科学网—标签

相关帖子	版块	作者	回复/查看	最后发表

热度 1 smilesun 2012-10-4 17:59

适配体筛选的那些事~罗昭锋老师与群友的第一次交流记录.pdf 核酸适配体筛选的那些事 ——罗昭锋老师与群友的第一次交流记录 pdf版下载：适配体筛选的那些事~罗昭锋老师与群友的第一次交流记录.pdf 背景介绍：核酸适配体技术自发明以来，受到广泛的关注。适配体相比于抗体来说，具有稳定、易制备、无需使用动物、分子量小、储存运输简单、靶标广泛、可体外扩增、筛选快速等多种优势。看过上面的文字，你一定会为适配体的美好前景所吸引，但令所有从事适配体筛选工作者汗颜的是，适配体经过了二十多年的发展，至今并没有得到广泛的应用。原因何在？答案很简单：筛选困难。这是我经过多年摸索以及与国内外众多学者交流得出的结论。如果你不相信，去用 aptamer+ thrombin 检索一下，看看有多少文章？所有与 aptamer 相关的文章中，只有不到 5% 是做筛选的， 95% 都是做应用的，而应用的文献中， 815 篇都与 thrombin 有关，有六七种 aptamer 在超过一半以上的应用文献中使用。为什么这些作者都用这几种 aptamer 呢？因为好用的 aptamer 太少了。这也从另一个侧面反应： aptamer 筛选并不像看起来那么简单。国内很多早期做筛选的团队逐渐放弃了筛选，而很多从未接触过 aptamer 的团队以无为的气概开始了 aptamer 的筛选征程。如果全靠自己摸索，除非你有很高的实验天赋和悟性，否则三年两载筛不出来，是太正常不过的事了。在网上组织在线交流，就是希望大家能少走一些弯路。如果你发现我的解答不正确或者有更好的答案，希望能反馈给我，因为这会使更多人受益。罗昭锋简介：中科大生命科学实验中心老师，兼从事核酸适配体筛选技术研究，并主讲《文献管理与信息分析》。致力于推广科研相关工具，帮助科研工作者提高效率。倡导交流、分享与协作（ science2.0 ），推动我国核酸适配体研究快速发展。由于较少上 QQ ，所以除非约定的时间外，其它时间很少能回复 QQ 上的问题。如有需要，可以通过邮箱联系我： smilesun 【 at 】 ustc.edu 以下由群友整理：交流地点： QQ 群群名称：适配体 aptamer/selex 交流群号： 134854978 交流时间： 2012 年 9 月 23 日晚 8 点下次在线交流时间： 2012 年 10 月 21 日晚 8 点 2012 年 9 月 23 日晚 8 点，罗昭锋老师在适配体群中与大家进行交流，解答了大家在适配体筛选中遇到的许多问题，现将问题简单整理，可能整理的会有些错误请大家多多指教 ~~~~ 问 1 ：在做适体的 PCR 时候，循环数怎么确定呢？ 15 个循环的量会不会不够呢？罗老师答 : 关于 PCR 循环数的问题，有多篇文献讨论过。 2006 年加拿大的， 2010 年中国的一篇文献。文献如下，但这两篇文章的结果都是基于非变性 CE 电泳得出的结论，我本人认为并不可靠。建议利用 Q-PCR 来摸索扩增循环数，到达平台期再扩 4-5 个循环。但是这个问题还没有人能说清楚究竟多少循环合适。罗老师给出上面提到的两篇文献相关信息，同时提出自己对文章结论的一些怀疑。文章指出以不能出现非特异条带为准。文中所说的非特异条带，罗老师花了很长时间研究，其实就是不完全退火造成的，也就是说，如果用变性胶跑电泳的话，这些都是特异的产物。 1 Musheev, M. U. Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue. Analytica Chimica Acta 564, (2006) 91-96. 2 Ji, Y., Wang, Q. Q., Fu, J., Gao, X. Song, H. F. Optimization of Polymerase Chains Reaction Amplification for ssDeoxyribonucleic Acid Library Using Capillary Electrophoresis with Laser-induced Fluorescence Detection. Chinese Journal of Analytical Chemistry 38, (2010) 622-626. 问 2 ：前几轮荧光定量 PCR 扩增后看扩增曲线到达平台后容易下探头，这是为什么呢？罗老师答：往下走是正常的。我们用 Q-PCR 的曲线来检测筛选进程。筛选到后来，当你发现 Q-PCR 的曲线不再往下探头的时候，说明库容已经减小了。（在 2011 年 11 月中科大举办的核酸适配体筛选技术培训班上做过专门介绍）。问 3 ：做到后来克隆时候，做菌落 PCR 出来的是一条目的条带吗 ? 变性胶是否为银染？罗老师答：不是，我用 gelred(2011 年 6 月 1 日 , 买过 2 支 gel red ,41003 Gel Red TM Nucleic Acid Gel Stain, 10,000X in water 0.5 mL 679 Biotium) 染色。效果很好的。上海开放生物有卖。我现在都是用高通量测序，不过比较贵。克隆的方法有些慢。随后罗老师附上了他们 8% 变性胶的配方。 8% 变性胶配方并且指出，变性胶的上样 buffer ，也比较重要，生工的 2xTBEbuffer 没有 biorad 的效果好，但也可以使用。不过两者价格有差距，前者 15ml ， 100 块左右，后者 450 元。如果自己配，需要摸索一下，亦可以直接购买 sigma 的甲酰胺，加入一点染料，直接用作上样 buffer ，也是可以的。网上查到生工的变性胶上样 buffer ，配方如下：货号： SD6046 2x TBE-Urea Sample Buffer (178mM tris-HCl pH 8.0, 178mM boric acid,4mM EDTA,7M Urea,24% ficoll,0.02% bromophenol blue,0.04% xylene cyanole FF) 问 4 ：如果做克隆，您之前的结果好吗？罗老师答：几年前曾经做过克隆的，不过效果不好，富集程度不够，而且合成后亲和力很弱。那是失败的结果。问 5 ：请问您都用什么方法筛选过？是不是 CE 效率高？罗老师答：我几乎试过所有报道过的方法。譬如磁珠法、 CE 法、 NON-SELEX ， M-SELEX ， SPR-SELEX ，膜法， PAGE-SELEX 等等。 CE 效果还可以。曾经用 SA 做靶，实现过 CE 一轮看到复合物峰。 7 月底和国内的 CE 专家，本群的群友之一，石蕊 -CE ，三轮筛选看到复合物峰。去年国庆期间，用磁珠筛 SA ，四天四轮，也筛到了。蛋白建议用磁珠筛选，比较简单。也是目前成功率最高的方法。小分子难度相对较大一些，而且亲和力都不高。问 6 ：如果磁珠方法，靶物质应该有多变少还是逐渐增加？罗老师答：当然是由多变少问 7 ：对于链霉亲和素磁珠分离单链，有什么好的方法可以最大限度的降低生物素化引物等小分子的影响，又能保证目的链不丢失或者损失最少？（指降低生物素引物的影响）罗老师答：我来说一下 SA 磁珠法制备单链的问题：单链制备的产率受两个因素影响，一是 PCR 的产率；二是磁珠分离单链的产率； PCR 的产率通常都不高， 20-30% ；所以有很多是游离的生物素化的引物，建议先用 PCR clean 的纯化柱纯化一下，（我们用的是 sangon 的 PCR clean 试剂盒）。再用 Sa 磁珠分离。纯化柱一般都说回收 100bp 以上的链产率较高，我们试过对于 80bp 的 DNA 也没问题。 biotin-Sa 的结合，在低盐条件下容易脱落。所以洗脱时如果只用 20mM NaOH 容易导致 biotin 链的脱落（参见文献 1. A. Paul, M. Avci-Adali, G. Ziemer, H. P. Wendel, Streptavidin-Coated Magnetic Beads for DNA Strand Separation Implicate a Multitude of Problems During Cell-SELEX. Oligonucleotides, (Sep 4, 2009). ）。 1. 罗老师推荐的关于单链制备的一篇综述： C. Marimuthu, T. H. Tang, J. Tominaga, S.C. Tan, S. C. Gopinath, Single-stranded DNA (ssDNA) production in DNA aptamer generation. Analyst, (Feb 7, 2012). 2. 下面这篇文章建议先将磁珠用 NaOH 洗一洗，避免洗脱单链是 biotin 链的脱落： R. Wilson, Preparation of Single-Stranded DNA from PCR Products with Streptavidin Magnetic Beads. Nucleic Acid Ther, (Nov 2, 2011). 罗老师建议洗脱时，加入 100mM 的 NaCl ， 50mM NaOH 洗脱，维持足够的盐离子浓度，保证 biotin 链尽少脱落。化学所方晓红老师组，以及谭蔚泓老师组，他们用 200mM NaOH 洗脱，道理也在于维持较高的盐离子浓度。问 8 ：那罗老师您觉得 100mMNaCl ， 50mM NaOH 和 200mM NaOH 洗脱，哪个方法更好一些？ 200mM nacl 可以认为其实还是在模拟体内的环境。罗老师答：这个建议自己比较一下，每个人操作不同，可能得出的结论也不同。问 9 ：成功率较高的方案罗老师觉得哪个更靠谱些啊？罗老师答：磁珠是最简单的方法问 10 ：磁珠法筛选，文库与靶标在结合缓冲液中孵育后，怎么样洗脱能够多多的去除一些非特异性的 ssDNA 呢？还有 Lambda Exonuclease 来分离单链后可以通过那些方法知道分离的效果呢罗老师答： 1 去除非特异结合的方法就是多洗几遍，但也不能洗得过多，要保证留下的一定比污染的分子多才可能成功； 2 、 Lambda Exonuclease 来分离单链后可以通过变性 PAGE 电泳来检测。问 11 ：我在生工合成修饰的探针，变性胶电泳，发现 2 条带，应该是修饰不完全，有没有哪个公司合成修饰探针的质量好些呢？罗老师答：可以考虑 takara ，如果不是想在这件事情上 “ 反日 ” 的话。我的一个惨痛教训：去年十月到 12 月，我们整个实验室毫无进展，原因是生工把引物合成错一次，污染一次。我有个建议，对所有做 aptamer 的人。建议合成 pool 和合成引物不要在一家公司合成。这样会大大减低污染的概率。譬如我在 takara 合成 pool ，在生工合成引物。如果特别喜欢某家公司，一定要在一家公司合成的话，建议先合成引物，再合成 pool 。道理是避免 pool 对引物产生污染。问 12 ：那个适配子的片段都很短，那么会不会很容易污染 PCR 仪，并且很长时间的污染罗老师答：污染是 aptamer 筛选过程中很大的问题。 PCR 仪不会污染，但实验环境中可能会有气溶胶污染。问 13 ：那如何解决呢？罗老师答： PCR 仪倒是没关系，因为扩增前后都是盖着盖子的。关键是环境中的气溶胶污染。非常难以解决，做了很多尝试，也问了很多人，目前还是觉得很难。一个方法是：物理上的空间隔离。另外，我们还有个方法，就是 PCR mix 批量配置，这样可以避免 PCRmix 配置过程中被污染的概率。 PCRmix -80 或 -70 储存半年一年都没什么问题的。就是把 PCRmix 除了模板以外的部分都加号，混合均匀。分装成 500ul 或 1ml 一管，储存在冰箱。下次用到直接拿出来就可以了。问 14 ：罗老师的 MIX 是自己配置的吗罗老师答：是的。如果不差钱，买配好的 mix 效果可能会更好。问 15 ： mix 用的酶就是普通的 Taq 酶么罗老师答：我用的多半是生工的 pfu 。不同的酶扩增效果有差异。最近计划试试 biorad 的 PCR mix ，不过还没到货。问 16 ：文献里说 taq 酶这种不是高保真的酶，可以增加库容的。罗老师答：有人用其实库容很低的库，然后用易错 PCR 来做筛选。我觉得没必要这样来增加库容。 aptamer 筛选的库容足够大了。问 17 ：曾经用过 pfu 酶做分子实验，感觉这个酶对模板要求很高，罗老师答： pfu 和 taq 扩增的结果确实有差异。不过对于我们的使用来说，觉得没什么问题，也就没再仔细研究了。问 18 ：热启动酶怎么样呢？罗老师答：我试过大约 4 家公司的热启动酶，感觉效果也没有太大的变化问 19 ：罗老师一般初始的库容量有多少？罗老师答： 10E15 ，差不多是 1 个 OD 做一次。问 20 ：对于固定系列，直接用文献里的可以吗？一般文献上给的适配子序列会不会是故意给错的呢？我们原来也用人直接用过文献里的序列，结果发现特异性及亲和性没文献里说的好，相差很远罗老师答：一般不会的，要么不给，要么就给正确的。故意给错是学术不端行为，一般不会。但有可能给的不是最好的。试文献里的序列不好是有可能的，这不能作为文献给错的证据。有可能你的测试条件与他的条件不同。这也是很多人觉得 aptamer 不靠谱的原因，换个条件结合就不好了。这也是整个 aptamer 产业发展面临的障碍，如何获得高稳定性的 aptamer 。所以，大家才会看到，数百篇 aptamer 文章都在用 thrombin 的 aptamer 。问 21 ：罗老师，我还有个问题，每轮筛选之后洗脱下单链 DNA 之后您还对其进行了哪些处理，比如中和、浓缩等，具体的处理方法是怎样的？罗老师答：一般文献都是中和，不过你需要小心计算中和的条件。保证中和完之后，条件与 binding buffer 相同。也可以透析，交换为 binding buffer ；也有用沉淀方法的。问 22 ：那磁珠的用量是恒定的吗罗老师答：一般开始多一些，后面逐渐减少。问 23 ：蛋白磁珠筛选五轮少吗？罗老师答：通常不够，新手建议至少筛选到十轮。如果看不到希望一定是哪里出问题了。问 24 ：那 PCR 扩增制得用于下一轮的文库量是怎么确定的呢？罗老师答：如果第一轮 1OD ，第二轮最好在 0.1OD 以上，后面可以根据亲和力情况再缓慢减少。问 25 ：会不会筛丢，每轮筛选洗脱的东西都减少，感觉不到富集罗老师答：筛丢当然是可能的，不然为什么失败率那么高呢？问 26 ：请问每一轮筛选后做 pcr 是不是应该增加循环数呢罗老师答：是否需要增加循环数，取决清洗的程度，主要是留下来的模板量。一般不建议增加循环数。问 27 ：模板量太少增加循环数有用吗？罗老师答：要保证污染不要超过模板就行。问 28 ：请问鉴定 PCR 产物及单链文库您一般用的什么方法？罗老师答： PAGE ，和变性 PAGE 问 29 ：是鉴定单链的都要用变性的吗？罗老师答：单链如果用 PAGE 胶，会有拖尾，无法判定。建议都用变性 PAGE 问 30 ：筛选时所谓富集会是产生模板量越来越多吗？罗老师答：如果你能保证筛选过程中，洗涤条件完全相同的话，应该是这样的。问 31 ：如何鉴定是否已经被污染呢？罗老师答：做无模板的 PCR 对照判断。问 32 ：那我筛选时模板量越来越少，会是什么问题？罗老师答：可能是你清洗过于严格，导致留下的模板太少所致，得到的都是污染的东西。问 33 ：我每次筛选后做的 PCR 都用 PAGE 电泳检测，但好像条带位置都不对，不知是怎么回事？罗老师答：如果是常规 PAGE 电泳是有可能的，产物会出现多个条带。你用变性 PAGE 就不会有问题了。还有几个问题罗老师可能木有看到····（以下回答部分与 10 月 4 日整理时添加） 1. 看文献都是十几轮的，请问您有用什么方法四轮就可以有结果呢，靶蛋白起始量大概是多少呢？答：磁珠法，要控制磁珠量尽可能的少。一般都要用到 10E7 ，太少操作几遍就丢了，找不到磁珠。文献报道最少的是 10E6 个磁珠，我们能到更少。 2. 蛋白用什么固定呢？（磁珠法）答：一般都是用 NHS/EDC 方法偶联，可以参考 invitrogen 的磁珠操作说明书。 3. 初始文库用 1OD 是筛选蛋白吗？答：是的， 1OD 大约是 10E15 个分子。 4. 双链也用变性 PAGE 鉴定么？答：可以的，如果两天链等长的话，就可以看到是一条带。如果用非变性 PAGE ， pool 扩增产物通常会有多个条带，无法辨认。罗老师推荐的书籍：国内原创的书，邵宁生老师的《生物文库技术》北理工屈锋教授目前正在翻译《 aptamer handbook 》罗老师对大家的一点建议：多看文献，实时追踪最新进展；如果大家不知道如何追踪最新进展，请关注罗老师开设的《文献管理与信息分析》课程，其中 RSS 部分。非常感谢罗老师的耐心解答 ~~ 第二次交流时间： 10 月 21 日晚 8 点罗老师科学网博客 http://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=spaceuid=304685do=blogid=61613 罗老师邮箱 smilesun （ @ ） ustc.edu ， 0551-3603215 ，

44159 次阅读|1 个评论

SELEX高峰论坛-11月9日清华大学

smilesun 2010-11-7 20:02

周二将在清华大学组织一次SELEX技术的交流，参加人包括国内做SELEX方面的知名专家邵宁生教授，M-SELEX技术的发明人娄新徽博士，以及其他一些工作在一线的人士。如果有正在从事SELEX实验的朋友想参加，请与我联系。参加者必须有实验经历，不接受仅对此感兴趣而未开展任何实验研究者。参会人数控制在十人以内。请谅解。 ================ 由于邵老师周二下午有课，所以具体时间仍在协商之中。会议地点明天确定。

个人分类: 科学研究|4481 次阅读|1 个评论

google trends关注各国研究动向-韩国高度关注aptamer研究

热度 1 smilesun 2010-11-4 11:12

由于要准备晚上给学生介绍搜索引擎，用google trends搜索了一下aptamer和SELEX，根据结果发现韩国近期高度关注aptamer相关研究，不知为何。如果这种推测是事实的话，我们可以利用谷歌趋势来发现一些研究动向。我先开始在google.com.hk/trends里搜索aptamer，south korea的搜索量遥遥领先于其它国家和地区。后来又在google.com/trends里进行了同样搜索，结果发现同样的结果。此时我怀疑aptamer在韩文里会不会有其它的意思，如aptamer是一个小吃，一部电影，一首歌曲等。我用了下面的搜索词 aptamer -DNA -RNA -SELEX之后，结果减少了很多，但前几页结果仍是关于aptamer（适配体）的内容，所以断定aptamer在韩文中没有其它意思。继续再看trends的搜索结果。见下面的链接 http://www.google.com/trends?q=aptamer 排在前十位的国家是： 1. South Korea 2. Taiwan 3. Iran 4. Singapore 5. India 6. Israel 7. China 8. United States 9. Switzerland 10. Denmark 前十位的城市是 1. Pohang , South Korea 2. Taejon , South Korea 3. Gainesville , FL, USA 4. Seoul , South Korea 5. Cambridge , MA, USA 6. Austin , TX, USA 7. Taipei , Taiwan 8. Boston , MA, USA 9. Singapore , Singapore 10. Beijing , China 从上面看，浦项是全球搜索最多的城市，国内北京最多。北京在国内最多很容易理解。但浦项的搜索量几乎占了全球的一半，难以理解。另外，google trends统计的时间段是多长时间，我还没搞明白。 aptamer与 Pohang的关系到底意味着什么？

个人分类: 科学研究|5807 次阅读|1 个评论

11月6-9日在北京

smilesun 2010-10-31 00:41

今后类似及时信息将通过新浪微博发布：http://t.sina.com.cn/science20 11月6-9日将在北京，有对我的工作感兴趣的可以联系交流。smilesun（at）ustc.edu 个人目前的兴趣主要包括文献管理，SELEX（适配体快速筛选技术）、毛细管电泳、表面等离子共振技术、等温滴定微量热等仪器技术的应用。

个人分类: 未分类|3569 次阅读|0 个评论

18-19日，上海开会，欢迎交流

smilesun 2010-10-18 13:00

18日至19日下午4点在上海参加2010年微纳尺度分离和分析技术学术会议暨第六届全国微全分析学术会议。我目前感兴趣的研究方向是核酸适配体的快速筛选技术和相关的基础理论研究，欢迎从事相关研究的朋友和我交流。另外，近年在讲授《文献管理与信息分析》课程，如果你对此有兴趣，且在会场，也可以交流。我的联系方式 139 5600 九八七九。

个人分类: 科学研究|3399 次阅读|0 个评论

帐号		自动登录	找回密码
密码			注册

关闭安全验证

标签: 适配体

相关帖子

相关日志

关闭 安全验证

标签: 适配体

相关帖子

相关日志

关闭安全验证