鼠攻毒试验相比,除了更好的重复性之外,血清学检测还具有对实验动物损伤更小,需要的实验动物数量更少的特点。改良 RFFIT 符合 3R 理念中精练和减少的标准, 3R 即动物试验的减少、精练和替代的英文简称。在我们实验室,用血清学检测替代小鼠攻毒试验节省几乎 90% 试验动物。在欧洲每年生产几百万剂狂犬病疫苗,因此无论是生产商的实验室还是审评机构的实验室可以节省数以万计的试验动物。 总之,我们的实验数据表明血清学检测是灭活狂犬病疫苗效价检测的适宜方法。相反,由于缺乏重复性和精确性,广泛应用的小鼠攻毒试验被很多权威人士批判。然而,这些缺点也在我们的试验数据中反映出来。很多因素(如实验动物健康状况,实验动物饲养环境,以及实验室工作人员的实验技术等)都会对定量动物实验产生很大的影响。由于免疫和攻毒的途径不能反映自然感染状态, NIH 试验也被质疑。而且, CVS 显著不同于街毒。与用 CVS 攻毒相比,一些疫苗在用街毒攻毒时效价明显降低。这样,小鼠攻毒试验只能很粗略地反映出一种疫苗对使用对象的保护力。我们同意这样的观点:小鼠攻毒试验从未被科学地评估过,自从疫苗生产严格标准化并且在 GMP 车间、 GLP 实验室进行,该方法不再是合格的检测方法。我们支持 Wei β er 等人的观点,应当用一种简单的方法替代这种检测。尽管有缺陷, NIH 在所有备选的试验方法中仍然是金标准,必须据以评判任何其他替代方法。已经提出了几个替代 NIH 试验的方法。例如,抗原定量试验用于检测狂犬病疫苗效价。然而,一种疫苗的抗原浓度与该疫苗引发保护性免疫反应之间没有直接的相关性。因此这些检测只能是血清学检测有益的补充。此外,有建议用咬肌途径攻毒的小鼠外周攻毒实验方法。即使这种攻毒途径更加接近自然感染途径, NIH 试验的大多数缺点在此实验中也仍然存在。已经有人推荐几种血清学检测。这些血清学检测是基于用抗体结合试验、 ELISA 或者 RFFIT 检测免疫动物抗狂犬病毒中和抗体。一种比较复杂的抗狂犬病毒中和抗体定量检测的方法是小鼠中和试验( MNT )。然而与 RFFIT 相比, MNT 缺乏精确性和重复性。目前, RFFIT 广泛应用于抗狂犬病毒中和抗体效价的检测。然而验证后,改良的 ELISA 也能够用于抗狂犬病毒中和抗体检测。这种方法比 RFFIT 省时,而且不需要攻击病毒。 总之,尽管欧洲药典中有关注射途径和实验动物数量 ( 关于无反应实验动物 ) 的检测程序需要改良,但是血清学检测仍然是值得推荐的检测方法。此外还需要标准参考疫苗作对照。 我们应该鼓励监控机构和生产商放弃不精确的、违背伦理道德的小鼠攻毒试验,而代之以血清学方法检测狂犬病疫苗的效价。我们建议将血清学检测作为人用狂犬病疫苗效价检测的备选方法。以长远角度看,小鼠攻毒试验应该被完全取代。
个人分类: RV检测|8542 次阅读|14 个评论
RFFIT适用于测定灭活狂犬病疫苗的效价(3)结果
热度 2 yanjx45 2012-10-23 22:02
3. 结果 3.1.  免疫反应的测定 为了了解该免疫反应的特性,将“第五批狂犬病疫苗 WHO 国际标准品”, 按照 1 : 4 、 1 : 16 、 1 : 80 、 1 : 400 稀释,免疫小鼠,每组 10 只。免疫后第 11 天、 14 天、 17 天、 21 天采集血液,用 RFFIT 检测抗狂犬病毒中和抗体。大部分结果显示,在狂犬病毒中和抗体的效价在免疫后的第 14 天达到最大值(表 1 )。所有数据表明, 1 : 4 稀释的标准疫苗,产生的抗狂犬病中和抗体效价最高。相反, 1 : 400 稀释的标准疫苗,产生的抗狂犬病中和抗体效价最低。 3.2.  比较标准疫苗在小鼠攻毒试验和血清学检测中的结果 为了比较两种效价检测方法的结果,用小鼠攻毒试验和血清学试验,平行地检测不同稀释度的 WHO 第 5 批和 BRP 第 4 批标准品。该实验结果来自 8 个独立子试验共 1032 只小鼠。图 1A 显示的为 WHO 第 5 批标准品的试验结果,图 1B 显示的为 BRP 第批标准品的试验结果。 图 1B 小鼠攻毒试验检测方法中,小鼠存活率的曲线表现出很大的波动。相反地,表 1A 和表 1B 中抗狂犬病毒抗体效价平均值则表现出很好的量 - 效关系。 然而,组内免疫相同稀释度疫苗的小鼠抗狂犬病毒中和抗体效价则表现出很大的波动(数据没有显示)。甚至出现无法检测到抗狂犬病毒中和抗体的动物。 为了测定两种检测方法之间的相关性,用血清学检测 WHO 第 5 批和 BRP 第 4 批标准品免疫后中和抗体平均效价与小鼠攻毒试验中小鼠存活率之间有曲线关系(图 2 )。 Pearson 积差相关系数 0.82 ,提示两种检测系统的结果之间具有很好的相关性。 3.3.  比较不同待检疫苗在小鼠攻毒试验和血清学检测中的结果 来自 6 个不同的生产商的 14 种兽用狂犬病疫苗在两个检测系统中平行检测。图 3 显示在小鼠攻毒试验中检测阴性的疫苗在血清学检测中同样不能达到检测标准。同理,在小鼠攻毒试验中检测阳性的疫苗也能在血清学检测中达到的标准。两种检测方法的结果(尽管在本研究中涉及到不同的疫苗)相关系数为 0.83 。 3.4.  接种途径对抗体效价的影响 使用包括 WHO 第 5 批和 BRP 第 4 批标准品在内的 6 种不同的狂犬病疫苗检测不同的免疫途径对狂犬病毒中和抗体效价的影响。每种疫苗平行地注射 2 组小鼠:第 1 组小鼠腹腔注射,第 2 组小鼠肌肉或者皮下注射。免疫后第 14 天, RFFIT 检测每组小鼠的平均中和抗体效价(图 4 )。数据显示,尽管组内小鼠中和抗体效价差异很大(数据未显示),不同免疫途径小鼠中和抗体平均效价差异显著。皮下注射组小鼠产生的中和抗体效价最低( P0.0001 同腹腔注射组相比)。肌肉注射不同疫苗后检测中和抗体效价,明显高于皮下注射组( P0.0001 ),但是仍然低于腹腔注射组( P=0.0309 ) . 图 4 中所有的标记符号都明显的位于二分线以下。 3.5.   RFFIT 的改良 为了使大样本检测更加简便、高效,我们用微量滴定板替代细胞培养板以及调整样品和缓冲液的用量,从而改良 RFFIT 。而且,我们以往的试验数据(数据未显示)表明长时间的孵育有助于实验结果的一致性,因此加入细胞后的孵育时间由 24h 延长到 48h 。图 5 显示欧洲药典中改良 RFFIT 和标准 RFFIT 方法检测结果的对照研究。分析这两种方法结果的相关性,相关系数 0.988 。
个人分类: 狂犬病防治|6399 次阅读|3 个评论
RFFIT适用于测定灭活狂犬病疫苗的效价(1)摘要和前言
yanjx45 2012-10-23 21:57
摘要 欧洲药典推荐两种兽用灭活狂犬病疫苗效价检测方法:第一种是经典的小鼠攻毒试验,该实验具有实验结果不精确、耗时,并且动物实验有悖伦理道德等缺陷。另外一种检测方法是用 RFFIT 检测免疫小鼠血清中的中和抗体来测定疫苗效价。尽管该方法具有快速、实验动物痛苦少等优点,然而该方法尚未广泛应用,而且有关这两种方法的比较资料很少。 我们因此进行了比较研究,该研究显示了用小鼠攻毒试验检测的结果与用 RFFIT 检测的平均中和抗体效价之间具有很好的相关性。小鼠攻毒试验显示没有免疫保护力的疫苗,在 RFFIT 血清学检测中的抗体效价也是很低的。本文进一步阐述了不同的给药途径对检测抗体效价的影响,并且提出关于血清学检测程序的一些修改方案,以便提高该检测方法的实用性。最后,我们推荐将血清学检测应用于灭活狂犬病疫苗效价的检测。 关键词:狂犬病疫苗;小鼠攻毒试验; NIH 检测;血清学检测; RFFIT 1. 前言 依据 WHO 要求,应当用小鼠攻毒试验检测狂犬病疫苗效价。该实验方法最早起源于美国国立卫生研究院( NIH ),因此该实验也被称为 NIH 检测。在该检测中,通过与疫苗标准品的比较,来检测一种疫苗对于狂犬病毒感染的保护力。在欧洲, NIH 检测被强制应用于人用狂犬病疫苗效价的检测,一种改进的检测程序则推荐应用于兽用狂犬病疫苗的效价检测。 欧洲药典规定用以下的程序检测灭活的兽用狂犬病疫苗效价。包括标准参考品疫苗在内的待检测疫苗至少设置 3 个稀释度,每个稀释度分组至少检测 10 个动物。各个稀释度分组中每支小鼠腹腔免疫 0.5ml 。免疫后的第 14 天,所有小鼠脑内注射至少 10 LD50 剂量的狂犬病毒。记录死亡或者表现狂犬病症状的小鼠的数量,然后根据小鼠的存活率计算相对效价。只有当小鼠攻毒试验符合欧洲药典规定的一系列标准时,该实验才被认为具有检测的效力。只有当一种疫苗效价每剂至少达到 1 IU 时,该疫苗才符合要求。 NIH 检测由于其不精确性以及显著的变异性被业界广泛批评。已经报道, NIH 检测结果在实验室内和实验室间差异的曾有报导高达 10 倍。而且,该实验不能满足统计学方面的所有要求也是共性的问题。某一拥有长期检测经验的官方参考实验室报道, 42% 的 NIH 疫苗效价检测试验不能符合试验有效性标准。而且, NIH 检测在伦理学和实践性方面也是受到质疑的。首先,该实验采用腹腔注射导致试验动物严重的损伤。其次,对照组和接种最低稀释度疫苗组的实验动物产生狂犬病症状,最终在攻毒试验中死亡。而且, NIH 检测需要很多实验动物,费时( 4 周)而且价格不菲。此外,在攻毒实验中存在实验室工作人员暴露的风险。 1984 年 WHO 专家咨询委员会意识到,目前的狂犬病疫苗效价检测方法不能精确提示新疫苗的免疫保护力,并且明确提出改进或者替代 NIH 检测的要求。其它的权威机构亦要求替代小鼠攻毒试验。一种适宜的备选方法应该满足以下的要求: 1.  对实验动物造成更少的损伤而且所需动物数量更少。 2. 更少的试验不确定性。 3. 更快而且更容易操作。 根据欧洲药典要求,作为小鼠攻毒试验的替代,血清学检测可以被用于常规兽用狂犬病疫苗效价检测。该血清学检测每组至少免疫 5 只小鼠,免疫的剂量推荐为 1/5 检测疫苗剂量或者在小鼠攻毒预试验中摸索出的一系列令人满意的疫苗稀释度。免疫途径可以是皮下或者肌肉注射。注射后的第 14 天,采集血样,并且通过 RFFIT 来检测每个样品中的狂犬病毒中和抗体。只有当一种疫苗免疫产生的中和抗体效价不少于标准品疫苗产生的中和抗体效价时,该疫苗才符合效价要求。 血清学检测很显然地带给实验动物更少的损伤,需要更少的实验动物。但是,到目前为止,这种试验方法还没有被疫苗制造商和官方实验室广泛采用。几个研究机构已经证实 NIH 检测中小鼠的存活率与用 RFFIT 或者血清中和试验检测的小鼠狂犬病毒中和抗体效价有很好的相关性。 RFFIT 被进一步证明是一种具有很高重复性的试验方法。它通过测定狂犬病毒中和抗体保护培养细胞免遭狂犬病毒标准攻击毒株感染的能力,来检测血清狂犬病毒中和抗体效价。然而,目前还没有关于欧洲药典推荐的两种检测方法( NIH 和 RFFIT )之间的全面比较。 在本研究中,我们验证了小鼠攻毒实验结果与欧洲药典规定的血清学检测结果之间的相关性。而且,我们已经证实,血清学检测对常规疫苗质控的适宜性以及检测不符合质控要求的低效价疫苗的能力。此外,我们研究了这种替代方法的可行性,确定了应当优化的实验参数。本研究的总的目标是推进用血清学检测替代小鼠攻毒试验检测。
个人分类: 狂犬病防治|6396 次阅读|0 个评论
抗体点膜
asssan 2010-5-22 11:51
做生命科学研究,几乎每个实验室都用抗体,因此,抗体的效价对试验尤为重要。不知是运输还是抗体批次缘故,好多抗体效价并不令人满意,本人实验室就买到一点效价都没有的抗体,如果不进行点膜,检测抗体效价,匆忙试验,就造成时间和标本的浪费。所以,目前,我建议我们实验室对新买的抗体先进行抗体效价鉴定,然后做试验。我做抗体点膜的基本步骤如下 (1)用TBST配制5%BSA或脱脂奶粉,取0.5微升抗体溶解于上述溶液50微升,稀释度为1:100,然后对比稀释成1:200,1:400,1:800(当然可以有更高的稀释度) (2)各取10微升点膜(作好标记),晾干,室温约10分钟 (3)用5%BSA或脱脂奶粉封闭2小时 (4)加相应的二抗(我们实验室是用Rockland的荧光二抗),室温2小时 (5)回收二抗,用TBST洗三次,每次15分钟。 (6)扫描(我们用的是Odyssey Fluorescent Scanner (LI-COR Bioscience, USA),很好用哦。 下面是我做的两个个抗体的效价检测,一个抗体根本就没有效价,目前正在和公司交涉。
个人分类: 实验方法|4655 次阅读|0 个评论

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