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[转载]最新研究《Cell》纵向多组学揭示肠易激综合征（IBS）的潜在机制
niuneat 2020-9-18 13:26
谷禾健康 肠道微生物组与多种人类慢性胃肠道（GI）疾病有关。肠易激综合症（IBS）是一种普遍存在的疾病，其特征是反复出现腹痛或不适。IBS主要见于女性，并与粪便形式或频率变化有关，并基于主要便秘形式（便秘为主（IBS-C），腹泻为主（IBS-D）或混合型（IBS-M））。 由于动物和人类研究之间明显的脱节以及缺乏针对疾病特异性生理变化的综合多组学观点，因此很难确定肠道菌群在疾病中的作用机理。 近日，美国梅奥诊所消化内科和肝病科 Purna C. Kashyap研究团队和明尼苏达大学生物科学学院 Dan Knights团队合作在 Cell上发表了题为 Longitudinal Multi-omics Reveals Subset-Specific Mechanisms Underlying Irritable Bowel Syndrome 的文章，研究团队对IBS宿主生理进行了多组学测量的纵向研究 （gun弹枪浅宏基因组测序、16S rRNA基因测序、代谢组学研究，细胞因子测量，转录组和甲基化组分析）最终确定了IBS亚类型特异性、症状相关的微生物组成和功能变异，其中一组已确定的微生物代谢产物变异子集与IBS有关的宿主生理机制相关。 通过Lasso回归机器学习方法整合多个数据层，鉴定出的微生物代谢物变化的子集对应于与IBS相关的宿主生理机制。研究团队将嘌呤代谢确定为一种新型IBS宿主-微生物代谢途径，同时嘌呤饥饿被确认为潜在的IBS治疗靶标。 点评总结 这项研究主要采用了纵向多时间点采样，针对IBS这类症状波动较为明显的疾病研究纵向多时间点采样可以减少横断面研究的采样偏差，减少入组病人的数量但提高统计检验的效力。可以看到研究纳入的病人并不很多，但采用平均值之后统计效果明显。 另外研究同时进行了多组学的检测，包括代谢组和黏膜转录组等，通过对宏基因组功能差异的分析以及代谢组的差异分析同时锁定了多项代谢异常，尤其是次黄嘌呤的水平异常。进一步对次黄嘌呤水平与宏基因组的菌种进行关联分析锁定了重要的相关菌，通过SV关联分析，在更细尺度上筛选出了可能的功能基因区段。 这种组合方式提供了完整的研究思路，从人群尺度寻找疾病可能的代谢和生理机制，并经由多组学的关联分析锁定可能的菌种标志，再到精细化筛选出可能的功能基因。 在菌群方面研究采用了宏基因组和16S，对粪便样本采用宏基因组，对黏膜样本采用16S，因为黏膜样本含有较高的人体DNA，16S更为合适。粪便样本的宏基因组直接采用和RefSeq89版本进行比对注释，基因部分同时结合了序列比对和利用基因组数据直接提取注释相结合。宏基因组测序能够提供菌株层面的分辨率，同时也是后续结构变异关联分析的必要条件，随着参考基因集的完善，中等测序深度的 浅宏基因组 将可以大量应用于这类研究中 （浅宏基因组文末详细介绍和福利活动 ）。 全文介绍 全文缩略词整理： 肠易激综合征（IBS） 便秘为主的肠易激综合征（IBS-C） 腹泻为主的肠易激综合征（IBS-D） 混合型为主的肠易激综合征（IBS-M） 健康对照（HCs） 症状严重程度评分（SSS） 短链脂肪酸（SCFA） 靶向液相色谱-质谱（LC-MS） 5-羟色胺受体4（5-HT4R） 胆汁酸（BAs） 胆酸（CA） 鹅去氧胆酸（CDCA） 核磁共振氢谱（1H-NMR） 黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（XPRT） 嘌呤核苷磷酸化酶（PNP） 缺失区（DR） 可变区（VR） Bray-Curtis差异（BCD） 不规则性（BCDI） 差异甲基化区域（DMR） 本文用到的实验方法汇总： 样本人群和数据生成 18-65岁的IBS-C和IBS-D患者经过严格的筛查确诊患者入组。IBS-C和IBS-D受试者均符合罗马III级标准。有腹部手术史(阑尾切除和胆囊切除除外)、被诊断为炎症性肠道疾病、显微镜下结肠炎、腹腔疾病或其他炎症性疾病、在过去4周内使用抗生素、出血风险或服用增加出血风险的药物、过去一周准备接受结肠镜检查、怀孕、计划在研究期间怀孕、是易受感染的成年人以及年龄在18岁以下或65岁以上的志愿者被排除在外。 食物频率问卷（FFQ）和24小时饮食回想问卷 动物实验 小鼠实验 Ussing chamber 试验 Ussing Chamber，尤斯灌流室，离是研究跨上皮转运的工具，可用于包括离子转运、营养物质转运及药物转运等的研究。通过跨上皮转运的研究，可以了解上皮的离子通道机制、营养成分及药物透过上皮的吸收、影响上皮屏障功能以及通透性的因素等。本文的Ussing Chamber实验研究了5-羟色胺(5-HT)对结肠上皮短路电流(ISC；一种反映肠道分泌物的跨上皮离子流量的测量)的变化。 微生物组测序 QIAGEN PowerSoil 提取粪便和组织DNA 浅宏基因组使用HiSeq 2500（快速模式）单端读数为100 bp（1x100）和NextSeq 150 bp单端读数（1x150）进行测序。 扩增子测序，对核糖体RNA基因的V4区进行测序，扩增子序列与来自同一细菌基因组的16S rRNA基因在shotgun测序法中使用BURST。 微生物组数据分析 宏基因组部分使用的是浅宏基因组，使用1x100或1x150单端，使用BURST以97%相似度和RefSeq（v86版本）进行比对，过滤比对测序深度低于1万reads的样本。KEGG正射图也可以从参考基因组中进行预测，并利用SHOGUN对预测的图谱进行扩充，以改进对低丰度基因的估计 基因丰度部分是直接比对从refseq基因组中提取的KEGG注释序列，并利用SHOGUN改进低丰度基因的预测） 在测试亚组之间的分类单元差异之前，删除了90％的受试者中不存在的分类单元。 为了识别差异丰富的特征，使用FDR截止值0.25。 通过提取所有健康对照（HC）与HC或IBS样本之间的成对差异来计算基于Bray-Curtis差异（BCD）的不规则性（BCDI），并存储这些差异的中位数。HC值的第90个百分位数用作鉴定与HC样品不同的微生物组样品的临界值。通过随机抽取每个HC对象一个样本并在这些样本中识别BCDI 500次，对第90个百分位数的临界值进行了敏感性分析。 此外，还计算了平均HC微生物组丰度的第90个百分位数临界值。 使用平均值不会改变第90个百分位数的临界值（0.63）。 代谢组学 血清和粪便样品的核磁共振代谢（1H-NMR）谱分析，测定粪便样品中丙酸、丁酸和醋酸的相对丰度，非靶向1H-NMR谱判别分析(PLS-DA)模型确定了IBS亚组和HC粪便样本之间的代谢变异 通过LC-MS /MS进行胆汁酸分析 使用ACQUITY超高效液相色谱（UPLC）系统和Xevo G2-S四极飞行时间（Q-TOF）质谱仪上对样品进行了分析。 通过GC-MS / MS进行SCFA定量 使用7000D 三重四极杆 GC/MS（(Agilent Technologies Ltd.）对SCFA进行定量分析。7000D 三重四极杆气质联用系统是 GC/MS/MS 发展史上迄今为止最为成功的最新型号。使用真正的SCFA标准品绘制了11点校准曲线和合并的QC样品。 通过LC-MS / MS进行色氨酸定量 色氨酸定量使用LC-MS/MS在Waters Acquity UPLC上进行，色谱柱为T3 C18柱(1 ×50 mm，1.7 uM)，联用Waters Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪。 细胞因子测量 使用多路Luminex定量分析IL-8，IFNγ，IL-10，II-18，IL-22，瘦素，血管内皮生长因子（VEGF），膜结合免疫球蛋白（MIG），IL-1β，IL-17A，IL-1RA，IL-6和 TNFα。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）对TGFb-1进行了定量。 RNA测序和分析 提取mRNA, 使用Illumina High Seq-2000测序，使用MAP-RSeq v.2.0.0、edgeR 2.6.2、R包RITAN（https：//www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/RITAN.html）进行基因机损，差异表达和路径富集分析。 甲基基因组测序和分析 使用Illumina Infinium甲基化EPIC BeadChip评估基因组DNA中的全基因组甲基化，使用R软件包ChAMP 2.9.10、Combat方法、limma函数和Benjamini-Hochberg（BH）得到甲基化的CpG位点，使用R包RITAN，将与DMC或DMR相关的基因用于途径富集分析。 多组学数据整合 使用R中的Maaslin2软件包（http://huttenhower.sph.harvard.edu/maaslin）研究了粪便微生物特征与粪便代谢产物之间的关联。 使用最小丰度运行Maaslin2，将微生物特征的最小患病率分别设置为0.0001和0.5。 经FDR校正的q值的阈值设置为0.25。 将线性混合效应模型应用于与被设置为随机效应的受试者的关联。 用Lasso回归机器学习方法拟合，鉴定基因-微生物组和基因-代谢物关联，该基因模型使用每个基因的基因表达作为响应，并使用微生物组丰度或代谢物浓度作为预测因子。回归方法是一种对数值型连续随机变量进行预测和建模的监督学习算法，回归分为Linear Regression线性回归，Logistic Regression逻辑回归，Polynomial Regression多项式回归，Stepwise Regression逐步回归，Ridge Regression岭回归，Lasso Regression套索回归，ElasticNet回归。其中，Lasso回归方法是在统计学和机器学习中同时进行特征选择和正则化（数学）的回归分析方法，旨在增强统计模型的预测准确性和可解释性，在实践中，岭回归与套索回归首先岭回归。但是，如果特征特别多，而某些特征更重要，具有选择性，那就选择Lasso可能更好。 体内和体外次黄嘌呤消耗实验 Mega培养基中培养细菌，使用LC-MS测定培养上清液中的次黄嘌呤水平，在6周龄的无菌Swiss Webster小鼠上进行了单菌落实验。 次黄嘌呤（Sigma-Aldrich）管饲喂养后第4天，处死小鼠并收集盲肠内容物，使用Amplex Red黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶测定试剂盒（Thermo Fisher）测定盲肠内次黄嘌呤和黄嘌呤的总浓度 结果分析： 一 纵向采样克服了跨部门微生物组研究中的异质性 慢性胃肠道疾病中肠道微生物组的横断面研究提供了高度动态的生态系统的快照。 除了饮食，药物使用，生活方式和其他环境因素的影响外，随着时间的流逝微生物群的变化也可能反映疾病活动的变化。 该文通过对纵向数据进行二次采样，测试显着的分类单元，将单个时间点的结果与受试者平均所有数据所获得的结果进行比较，来评估纵向采样与横截面采样相比对识别成分变化的影响时间点。 比较不同时间点时，在各个时间点观察到的HC和疾病组之间的分类单元丰度差异非常不一致，并且与平均数据中观察到的变化不重叠。 当使用平均数据而不是单时间点数据时，发现多个链球菌属物种的丰度明显更高。与HC相比，IBS-D中新近鉴定出的门合生植物的丰度要低得多。 我们还发现，个体内部差异高于个体内部差异，这支持了我们对每个个体的纵向数据进行平均的方法（STAR方法，t检验p 0.0001）。 这些发现凸显了在慢性疾病中进行纵向采样的必要性，以可靠地识别使用横截面采样可能遗漏的微生物群变化。 因此，我们主要报告时间平均数据的发现。 最近的一项研究进一步证明了这一点，该研究表明，在多个采样时间点使用平均值时，常用的“组学”方法更为准确。 二 纵向采样揭示了随着时间的流逝，IBS-C微生物群具有更大的可变性 与HC和IBS-D受试者相比，IBS-C患者的粪便微生物群组成随时间表现出更大的变异性。 此外，与IBS-D样本相比，平均IBS-C粪便样本的香农多样性更高（ANOVA，Tukey HSD p值为0.016）。 粪便样品中结肠黏膜的微生物组成与腔微生物群有显着差异。 与HC相比，IBS患者的粘膜相关菌群的特征是变形杆菌水平明显较高。 与IBS-D或HC相比，IBS-C患者的与黏膜相关的微生物菌群与其各自的腔内微生物菌群相似性较低。 这可能反映出IBS-C患者菌群的迁移时间较长，而社区之间有更多的时间分化。 此外，IBS-C患者的粘膜相关菌群的个体内变异性随时间变化更大，这与我们在腔菌群中观察到的相似。 三IBS症状严重程度与肠道菌群的功能变化有关 在特定采样点使用IBS SSS(0-500)报告IBS的严重程度，IBS SSS是腹痛强度、频率、肿胀、对排便习惯的不满以及IBS对一般生活的影响的累积度量。我们观察到重度IBS-D（SSS300）中超过20种乳杆菌的相对丰度高于轻中度IBS-D（SSS300）。而且这与受试者食用益生菌或乳制品无关。 在粪便宏基因组学功能富集分析时，我们发现在FDR中74个KO与严重的IBS-C相关，而44个与严重的IBS-D相关。 重度IBS-C和IBS-D中均发现了乙醇脱氢酶（ADH）的KO途径，且在重度IBS-C和IBS-D比轻中度IBS中高。 乙醇脱氢酶（ADH）显示与双歧杆菌和链球菌属呈正相关。这些数据表明ADH活性可能与腹痛有关，腹痛是IBS-C和IBS-D共同的主要症状。 四 代谢组学与生理学结果阐明了肠道微生物群代谢对胃肠功能的影响 H1核磁共振（NMR）光谱显示，与HC相比，IBS-C患者粪便样本中的短链脂肪酸（SCFA）丙酸酯，丁酸酯和乙酸酯显着降低。与腔内代谢产物一致，与HC组相比，IBS-C组的结肠黏膜活检样品中的乙酸盐（通过气相色谱-质谱 测定）也显着减少。，SCFA的这些差异与膳食纤维的总摄入量无关，因为这在各组之间没有显着差异。 Ussing chamber 试验结果表明水分流伴随离子通量，并且分泌减少会导致便秘中粪便含水量降低。 相反，增加的离子通量可导致分泌更多的水，导致腹泻。色胺均显着增加了结肠分泌且在各组之间没有显着差异，表明，IBS患者和HCs的结肠上皮能够由色胺引起的液体分泌，因此观察到的变化可能是由于色胺的丰度变化导致。 进一步使用靶向液相色谱-质谱（LC-MS）方法研究了粪便样品中色胺和其他色氨酸代谢物的变化。 发现，IBS-D患者粪便样品中的色氨酸和色胺都显着增加，因此可能部分归因于IBS-D粪便中水分的增加。 我们证实这些代谢物的变化与蛋白质摄入的饮食差异无关。 使用LC-MS / MS我们IBS-D患者粪便样品中未结合的初级BA含量明显较高，而IBS-D患者粪便样品中未结合的初级BAs含量明显较低。与HC和IBS-C受试者相比，IBSD中个体初级共轭和非共轭BA和DCA-S的量更高。 由于像CDCA这样的羟基化初级BA可能会增加结肠分泌，因此运用Ussing chamber测试了CDCA在无菌小鼠结肠黏膜下黏膜下层制剂中的作用，结论支持了CDCA水平升高在增加IBS-D患者粪便中水分含量方面的生理作用。 五 联合多组学分析确定了IBS中 ​​的新型微生物代谢途径 采用了非靶向代谢组学方法来鉴定可能导致IBS病理生理变化的新型微生物途径。基于无目标1H-NMR光谱图的潜在结构判别分析（PLS-DA）模型的投影确定了IBS亚组和HC粪便样品之间的代谢变化。 与HC相比，IBS-C患者粪便样品中的赖氨酸，尿嘧啶和次黄嘌呤均显着降低。 IBS-D患者的次黄嘌呤含量也较低，尽管与IBS-C的意义不同。 分析IBS和HC患者粪便样本中次黄嘌呤相关的宏基因组学功能，发现IBS-C中的黄嘌呤脱氢酶/氧化酶（XO; 1.17.1.4）和黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（XPRT; 2.4.2.22）途径相对于HC有所升高。 XPRT从黄嘌呤单磷酸中释放出黄嘌呤，这是抢救嘌呤的第一步。 在下游，XO是一种具有低底物特异性的酶，可作用于黄嘌呤或次黄嘌呤以产生尿酸。 这些较高水平的XPRT和XO模块表明，IBS患者中肠道菌群对嘌呤的分解作用增加。 进一步检查了宏基因组的KO分析，以探索次黄嘌呤代谢的两个方面，即其在调节上皮能量状态中的作用以及在假定的氧化剂作用下生成H2O2和超氧阴离子。 与HC相比，IBS-C粪便中C氧化酶的丰度明显更高。 有趣的是，IBS-C中的超氧化物还原酶（1.15.1.2）升高，这可能反映了IBS-C肠道微生物组应对氧化应激的能力增强。 在XO活跃的情况下，这可能是必要的。 综上所述，这表明IBS患者的微生物组对次黄嘌呤的利用和分解能力增强，这与IBS-C粪便中次黄嘌呤水平的降低是一致的。 六 胆汁酸，丁酸和次黄嘌呤代谢有关 为了进一步阐明微生物对IBS中鉴定的代谢物丰度的贡献，首先基于线性模型（Maaslin2; http://huttenhower.sph.harvard.edu/maaslin）进行了直接多元相关分析。 这确定了HC样品有60种重要的代谢物种类相关性，IBS-C有28种，IBS-D有46种。 所有组均无相关性。 HC和IBSC或IBS-D中存在12个。 IBS-C和IBS-D子组都存在两种相关性。 尽管以上相关方法使我们能够识别粪便代谢物差异的潜在微生物驱动因素，但无法识别可能与检测到的代谢物差异相关的特定微生物基因。 因此，我们使用最近描述的将结构可变的基因组区域与代谢物丰度相关联的方法（SV关联），测试了可能导致各组之间代谢输出变化的特定细菌基因组区域。 七 微生物代谢有助于次黄嘌呤水平 为了更深入地了解微生物组在降低次黄嘌呤水平中的作用，选择了与Lachnospiraceae sp的基因组相似性选择了2个Lachnospiraceae菌株进行无菌小鼠实验，结果表明现定植了Lachnospiraceae sp的小鼠的盲肠内次黄嘌呤水平明显降低。 与长双歧杆菌定植的小鼠相比为2_1_58FAA（图4E）。 由于常规使用次黄嘌呤水平会增加，这表明微生物确定的次黄嘌呤水平是微生物生产与消耗之间平衡的结果。 八 IBS患者爆发时肠道微生物组和微生物代谢产物的改变 IBS是一种症状严重程度随时间变化的慢性疾病，大多数患者会出现短暂的症状恶化。前面纵向分析确定了肠微生物组与IBS患者症状严重程度之间的潜在联系。对个别报告中显示恶化时收集的粪便样本进行分析，与非爆发基线组合IBS样本相比，爆发期样本显示出更高的BCDI），与各个IBS子组的平均样本相比，爆发期样本的Shannonα多样性更低（图5C）。 在将IBS患者作为一组时以及在IBS-D和IBS-C患者中，特定细菌类群都与耀斑显着相关（IBS-D和IBS-C患者为168种，IBS-C为40种，IBS-D为7种） 与各自平均基线样本相比，来自Mann-Whitney U检验的q 0.1（表S2）。 这些重要物种在爆发期间几乎普遍减少。发现包括色胺，CA和CDCA在内的分泌代谢物在亚组中升高爆发时IBS患者的比例（BA为6/11，色胺为4/11）。 这些观察结果表明，不同患者的症状恶化可能是独特的微生物和代谢特征。 九 微生物组和代谢组学数据与转录组学和表观遗传学差异的整合揭示了IBS中新型的宿主-微生物组相互作用 对于大多数慢性疾病，IBS的病理生理是多因素的，其来自宿主途径，微生物途径和宿主-微生物共代谢。 为了确定微生物代谢对宿主功能的影响，我们首先比较了在结肠活检组织中观察到的转录和表观遗传学变化。 还通过构建跨组学相关网络，将转录组数据与代谢物和微生物群的丰度相集合，从而以无针对性的方式，使用这些数据来确定推定的宿主-微生物-代谢相互作用。 十一 多组学集成确定结肠上皮中的嘌呤饥饿是潜在的新机制IBS 前面确定了IBS-C和IBS-D中粪便次黄嘌呤的含量显着降低，确定了微生物次黄嘌呤的降解导致肠道次黄嘌呤的水平降低，并确定了功能性变化，表明IBS-C粪便中微生物组导致嘌呤降解的增加。 然而，由于次黄嘌呤是宿主-微生物共代谢物，因此其库可同时受到微生物和宿主代谢的影响。 其实，肠上皮细胞的嘌呤从头合成能力有限，而是主要依靠挽救途径进行腺苷酸的生物合成，因此，为了确定由于次黄嘌呤池的消耗而导致宿主的继发效应，需要进一步确认嘌呤挽救途径中可能的转录变化。嘌呤挽救途径中的第一个基因嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）在IBS-C和IBS-D中均表达高2倍。在IBS患者中PNP表达呈与次黄嘌呤水平呈负相关。 重要的是，宿主遗传学的变异不负责基因表达的这些差异，因为Illumina全局筛选阵列显示XDH和PNP中的单核苷酸多态性（SNP）在IBS亚组和HC之间没有差异分布。总之，这些发现提出了一种模型，其中微生物群和宿主的嘌呤核苷酸在结肠组织中诱导代谢应激。 反过来，这可能会通过增加嘌呤挽救而导致代偿性反应。 使用这种多组学观点，我们建议低水平的嘌呤核苷酸可能导致较低的上皮能量状态和粘膜修复能力，这可能部分是IBS的病理生理基础。 研究结论 在这项研究中，我们描述了在不同IBS亚型患者的宿主生理情况下，对肠道微生物组，代谢组，宿主表观基因组和转录组进行综合纵向多组学分析的结果。IBS-D患者活检中基线结肠分泌增加，这表明上皮运输的固有变化或促进液体分泌的代谢产物增加。 观察到的促分泌素（例如主要的BA CDCA和细菌代谢物类胰蛋白酶）的增加表明，较高水平的微生物群相关分泌化合物可能会导致IBS-D分泌增加。 三组结肠活检样本之间对色胺的分泌反应缺乏显着差异，这进一步得到了支持，如果结肠上皮存在固有缺陷，这是可以预期的。 先前的研究表明，BA吸收不良驱动了IBS-D的肠道分泌增加，但是在该研究中，继发性BA与原发性BA并存的增加并没有增加，这表明原发性BA的微生物生物转化减少可能至少部分地驱动了这种作用。通过进一步有针对性地整合多个宿主和微生物组数据层，确定了嘌呤代谢的宿主-微生物途径，这可能在IBS的病理生理中起重要作用。 研究意义 这是首次将次黄嘌呤与IBS发病机制联系起来，包括先前对动物模型进行的致生菌研究。 这说明了在人类中采用多组学测量以鉴定可能依赖于基因表达中人类特异性反应的潜在疾病机制的相关性。由于黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇（用于治疗痛风）和硫嘌呤（用于优化炎症性肠病治疗）的可用性，次黄嘌呤是有吸引力的药物靶标。 该研究为将来的研究提供了多个新的治疗靶标。IBS-D患者中BA明显减少的微生物生物转化可以使用确定的微生物菌群进行治疗，同样，在IBS-C患者中，细菌SCFA和/或色胺的产生增加可能是可行的治疗策略。 最后，在肠道内局部刺激微生物次黄嘌呤的产生或抑制黄嘌呤氧化酶将是一种增加腔次黄嘌呤的量而没有全身作用的新方法，并且可能对独立于疾病亚型的IBS有益。 研究的局限性 研究存在一些局限性。本文主要关注结肠微生物组，但我们知道小肠可能在IBS症状的产生中起重要作用。 需要专门针对小肠微生物组的纵向研究来补充发现并增进对IBS的理解。 福利活动和技术推广 本文的浅宏基因组测序方案是针对16s分辨率和宏基因组高成本之间的一个 折中方案 ，通过 降低测序深度 ，但是物种的分辨率 并没有低于 一般宏基因组（普遍5~10G数据量）。 经过几个月的研发的测试，我们推出 浅宏基因组测序分析服务， 每个样本数据量不低于 100万 reads，不通过拼接组装，直接基于标记基因的参考基因组方法进行种属丰度分类。结合其到菌株的物种分类和丰度数据可较16s方案下的PICRUST更加准确的预测基因构成。 周期在：2-3周左右，尤其适合粪便样本， 特别推荐。 浅宏基因组分析内容
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Cell Metabolism：COVID-19的脂质组学和代谢组学研究揭示新冠发病机制中代谢失调
zhoutianxing 2020-7-5 09:22
2019冠状病毒病（COVID-19）的大流行对全球公共卫生构成了前所未有的威胁。这是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的，该病毒以血管紧张素转换酶2（ACE2）为宿主进入受体。众所周知，病毒会引起宿主细胞脂质体的深刻变化，并利用宿主代谢资源为病毒感染的不同阶段提供能量。唾液酸通常存在于细胞分泌物和细胞外表面，作为附着在糖蛋白和糖脂（即神经节苷脂）上的末端基序，唾液酸的裂解介导了许多病毒的结合和传播。 肺泡II型上皮细胞作为SARS-CoV-2的主要靶点，合成对调节肺功能至关重要的表面活性物质磷脂，通过胞内途径不断分泌和循环。从支气管肺泡灌洗液中分离出的外泌体介导肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞之间的细胞间通讯，形成宿主防御和对空气传播病原体免疫的前沿。因此，有必要研究循环中宿主来源的外泌体是否与COVID-19的发病有关。 2020年6月，中科院遗传与发育生物学研究所、解放军总医院第五医学中心、 中科脂典 的相关研究人员在《Cell Metabolism》 （影响因子IF 22.42）上发表了题为“Omics-driven systems interrogation of metabolic dysregulation in COVID-19 pathogenesis”的研究论文，阐述了富含GM3的外泌体可能参与COVID-19发病机制的病理过程，并呈现了健康人群与COVID-19患者不同的最大的血浆脂质体和代谢组库。 本研究76名受试者的队列中，包括26例健康对照者和50例COVID-19不同疾病严重程度（即轻度、中度、重度）的患者。研究人员利用靶向和非靶向串联质谱联用技术来分析血浆脂质组和代谢组。对血浆样本进行了内部优化筛选后，血浆代谢组最终含有1002种代谢物（598种脂质，404种极性代谢物），这些代谢物使用71种内标物进行定量。一个由10种血浆代谢物组成的小组可有效地将COVID-19患者与健康人群区分开（AUC = 0.975）（图1）。 图1. 用于区分COVID-19患者和健康对照的血浆代谢物面板 研究人员对与COVID-19明显相关的血浆脂质组进一步分析发现，其类似于富含单唾液酸二己糖神经节苷脂（GM3）的外泌体，鞘磷脂（SMs）和GM3含量增加，二酰甘油（DAGs）含量减少（图2）。 图2. 与COVID-19严重程度相关的血浆脂质 随后，研究人员评估了COVID-19的血脂变化与相关临床指标的关联性。进行Spearman相关分析（p0.05）发现，磷脂酰胆碱（PCs），特别是多不饱和磷脂酰胆碱(PUFA-PCs)和缩醛磷脂酰胆碱(PCps)，与全身炎症的临床指标（白细胞介素6（IL-6）、C-反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、红细胞沉降率（ESR）、血清铁蛋白（SF））呈显著负相关，这表明血浆PUFA-PCs和PCps的减少与全身炎症加重有关。与PCs相比，只有磷脂酰乙醇胺（PEps）而不是多不饱和磷脂酰乙醇胺（PUFA-PEs）与全身炎症的临床指标显著负相关。此外，血浆GM3是唯一一种与T细胞计数（TCellC）和 CD4 + T 细胞计数（CD4.TCellC）呈强负相关的病理改变的脂质（图3）。 图3. 血浆脂质与临床指标的相关性 脂质水平之间的强相关性可能意味着这些脂质存在于一个共同的代谢途径上并且是共同调节的，与健康状态相比，改变疾病中脂质对之间的相关性模式可能预示着病理上相关的代谢失调。因此，为了破译感染早期的脂质途径失调，研究人员使用多尺度嵌入式差分相关网络分析对COVID-19中的代谢异常进行系统评估，揭示与病理相关的脂质模块（图4）。 图4. 轻度COVID-19中血浆脂质与健康对照组的差异相关性分析 最后，研究人员对从同一队列的血浆中分离的外泌体进行脂质分析，验证了基于血浆脂质组的假设，发现疾病严重程度升高的COVID-19患者的外泌体中越来越多地富含GM3（图5）。 图5. COVID-19患者外泌体的脂质变化 综上所述，该研究对 COVID-19相关的血浆变化进行了广泛的脂组学和代谢组学分析，并结合差分相关网络分析，发现了可鉴别COVID-19与健康对照组的血浆代谢物小组，以及与COVID-19在病理上相关的代谢物簇，并提供了证据表明富含GM3的外泌体参与了COVID-19的发病机理。 中科脂典技术总监Lam Sin Man 博士 (遗传发育所客座科研人员)是本文的共同第一作者，新加坡国立大学校长研究生奖学金（President Graduate Fellowship）获得者。2014年获益海嘉里优秀博士后奖项, 同年获得第7届中国博士后特别资助。研究方向包括基于液相色谱与质谱联用的高通量、高覆盖脂质组和代谢组半定量/精准定量方法开发，并应用于临床和生物学研究中。自2010年来，在Science, Nature Biotechnology, Gut, Cell Research, Diabetes Care, Development Cell, PNAS, Redox Biology, Nature Communications, Cell Reports, Diabetes, Plos Pathogens, Plant Physiology, Plos Genetics, Neurobiology of Aging, Analytica Acta Chimica, Journal of Lipid Research, BBA-molecular and cell Biology of Lipids, Journal of Chromatography A, Metabolomics等国际期刊发表 60 篇SCI文章。
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广泛靶向代谢组与转录组联合解析光核桃果实发育和着色机制
QinYY 2019-12-5 22:02
广泛靶向代谢组与转录组联合解析光核桃果实发育和着色机制 研究单位：西藏农牧科学院 期刊： BMC Plant Biology 发表时间： 2019 年 11 月 研究材料 三个品种： PMHR （血色果肉；野生）、 PMHY （黄色果肉；野生）和 PMHF （乳白色果肉；半野生） 三个时期：果核硬化期（开花后 60 天）（ A ），细胞增大（开花后 85 天）（ B ）和果实成熟（开花后 95 天）（ C ） 研究路线 研究结果 1. 光核桃果实转录组测序 三种果肉颜色和三个发育阶段的样品构建了 9 个文库，用于转录组测序： PMHYA 、 PMHYB 、 PMHYC 、 PMHRA 、 PMHRB 、 PMHRC 、 PMHFA 、 PMHFB 和 PMHFC 。每组 3 个生物学重复， 27 个样本的转录组测序共得到 195.56Gb clean data ，碱基质量在 Q30 以上占 92.21% 。基因挖掘分析显示，共有 1054 个光核桃的特异基因，其中 864 个有功能注释。样本聚类分析中所有的生物学重复聚集在一起，表明测序数据可靠。不同果实发育阶段的基因表达差异显著，但不同果肉颜色的基因表达差异不显著。这一结果表明， 在果实发育过程中，大量基因的表达发生了改变，而只有少数基因与果肉颜色的差异有关 。 2. 光核桃果实发育过程中基因表达的变化 果核变硬到细胞增大时期（ AvsB ），分别在 PMHF 、 PMHY 和 PMHR 中检测到 8080 、 7416 和 6976 个 DEGs ， 其中 4079 个 DEGs 在三个水果品种都存在。细胞增大到果实成熟时期（ BvsC ），分别在 PMHF 、 PMHY 和 PMHR 中鉴定出 2357 、 5344 和 5559 个 DEGs ，只有 950 DEGs 出现在 3 个品种。这说明不同品种果实在果核变硬和细胞增大阶段的分子机制是保守的，但 不同品种果实成熟过程的分子机制有所不同 。 343 个基因（ KEGG 富集到 MAPK 信号途径、淀粉和蔗糖代谢、类固醇生物合成、类胡萝卜素生物合成等途径），在从 A 到 B 和从 B 到 C 的发育过程中持续差异表达，证明他们是果实发育相关的主要基因。同时， 3736 个基因（ KEGG 富集到 MAPK 信号途径、氨基糖和核苷酸糖代谢、抗生素生物合成、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等途径）和 607 个基因（ KEGG 富集到植物激素、信号途径、 MAPK 信号途径、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等相关的途径），分别与 A 到 B 和 B 到 C 的变化有关。在 DEGs 表中随机选取了 5 个基因，经 qRT-PCR 检测，果实发育 3 个阶段 3 个基因型的 FPKM 变化倍数与 qRT-PCR 获得的相对表达量有很高的相关性。 3. 果肉着色相关差异表达基因的鉴定 作者用三个品种成熟期果实两两对比，鉴定果肉相关的差异基因。 PMHFvsPMHY 中检测到 4296 个 DEGs ，包括 2094 个下调基因和 2202 个上调基因。 PMHFvsPMHR 之间得到了 4523 个 DEGs ，包括 2387 个下调基因和 2136 个上调基因。 PMHRvsPMHY 之间发现了少量的 DEGs （ 2706 ），包括 1142 个下调基因和 1564 个上调基因。作者推断，从乳白色到血红色或黄色的变化可能比从黄色到血红色的变化需要更多的转录重组。接下来比较了 PMHFvsPMHY 、 PMHFvsPMHR 和 PMHYvsPMHR 中鉴定出的 DEGs ，寻找三种颜色变化过程的共有差异基因。 成熟期 3 个品种之间 563 个基因在组成和表达上存在差异 ，他们可能是代表三个品种间差异的关键转录本， KEGG 富集到植物激素信号转导、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、淀粉和蔗糖代谢、细胞色素 P450 对异种生物的代谢等途径。这些基因中只有 6 个参与类胡萝卜素合成，有很多基因参与苯丙酸 - 类黄酮合成，由此可见 苯丙素类 - 类黄酮途径的结构基因是果肉颜色的主要调控因子 。此外，分析调节类黄酮合成基因表达水平的转录因子家族（包括 MYB 、 bHLH 和 WD40 ）结果显示有 5 个 MYBs ， 3 个 bHLHs ，没有 WD40 转录因子。在 MYB 调控因子中， 4 个基因（ gene20317 、 gene9054 、 gene25173 和 gene22870 ）在彩色果肉（ PMHR 和 PMHY ）中的表达高于白色果肉 PMHF ，只有 gene13863 基因的表达趋势相反。对于 bHLH 转录因子，与 PMHR 和 PMHY 相比， PMHF 中只有基因 gene19413 表达更高。 3. 光核桃果肉代谢组学分析 广泛靶向代谢组学在光核桃 3 个发育时期检测到 493 种代谢物， PCA 分析显示 PMHF 的代谢物与 PMHR 和 PMHY 有明显差异。 PC1 可以表示发育阶段之间的分离，而 PC2 可以观察到果实类型的分离，这些结果与 3 个品种之间的转录结果是一致的。 4. 果肉着色过程中代谢物的差异变化分析 根据转录组的结果，果实成熟期是决定果实颜色的关键时期，作者研究了成熟期两两品种间的代谢物差异。 PMHFvsPMHY 共有 117 个差异代谢物，其中 43 个上调， 74 个下调。 PMHFvsPMHR 共检测到 107 个 DAMs ，其中 50 个下调， 57 个上调。 PMHRvsPMHY 中发现了 89 个 DAMs ，包括 27 个下调和 62 个上调的化合物。 3 个品种颜色变化过程共有 40 种差异代谢物，他们组成了 3 个品种间差异相关的关键代谢物 。这些化合物中， 25 个关联到了苯丙素 - 类黄酮途径，还鉴定到有可能调控果实颜色的 5 个花青素。 5. 果色相关的重要花青素和转录本的互作调控网络 进一步研究花青素在 3 个品种中的调控网络，对 5 种花青素在“关键代谢物”和“关键转录本”中含量变化进行相关性检验。结果表明，分别有 183 、 328 、 213 、 228 和 159 个转录本与 Jur487 、 Jur861 、 Jur1147 、 Jur929 和 Jur80 具有很强的相关性，代谢物 Jur80 、 Jur929 和 Jur487 比其他化合物相关性更高，也共享许多相似的转录本。调控网络强调了与花青素相关的主要转录本和每个品种对应的关键花青素。 总的来说， 血色果肉可能是高含量的 Jur80 、 Jur1147 和 Jur929 的组合；黄色似乎是 Jur80 、 Jur1147 和 Jur487 适度积累的结果；而乳白色可能是由于 Jur80 的弱积累和高含量的 Jur487 和 Jur861 在光核桃果肉中形成的 。 研究结论 本研究利用代谢组和转录组联合分析来研究光核桃果肉颜色的调控网络。通过分析 3 个品种果实在不同发育时期的转录水平，发现果肉主要在成熟期着色。进一步在 3 个品种中 确定了 563 个与果实颜色和其它差异相关的基因 。代谢组分析在 3 个品种中 确定了 40 个差异代谢物 ，包括 5 个可能与果实颜色相关的花青素。基于花青素及其相关基因构建了调控网络，说明了它们生物合成的调控机制，为理解光核桃果实着色转录表达和代谢水平的相互作用提供了一个思路。 原文： https://doi.org/10.1186/s12870-019-2074-6
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“中国生物物理学会代谢组学分会第一次学术会议暨代谢组学2019年国际研讨会”有感
dzrdez 2019-4-21 18:54
“中国生物物理学会代谢组学分会第一次学术会议暨代谢组学2019年国际研讨会”有感 赵秀举 一，大咖和才俊云集 英国Jules Griffin， 复旦金力（丁琛，代）， 美国韩贤林， 加拿大厉良， 日本Masanori Arita， 大连化物所徐国旺， 十来个顶级期刊论文的通讯作者，首台（套）仪器发明人，重点/重大项目负责人， 二十来个顶级期刊论文的一作，一流期刊论文的通讯作者，重点/重大课题负责人。 二，代谢组学数据采集 核磁共振（NMR）代谢物浓度与氢原子浓度成线性关系【无偏】，但灵敏度低；色谱质谱（XC-MS）灵敏度高，但衍生化等效率不尽相同【有偏】，因此最好先做NMR，再做XC-MS。 初生代谢物和次生代谢物，同时测定，同时分析。 代谢物鉴定、浓度和流量，同时测定，同时分析。 代谢组学的数据是不充分的，最好有验证或者互补数据。 三，代谢组学数据分析 主成分分析（PCA）、（正交化）偏最小二乘（O）PLS，需要同时满足①多重共线性②变量数＞＞样品数③多元正态分布；不满足以上条件，建议选用其他方法。 判别分析是定性的回归分析，建议优先使用回归分析，因变量可以定量，也可以定性；PLS(Y=class)就是PLS-DA；有多个组时，可以用PLS（Y=class）计算得分【此时不做载荷图】，但不用PLS-DA。 同时回归（相关）分析的自由度是Σ（求和）-2，不是min（最小值） - 1。使用t检验进行均值比较，自由度的确定依据样本量和方差来确定，详细见生物统计学 《生物统计学》教材提纲——试验设计数据分析、计量经济学与流行病学 有关教材。 有多个组时，先所有组定性PLS，再两个组的定性PLS。 跨学科和学科交叉，是新见识的增长点。但是，传统流行病学（人多、指标相对少），进入代谢组学（化合物信号多、样品相对少），容易出现问题；传统生物学，包括代谢组学，由于样品量少，不满足正态分布，又不会其他分布，因而不加验证或强行用正态分布的分析方法（例如t检验）。样本量，少了不行，多了也可能有问题。 四，疾病和药物代谢组学 疾病和药物代谢组学，需要明确研究的水平【生化、酶学、细胞、类器官、动物、一二三四期临床；肿瘤干预仅仅在细胞及之下水平有效果，意义甚微】；同时往往涉及人类遗传资源。 人类遗传资源的收集保藏和国际合作，需要依照412号国务院令、国办办法和科技部通知，办理行政许可。 人类遗传资源管理条例（征求意见稿/送审稿），规定设立收集保藏单位和国际合作中方机构，外资不得控股。伦理专家建议，外资不得参股。医药公司反对收集保藏单位设立行政许可。当年作者建议国家临床医学中心，免于办理收集保藏的行政许可。不同主体意见分歧严重，条例从2005年立项起草，至今没有出台。 根据立法法和行政许可法，国务院决定设立的行政许可，施行五年，国务院应当制定行政法规或提请全国人大常委会制定法律，或者宣布设立决定失效。 参考文献 SIMCA-P 11 USER GUIDER Letter to JPR (unsubmitted) 博士学位论文答辩PPT BRMI: 850802 李春喜，等。生物统计学（第五版），科学出版社。 “科普与通识”微信公众号DZRDEZ_NC
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[转载]MWASTools -- 一个全代谢组关联研究R/Bioconductor包
chinapubmed 2019-3-15 12:49
MWASTools是一个整合分析大规模流行病学研究中代谢组数据的R包。 关键功能包括：质控分析；使用各种模型（部分相关，广义线性模型）进行全代谢组关联分析；统计结果可视化；使用统计全相关谱（statistical total correlation spectroscopy (STOCSY）进行代谢物分配；和全代谢组关联研究（metabolome-wide association studies，MWAS）结果的生物学解释。 网址：https://bioconductor.org/packages/MWASTools/ 时间：20170726 参考： MWASTools: an R/Bioconductor package for metabolome-wide association studies
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one week one paper 多组学联合分析为紫茉莉的甜菜色素合成通路提供新的视角
fendudloved 2019-1-31 09:00
Transcriptome and Metabolic Profiling ProvidesInsights into Betalain Biosynthesis and Evolutionin Mirabilis jalapa 期刊： Molecular Plant ， 2018 ， IF=8.8 研究材料：石竹属 技术平台： LC-MS ， RNA-seq ， RT-PCR ，一代测序，体外验证。 方案设计： 1） 对石竹属 5 个科的 8 种植物进行代谢物检测，推测出 49 种特异的甜菜色素； 2） 对 8 种植物中富含甜菜色素及缺乏甜菜色素的组织进行转录组测序，寻找控制甜菜色素合成的候选基因； 3） 对紫茉莉中的花青素合成基因进行分析，寻找石竹属植物中花青素与甜菜色素不共存的原因； 4） 对紫茉莉类黄酮代谢物进行检测，转录组分析，确定花青素合成限速步骤。 研究摘要 甜菜色素是络氨酸的衍生的色素物质，在在石竹中报道很大程度上与花青素互相排斥。本研究中，对紫茉莉和其他甜菜色素物种进行转录组和代谢组检测，以识别与甜菜色素合成的候选基因。候选基因中，找到了催化络氨酸羟基化和（羟基）肉桂酰 - 葡萄糖合成甜菜红素相关的 P450 基因和葡糖基转移酶基因。在紫茉莉高度表达的甜菜红素的花瓣中也检测到了花青素黄酮代谢通路的基因和代谢物。花青素合酶（ MIANS ）在甜菜红碱积累的花瓣中高度表达。然而 MjANS 酶活性位点发生了一段缺失。这一发现为甜菜红素的合成和花青素在该植物物种中缺失提供了新的见解。本研究也暗示了甜菜色素植物花青素合成的复杂性，以前的研究认为是花青素相关基因表达较少导致的。 研究结果： 1 多个石竹目物种代谢谱检测识别了 49 个差异甜菜色素 使用 LC-MS 检测 8 种产生甜菜色素的植物的代谢产物来筛选候选基因。测试的植物包括石竹属 5 个科的紫茉莉，甜菜，青葙，松叶菊，三角梅，太阳花，尾穗苋，梨果仙人掌。推测出 49 种特异的甜菜色素，包括 35 种甜菜红素， 14 种甜菜黄素。 14 种甜菜黄素包括常规的氨基酸衍生物，多巴 - 甜菜黄素，多巴胺 - 甜菜黄素。 35 种甜菜红素从单糖基化，二糖基化的甜菜红素到多糖基化甜菜红素都有分布。不同物种的甜菜素谱显著不同。 2 多物种转录组分析识别甜菜色素相关的候选基因 选择了几种积累和缺乏甜菜色素的石竹属植物组织进行转录组测序。富含甜菜色素的组织有紫茉莉的黄色花瓣、梨果仙人掌果皮、青葙的红色叶片、三角梅的紫色苞片。缺乏甜菜色素的组织有未成熟的紫茉莉的绿色花瓣、梨果仙人掌未成熟果皮。转录组筛选条件为，选择紫茉莉中成熟花瓣比绿色花瓣表达高的基因，选择梨果仙人掌成熟果皮比未成熟果皮高表达的基因。两组高表达的基因选择同源基因，进一步根据选择的基因去寻找其他积累甜菜色素的物种的同源基因。最后手动根据与植物代谢物生物合成，修饰，运输，调节相关的蛋白注释确定最终候选基因。确定 17 条候选基因，这其中包括之前报道的两条基因 DOPA4,5- 双加氧酶（ MjDOD ）和环 - 多巴 -5-O- 葡糖基转移酶（ cDOPA5GT ）。 17 条基因分别为七个 UDP- 糖基转移酶，四个 BAHD 酰基转移酶，两个细胞色素 P450s ，两个转录因子和两个假定的转运蛋白（表 1 ）。 表 1 通过 NR 数据库比对确定的紫茉莉甜菜色素合成，转运，调控相关的候选基因 3. 候选基因的表达模式 选择黄色，红色和粉红色的混合颜色的紫茉莉成熟花瓣，花发育过程中仍保持无色素的未成熟花瓣和萼片组织来 RT-PCR 验证 17 个候选基因的表达。结果表明有 6 条基因在成熟花瓣中表达比较高，包括三种 UDP 糖基转移酶，两种 BAHD 型酰基转移酶和一种 ATP 结合（ ABC ）型转运蛋白（图 1 ）转录组数据的基因表达模式分析发现， 6 条候选基因中， BAHD 酰基转移酶和一个 UDP- 糖基转移酶与 CYP76AD3 或 cDOPA5GT 高度共表达，时间表达模式发现，与甜菜色素的积累也是一致的。 图 1. 紫茉莉种中甜菜色素相关候选基因的 RT-PCR 和共表达分析 4. CYP76AD15 是紫茉莉中催化甜菜色素生物合成的第一步 已知紫茉莉中 CYP76AD3 催化 L-DOPA 转化为环 DOPA ，是甜菜素生物合成途径的一部分。但是紫茉莉中催化酪氨酸羟基化为 L-DOPA 的基因暂不清楚。紫茉莉的候选基因中有两条 CYP76AD1 家族的 P450 基因 CYP76AD15 ， MjCYP76 。基于与已知的甜菜色素基因共表达分析，认为 MjCYP76 是催化酪氨酸羟基化，甜菜色素生物合成的第一步。将 CYP76AD15 ， MjCYP76 分别单独转入烟草中，或与 DOPA-4,5- 双加氧酶基因 BvDODA1 共表达。预期结果是，酪氨酸羟化酶在单独表达时产生 L-DOPA 或当与 BvDODA1 共表达时产生β xanthins （图 2 ）。瞬时表达 5 天后，取样 LC-MS 分析，单独表达 MjCYP76 或与 BvDODA1 一起，表型上没有黄色色素的沉积，也没有检测到 L-DOPA 和β xanthins 。但是 CYP76AD15 单独表达检测到了 L-DOPA ，与 BvDODA1 共表达时形成β xanthins （图 3 ）。 图 2 甜菜色素生物合成通路 图 3 烟草中表达 CYP76AD15 基因产生 L-DOPA 和β xanthins 5. MjHCGT 催化羟基肉桂酰葡萄糖酯的形成 基于与先前报道的千日红的葡糖基转移酶（ GgSGT ）序列具有高度相似性，紫茉莉候选基因列表中（ Mj1 ）被注释为羟基肉桂酸葡糖基转移酶（ MjHCGT ）。转录组数据分析表明，紫茉莉中 MjHCGT 与 CYP76AD3 共表达。烟草中瞬时表达 MjHCGT 基因， LC-MS 分析显示在 MjHCGT 表达后出现肉桂酰葡萄糖，香豆酰葡萄糖，咖啡酰葡萄糖和阿魏酰葡萄糖化合物。空载中未检测出该代谢产物。 为了检测 MjHCGT 与酰化甜菜红素合成相关的活性，将 MjHCGT 与含有三种甜菜色素生物合成基因 CYP76AD1 ， BvDODA1 和 cDOPA5GT 的双元载体 pX11 一起在烟草中过表达， LC-MS 检测到了酰基化的甜菜色素，单独表达双元载体 pX11 时，未发现酰基化的甜菜色素。 图 4 瞬时表达 MjHCGT 基因在烟草检测到了酰基化的甜菜色素 6. 花青素合酶基因在紫茉莉花瓣中的表达 转录组分析过程中，找到了一条高表达的花青素合酶基因（ ANS ），该基因催化花青素通路的倒数第二步无色花青素变为花青素（图 5 ）。因为石竹类植物中甜菜色素和花青素是互斥的，所以这个结果还是非常出乎意料的。挑选紫茉莉中的 ANS (MjANS) 以及其他甜菜色素相关的基因进行 RT-PCR 分析，发现在成熟的花瓣中该转录本表达量比未成熟的花瓣和萼片都显著上调。 为了更好的了解 MjANS 在产甜菜色素的紫茉莉等植物中的表达，得到了该基因的全长序列，该序列与富含花青素植物的 ANS 具有高度同源性，但是 MjANS 比其他 ANS 基因缺失了 69 个氨基酸的序列。这段序列包含了 20G-Fe （ II ）加氧酶结构域的大部分活性位点区域。表明，紫茉莉进化过程中基因发生了部分缺失。 为了验证 MjANS 的功能，向拟南芥的 ANS 突变体中过表达 MjANS 基因，显示幼苗和种子中明显的颜色变浅。考虑到 MjANS 在 M. jalapa 花瓣中高度表达，基因组缺失导致缺乏花色素合成酶活性，为紫茉莉中缺乏花青素提供了可能的解释。 图 5 紫茉莉花瓣中花青素类黄酮合成通路基因的表达模式及类黄酮合成基因 7. 类黄酮和花青素途径基因在紫茉莉花瓣中表达 为了确定紫茉莉中的花青素的缺乏是由 MiANS 的突变造成的，实验从苯丙氨酸开始，寻找参与通路合成的基因。黄酮通路合成的基因中，在紫茉莉发育的 5 个阶段中，大部分基因花瓣发育过程中上调，发育结束下调。表达模式与花青素植物一致（图 5 ）。 LC-MS 对紫茉莉花瓣组织中的 黄酮类代谢产物进行检测，发现各种黄酮糖苷在花瓣中高峰度的表达，说明在紫茉莉中，类黄酮合成途径是有活性的，至少到了 DFR 的催化步骤。从紫茉莉花瓣中分离出全长 MjDFR ，没有明显的缺失，表明它可编码功能酶。 qRT-PCR 分析发现 MjDFR 在未成熟三种花组织中中具有较高表达。通过将 MjDFR 导入拟南芥 dfr 敲除品系（即 tt3 ）中进行 MjDFR 的功能分析，显示出正常的花色素苷和原花青素产量。
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one week one paper 多组学方法解析双酚A对斑马鱼授精后胚胎代谢的影响
fendudloved 2019-1-28 08:41
Proteomics integrated with metabolomics: analysis of the internal causes of nutrient changes in alfalfa at different growth stages 多组学方法解析双酚 A 对斑马鱼授精后胚胎代谢的影响 Environmental Pollution ， 2017 ， IF=4.35 研究材料： 斑马鱼胚胎 技术平台： LC-MS/MS 方案设计： 1） 选择不同浓度 BPA 溶液（对照， 4.4mMBPA ， 8.8 mMBPA, 17.5 mMBPA ）对受精后 2h 斑马鱼胚胎进行暴露处理 ； 2） 暴露处理斑马鱼胚胎 120h 后，取样进行代谢组检测和分析，代谢组样品为 4 组样本，每组样本 6 个生物学重复，每个生物学重复 10 个胚胎； 3） 暴露处理斑马鱼胚胎 120h 后，选择对照组和 17.5mMBPA 处理组斑马鱼胚胎进行转录组测序，每组 3 个生物学重复，每个重复 8 个胚胎； 4） 对差异代谢物及差异基因 KEGG 分析，相关性分析，解析暴露于 BPA 环境中，斑马鱼胚胎代谢机制的变化； 研究背景 : 双酚 A （ BPA ）是一种常用的工业化学品，广泛用于制造聚碳酸酯塑料和环氧树脂， BPA 衍生塑料通常用于生产各种商品，包括容器，电子产品和医疗器械。随着时间的推移， BPA 通过将其与塑料单体连接的酯键水解而从原始塑料中泄漏。因此，大量的 BPA 不断释放到环境中，特别是地表水和地下水，最终进入废水处理厂并最终沉积在沉积物中。然而，如果其在环境中浓度过高会激活雌激素活性，对人类健康，野生生物和环境具有重要威胁。除了假定的内分泌和生殖毒性，一些作者认为 BPA 暴露会破坏激素平衡，改变性腺功能，并影响鱼的肝脏卵黄蛋白原产生。然而，其中一些影响的作用方式尚不完全清楚。 结果： 1.BPA 处理后的斑马鱼代谢检测 对 24 个胚胎提取物进行 PCA 分析 ( 图 1) ，发现不同浓度 BPA 处理的胚胎可以明显分开。对检测到的代谢物进行差异筛选，正负离子模式下分别筛选到 30 ， 29 种差异代谢物，其中共有代谢物为 9 种。对差异代谢物进行聚类分析，代谢物的分级聚类揭示了两个主要的簇，一个包括在 BPA 处理时浓度增加的代谢物，第二个包括通过处理耗尽的代谢物（图 2 ）。聚类热图也反映出，当 BPA 浓度较低时，胚胎显示出与未处理一致， BPA 处理的两个高浓度的变化一致。功能分析显示，受 BPA 影响的大多数代谢物与氨基酸或核苷酸 / 核苷代谢途径有关。通过 BPA 处理观察到的核苷酸相关代谢物的减少，特别是次黄嘌呤和尿酸，可以解释为信号传导途径的变化。嘌呤代谢主要在 BPA 处理时下调，可能与观察到的谷氨酸水平增加有关。除此之外，脂质，糖及其衍生物以及类固醇代谢相关的生化途径的变化，与先前的转录组学和代谢组学一致。并且甘油磷脂代谢的变化提示 BPA 对细胞膜的损伤。 图 1 .24 个胚胎样本代谢物检测 PCA 分析 图 2. 对照组和处理组差异代谢物聚类热图分析 2.BPA 处理后的斑马鱼转录组分析 通过对对照组和 17.5 mM BPA 组 mRNA 水平变化的统计评估，发现差异表达基因 1381 个 (FDR0.05) ，其中上调基因 765 个，下调基因 616 个。根据 BPA 处理时的表达变化（图 3a ， b ），差异表达的 mRNA 水平的分级聚类确定了两个主要簇。 簇 A 包含通过 BPA 暴露上调的表达基因，而簇 B 包括下调基因。这些前二十个基因与不同生物过程的反应有关，包括雌激素刺激和异生素，氧化还原过程，代谢过程， 鳍再生，组织发育和细胞增殖。与之前的报道具有一致性，脑芳香化酶 (cyp19a1b) 是众所周知的鱼胚胎雌激素暴露的标记物，其在 BPA 处理样本中表达的增加与脊椎动物中 BPA 的雌激素活性一致。双酚 a 对参与细胞增殖和组织发育的不同细胞功能的破坏，核苷酸和氨基酸合成途径的改变可能与这些效应部分相关。此外， gstp2 mRNA 水平的上调可能与 GST 活性的增加有关，这是对氧化应激和细胞凋亡增加的反应。 GST 活性的变化被认为是 BPA 污染水生生态系统的一个标志。 图 3 对照组和胁迫组差异基因聚类热图 3. 代 谢组学和转录通路联合分析来解析通路的变化 代谢组与转录组数据的整合提高了对缠在生物过程的理解，从而深入了解系统作用机制。本研究通过 KEGG 数据库定义的代谢通路，利用已有的生物学知识差异基因和代谢物的数据集进行评估。 KEGG 对差异代谢物和差异基因进行共同注释，注释到了 70 个通路，至少含有两个差异代谢物， 38 个通路至少含有 4 个代谢物。并且这 38 个通路至少含有 2 个差异基因，这个结果显示代谢组和转录组数据可以同时反映 BPA 胁迫对斑马鱼胚胎的影响（图 5 ）。 4. 代谢扰乱的生物相关性分析 筛选 dre01100 模块特有的 45 个差异代谢物和 119 个差异基因进行相关性网络图构建（图 4 ）。其中与氨基酸代谢相关的基因和代谢物聚为第一大簇（图 4 ，红色椭圆），与嘌呤代谢相关的生物标志物次之，但密度最大（图 4 ，棕色椭圆）。因此，大部分代谢变化与蛋白和氨基酸的合成相关，是细胞的主要成分，与 BPA 胁迫导致的增值或者毒性相关。反映了 BPA 对鱼胚胎的信号 / 调节功能的破坏，这种活动与其作为内分泌干扰物的潜力有关。 通过基因和代谢物的上下调变化，可以推断观察到的不同生物标志物水平变化的生理意义（图 4 ）。与嘌呤，视黄醇，叶酸和脂质代谢相关的大多数代谢物在 BPA 处理时浓度降低，而几种氨基酸浓度增加，这些变化与相同通路基因的变化也相关。氨基酰基 trna 合成的干扰与 bpa 处理的胚胎中氨基酸浓度的增加有关，可能与维持稳态所需能量的减少有关。氨基酸浓度的变化影响着下游几种依赖的代谢和生物合成途径。叶酸缺乏症对胚胎发育的潜在影响途径可能与 BPA 对机体的阻断作用有关，可能与抑郁症状有关。 图 4. 差异代谢物和差异基因相关性网络图 类似地， BPA 处理的胚胎样品中前列腺素（ PGG2 或 6- 酮 -PGE1 ）浓度的降低可以通过观察到它们的产生酶 ptgs2b 的 mRNA 丰度的减少来解释。该效应与多达 7 种酶的表达增加相结合，所述酶催化来自共同前体，花生四烯酸或中间代谢物 PGH2 的替代途径（图 5 ） 图 5. (A) 视黄醇和 (B) 花生四烯酸差异基因 KEGG 代谢通路图 结论： 代谢组和转录组分析，反映了将斑马鱼暴露于 BPA 中会导致明显的代谢变化。在通路水平上整合转录组学和代谢组学的结果，展示了 BPA 暴露后的受影响的代谢通路。这个结论显示， BPA 和 BPA- 相关 化合物具有较强毒性作用，影响雌激素，雄激素，甲状腺癌，类视黄醇和前列腺素信号传导途径和胆固醇和脂质体内稳态。
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以“人民的名义”宣布 广泛靶向代谢组 才是最新的代谢组学技术
QinYY 2017-4-11 21:43
以“人民的名义”宣布 广泛靶向代谢组 才是最新的代谢组学技术 专注代谢组学研究， 近两年利用 广泛靶向代谢组 学新 技术在 Nat Genet、Nat Commun、PNAS、Plant Cell、Plant J、Mol Plant、Curr Opin Plant Biol 等杂志发表论文多篇，代表着代谢组学研究最新发展方向。广泛靶向代谢组学技术，区别于现有代谢物检测方法，该技术平台建立了LC-MS/MS代谢物数据库，整合了非靶向和靶向代谢物检测技术的优点： 1. 高通量 : 同时检测1500+种代谢物； 2. 高灵敏度 : 通过离子井进行富集 可以检测到很多低丰度的次生代谢物,而非靶技术无法检测到低丰度物质； 3. 定性准确 ：相比非靶技术，广靶利用分子量的同时利用二级谱进行物质定性； 4 .重复性好 ：一般3个生物学重复就可以（我们的 Nat Genet 只有2个生物学重复 ），动物样本可以做4个生物学重复。而非靶需要8-10个生物学重复。 5. 数据库全 ：每个物种都可以自建数据库，建立属于该物种特有的代谢库。 用广泛靶向代谢组学技术， 仅仅以水稻同一份群体材料 ，就发表了6篇文章 总IF达到68.4分 （下右图） 技术比较 这几篇文章的详解地址： http://mp.weixin.qq.com/s/-tv6xYmUlQemrk0Hc_14vg 同 时我们进行水稻、玉米、大麦青稞、西瓜、苹果、桑叶、茶叶等物种进行了研究。研究的策略包括 重测序+代谢组 ； 转录组+代谢组 ； 转录组+植物激素检测 ；黄酮物质检测。 此外，在其他方面的研究还有： 1.微生物单菌基因组（细菌，真菌，藻类）+代谢组 挖掘物质新资源 ， 杂志： Scientific reports， IF=5,2 研究内容：微生物 基因组 + 代谢组 挖掘 青黴菌（ Penicillia ）利用价值。 Grijseels S, Nielsen J C, Randelovic M, et al. Penicillium arizonense, a new, genome sequenced fungal species, reveals a high chemical diversity in secreted metabolites . Scientific reports , 2016, 6 1）本文发现新真菌物种之后，首先通过基因组测序，分析其组成及分类地位； 2） 确定其潜在功能之后，集中利用碳水化合物相关的数据库，对其潜在的酶生产能力进行研究； 3）同时结合基因组与代谢组数据，分析 P.arizonense 代谢产物丰富度，完成对其应用潜能挖掘。 2 . 环境微生物+代谢组 研究人体肠道健康 1） 杂志： Gut microbiota ， IF= 14 .9 研究内容：肠道微生物+代谢组学 研究运动员与宅男宅女的肠道代谢差异。 Title：The microbiome of professional athletes differs from that of more sedentary subjects in composition and particularly at the functional metabolic level 2）杂志： Nature Immunology， IF=20.1 研究内容：肠道菌群+代谢 研究I型糖尿病 题目： Gut microbial metabolites limit the frequency of autoimmune T cells and protect against type 1 diabetes 3） 医学方面： 转录+代谢 研究疾病 杂志： Scientific Reports IF=5.2 研究内容：代谢组学与 转录组学 研究子宫颈癌 Yang, K., Xia, B., Wang, W., Cheng, J., Yin, M., Xie, H., ... Fan, X. (2017). A Comprehensive Analysis of Metabolomics and Transcriptomics in Cervical Cancer. Scientific Reports , 7 4） 医学方面： 疾病生物标志物biomaker的筛选 杂志： Nature IF=32 研究内容： 发现前列腺癌重要标志物 - 肌氨酸 Sreekumar, A., Poisson, L. M., Rajendiran, T. M., Khan, A. P., Cao, Q., Yu, J., ... Nyati, M. K. (2009). Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostate cancer progression. Nature , 457 (7231), 910-914 . 5） 中西药药效研究 ： 确定药物药效，缩短临床时限，降低新药研发经费 杂志： Translational psychiatry， IF=5.5 研究内容：苏拉明能逆转成年老鼠的自闭症状。 题目：Naviaux, J. C., Schuchbauer, M. A., Li, K., Wang, L., Risbrough, V. B., Powell, S. B., Naviaux, R. K. (2014). Reversal of autism-like behaviors and metabolism in adult mice with single-dose antipurinergic therapy. Translational psychiatry , 4 (6), e400. 欢迎交流：QQ： 896374469
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生命科学研究中的大数据
hsm 2016-8-6 18:25
大数据包含三个层面：量大，多维度，完备性。量大这方面目前的基因测序数据已经体现，一个基因组有好几个 G ；多维度这个体现就是基因变异的数量，这个也具备了，即资源群体的全基因组测序已经具备了这个条件，但是农艺表型的维度不够，代谢表型和分子表型的拓展才能将维度不断加大；完备性就是不同变异的组合完备性，目前是最欠缺的，一个普通物种的基因有几万个，而我们研究的群体只有几百个，而按照完备性考虑，样本量达到上万才能基本达到要求； 于是可以预测，转录组检测、代谢组检测和基因编辑创造新材料将是生命科学大数据研究的支撑。
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植物“单个细胞”与“单一细胞群”的代谢组学
cjj1650 2014-7-28 15:52
植物“单细胞”代谢组学是指通过特定的分析方法，无偏检测单个细胞中的所有次生代谢小分子产物（分子量小于2,000 Da），如单个表皮细胞；“单一细胞群”代谢组则是指具有共同起源和承担相同生理作用的某一类细胞群中的次生代谢产物，如毛状体、保卫细胞。目前已知植物中的次生代谢产物数量约200,000种，单个物种中含有约7,000-15,000种，而叶片中存在约3,000-5,000种。由于次生代谢产物一般分布在特定的细胞中，器官和组织水平（混合细胞类型）代谢组往往存在“稀释效应”（dilution effect）或“均一化”（averaging effect），并不能真实反映细胞内的次生代谢途径和代谢网络。Misra等近期从三个方面综述了单细胞代谢组方面的研究，包括单细胞代谢组样品制备的技术方法，代谢组分析方法，以及单细胞和单一细胞群代谢组的具体应用。 国内类似的研究在香港浸会大学赵中振教授实验室比较成熟 （ http://scm.hkbu.edu.hk/tc/expertise/faculty_staff/full_list/index_id_4.html ） 。 Misra, B. et al. 2014. Plant single-cell and single-cell-type metabolomics. Trends in Plant Science , DOI: 10.1016/j.tplants.2014.05.005
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人尿代谢物发现3000余种并非最终结果
热度 8 zhpd55 2013-9-9 09:25
人尿代谢 物发现3000余种并非最终结果 诸平 据《科学日报》（ ScienceDaily ）网站 2013 年 9 月 5 日 报道，加拿大、美国、奥地利的科学家合作，花费了 7 年多时间，有近 20 位科学家参与的一项研究成果，对于人尿液中化学物质的分析鉴定。研究结果显示，人尿液中有 3000 余种化学物质或者代谢物， 预计 此项研究结果 将会对医疗、营养、药物以及环境测试有重大影响。 参与此项研究的科学家分别来自加拿大阿尔伯塔大学（ University of Alberta ） 生物科学系、计算科学系；加拿大国立纳米技术研究所；美国哈佛医学院（ Harvard Medical School ）马萨诸塞州总医院（ Massachusetts General Hospital ）心血管研究中心；奥地利 BIOCRATES 生命科学公司（ BIOCRATES Life SciencesAG ）。 此项目的资深科学家 David Wishart 指出，之前并没有想到会有这么多不同的化合物随着人们的尿液而进入厕所。 Wishart 的研究团队利用最先进的分析化学技术包括核磁共振光谱、气相色谱、质谱和液相色谱系统地识别和量化数以百计的化合物，而且人尿液样本来源广泛。为了帮助补充他们的实验结果 , 他们也使用了计算机数据挖掘技术来检索 100 多 年以来出版的有关人尿液研究的科学文献。这种化学物质的详细目录包括尿液中成千上万种代谢物的化学名称、同义词、概述、结构、浓度以及相关疾病，收录于一个免费的被称之为尿液代谢物数据库（ Urine Metabolome Database ）即 UMDB 。 UMDB 是一个世界性的促进临床、药物和环境验尿研究的参考资源库， UMDB 是由加拿大国家代谢组学的核心机构代谢组学创新中心来维护和更新。 医师、营养师和环境科学家对于尿液的化学成分特别感兴趣 , 因为它不仅显示了一个人的是否健康的关键信息 , 而且也与 他们吃什么、喝什么、服用什么药以及暴露于什么污染物的环境之中有直接关系。关于尿液分析用于医疗目的甚至可以追溯到 3000 多年前。事实上 , 直到 19 世纪 后期 , 尿液分析以颜色、味道和气味 ( 称为验尿 ) 为主要方法，是早期的医生用于诊断疾病的方法之一。即使在今天 , 每天都有成千上万次尿液的化学测试，被用于识别新生儿代谢紊乱 , 诊断糖尿病 , 监测肾功能 , 证实膀胱感染和检测非法药品的使用等。可以说 尿液检查对临床诊断、判断疗效和预后有着十分重要的价值。 Wishart 说， “ 大多数医学教科书只列出了尿液中的 50 到 100 种 化学物质 , 而 最常见的临床尿液测试只测量 6 到 7 种化合物 , 扩大尿液中已知的化学物质和改进尿液测试技术，我们可以在同一时间检测出尿液中的数百种化学物质，可以真正实现测试服务于医疗，为有效治疗提供参考依据。 ” 因此 这项研究的具有特别重大的意义 , 因为它将允许一个全新一代的快速、廉价和无痛医疗测试，即使用尿代替血液或组织切片进行检测相关生物标记物，为医疗提供参考依据。尤其是新的尿液测试结果对于结肠癌、前列腺癌、腹腔疾病 , 溃疡性结肠炎、肺炎和器官移植排斥反应等诊断治疗和预后，提供了重要参考，而且一直在积极进行开发，并即将进入市场投入临床应用。人尿液代谢组的研究论文已经在 PLoS ONE 杂志网站发表 ——Souhaila Bouatra, Farid Aziat, RupasriMandal, An Chi Guo, Michael R. Wilson, Craig Knox, Trent C. Bjorndahl,Ramanarayan Krishnamurthy, Fozia Saleem, Philip Liu, Zerihun T. Dame, JennaPoelzer, Jessica Huynh, Faizath S. Yallou, Nick Psychogios, Edison Dong, RalfBogumil, Cornelia Roehring, David S. Wishart. The Human Urine Metabolome . PLoS ONE , 2013; 8 (9): e73076 DOI: 10.1371/journal.pone.0073076 . 就 代谢组（ metabolome ） 单词本身而言，它是由 metabolism （ 新陈代谢 ） and genome （基因组 ) 演变而来的， 是指生物体内源性代谢物质的动态整体。而传统的代谢概念既包括生物合成，也包括生物分解，因此理论上代谢物应包括核酸、蛋白质、脂类生物大分子以及其他小分子代谢物质。但为了有别于基因组、转录组和蛋白质组，代谢组目前只涉及相对分子质量较小（ 1000 ）的小分子代谢物，而且是指在 特定组织 内发现的代谢物整体 。 人尿液的研究是阿尔伯塔大学等研究人员所进行的系列研究的一部分 , 旨在系统地描述整个人类代谢组。 2008 年，同样是阿尔伯塔大学的研究团队描述了人类脑脊液的化学成分； 2011 年他们确定了人类血液的化学成分。 Wishart 说他们目前的测定结果还不能认为是人尿液化学成分的最终结果，因为随着新技术开发和更加灵敏的仪器诞生 , 可能还会有许多种存在于尿液中的未知 化合物将被确认。事实上 , 几乎每一天都有新化合物被添加到 UMDB 。虽然人类基因组计划依然继续吸引世界绝大部分的注意力 , 但是 Wishart 认为他们在 人类代谢组方面 的 这些研究已经对人类健康有更明显和直接的影响。更多信息请浏览原文（ The Human Urine Metabolome ）。 相关文献题录： HMDB: the Human Metabolome Database
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生命科学问题幼稚的猜想（1）
drYZZ 2011-4-28 11:50
线粒体DNA的转录组(transcriptome)中有些片段可能与核DNA转录来源的小RNA及微RNA具有类似的功能 （张永忠） 近几十年来的研究表明，线粒体不仅仅是细胞的能量转换场，它们与细胞的许多代谢途径、信号途径，以及细胞的分化、病变、凋亡等有着密切的关系。 有人提出在卵母细胞发生过程中有些线粒体中出来的RNA参与生殖质(germ plasm)的组成。通过阅读其他相关资料，特别是线粒体DNA突变与疾病的关系，本人觉得线粒体DNA的突变并不一定是直接通过影响呼吸链上13种亚基的合成，或这13种亚基中的某一种或几种的功能而导致疾病的发生。而是这种（这些）突变导致其所产生的RNA（或小的线粒体RNA，smRNA,或其他类型的RNA）在与人体发育的某种阶段、某种组织（器官），或某种条件下的特定的代谢组(metabolome)的profile(不知怎么翻译这个词)发生相互作用时才表现出调节功能上的异常，从而导致疾病的发生。这可以较好地解释为什么不同的线粒体DNA突变常常会在致病方面表现出不同的组织特异性，并常在某一年龄段（之后）发病。 当然，不同基因突变的致病作用各不相同，这里只是猜想有些线粒体DNA(mtDNA)的突变可能是通过与特定的代谢组的profile相互作用而致病的。
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创新性评论：缺血性脑卒中气虚质患者的血清代谢组研究
xupeiyang 2010-7-1 17:09
该研究课题的创新： 1 、国内外可见 代谢组学应用的研究 ，涉及 阳虚、阴虚体质、 冠心病中医分型、大鼠肝郁脾虚证、高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀演变等，但未涉及 缺血性脑卒中气虚质患者的血清代谢组或缺血性脑卒中气虚质患者 代谢物组标志物簇的研究。 2 、 国内可见 缺血性脑卒中患者体质特点或 中医体质类型与中医证型关系的研究 ，国外未见；国内外均未 涉及 缺血性脑卒中气虚质患者的血清代谢组或缺血性脑卒中气虚质患者 代谢物组标志物簇的研究。 3、国内外未见 缺血性脑卒中气虚质患者的血清代谢组或缺血性脑卒中气虚质患者 代谢物组标志物簇的研究 。 编 号 2010101259
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