多发性硬化是一种中央神经系统的自身免疫性疾病。人们认为多发性硬化起源于淋巴细胞，引起髓磷脂破坏和神经退行性变，进而形成硬化斑。在全世界范围内有大约250万多发性硬化病人，而且发病率还在不断增加。 2020年4月10日， Clinical and Translational Medicine 杂志在线发表了 澳大利亚Jeannette Lechner-Scott教授团队 的最新成果 Erythrocyte microRNAs show biomarker potential and implicate multiple sclerosis susceptibility genes 。 文章概要 多发性硬化是一种脱髓鞘性自身免疫性疾病，目前没有血源性生物标志物。红细胞中有microRNAs， 所以有提供生物标志物的可能性。microRNAs可以通过与信使RNA互补结合从而调节蛋白质的翻译。因为红细胞没有转录活性，所以红细胞内的microRNAs库不易受各种内外因素的影响。本文的研究目的就是探讨在多发性硬化中红细胞内microRNAs作为生物标志物的可能性，并探讨红细胞来源的外泌体microRNAs在病理诊断中的作用。 具体试验方法是把全血密度梯度离心，分离红细胞。然后把来源于23例多发性硬化患者和22例正常对照者的红细胞microRNAs分别进行测序。miR-183一族（包括hsa-miR-96-5p，hsa-miR-182-5p及 hsa-miR-183-5p）高表达，这一发现在另一项群组研究中被证实（其中包括42例多发性硬化患者和45例对照者，对照者包括正常人和偏头痛患者）。先分离出红细胞来源的外泌体，然后对其中的microRNAs进行测序。microRNAs的靶点可以用miRDIP进行预测。 研究结果表明 hsa-miR-182-5p和 hsa-miR-183-5p可以把复发的多发性硬化患者和对照者区分开，精确率在89-94%之间，特异性在90%左右。hsa-miR-182-5p和 hsa-miR-183-5p表达水平与多发性硬化患者生理功能受损程度相关；hsa-miR-96-5p表达水平与多发性硬化患者认知障碍程度相关。研究发现红细胞是有选择性地把microRNAs包装入其外泌体中；研究发现有34种microRNAs在多发性硬化患者和正常对照组之间存在统计学差异。本研究还发现许多表达和包装有差异的红细胞microRNAs的靶基因与多发性硬化的易感基因重复。基因富集分析表明神经系统发育相关基因受累及，组蛋白H3-K27去甲基化。 文章得出的结论是红细胞miR-183一族成员可以作为多发性硬化的特异性生物标志物，有助于多发性硬化的诊断和疾病发展监测。许多多发性硬化的易感基因都是红细胞及其外泌体microRNAs的靶基因，他们相互作用通过目前许多已知的途径影响多发性硬化的病理生理过程。 综上，本项研究强调了红细胞来源的外泌体在多发性硬化发病中的重要性，以及红细胞miRNAs作为多发性硬化特异性生物标志物的可能性。在将来即将进行的研究中，作者会考虑从血浆中提取外泌体，纳入男性病人以及深入研究外泌体miRNAs的功能等。这是到目前为止第一篇关于红细胞来源外泌体的研究。更加深入的关于miRNAs和多发性硬化的研究将继续进行。 参考文献： . Dendrou CA, Fugger L, Friese MA. Immunopathology of multiple sclerosis. Nat Rev Immunol . 2015;15(9):545-558. . Haussleiter IS, Brune M, Juckel G. Psychopathology in multiple sclerosis: diagnosis, prevalence and treatment. Ther Adv Neurol Disord . 2009;2(1):13-29. . Ribbons K, Lea R, Tiedeman C, Mackenzie L, Lechner-Scott J. Ongoing increase in incidence and prevalence of multiple sclerosis in Newcastle, Australia: a 50-year study. Mult Scler . 2017;23(8):1063-1071. . Simpson S Jr, Wang W, Otahal P, Blizzard L, van der Mei IAF, Taylor BV. Latitude continues to be significantly associated with the prevalence of multiple sclerosis: an updated meta-analysis. J Neurol Neurosurg Psychiatry . 2019;90(11):1193-1200. . Compston A, Coles A. Multiple sclerosis. Lancet . 2008;372(9648):1502-1517. . Groen K, Maltby VE, Scott RJ, Tajouri L, Lechner-Scott J. Erythrocyte microRNAs show biomarker potential and implicate multiple sclerosis susceptibility genes. Clin Transl Med . 2020;1–17. 点击链接下载PDF全文： https://doi.org/10.1002/ctm2.22 关于CTM Clinical and Translational Medicine （CTM）是Wiley出版的英文学术期刊。根据科睿唯安2020年6月公布的期刊引证报告（JCR），CTM获得的首个影响因子为 7.919 ，在JCR的138本Medicine, Research Experimental 期刊中位列第11，在244本Oncology期刊中位列第27，均处于 Q1 区。 CTM刊登临床和转化医学方面的文章，旨在促进临床前研究向临床应用的转化，加强基础和临床科学家之间的交流。本期刊聚焦新生物技术、生物材料、生物工程、疾病特异性生物标记物、细胞和分子医学、组学科学、生物信息学、应用免疫学、分子成像、药物发现和开发以及监管和卫生政策。CTM竭诚欢迎临床医生、研究人员、决策者和业界人士免费阅读期刊内容并积极向期刊投稿。 撰写：程欣 改编：Tina
阿尔茨海默病脑脊液和血浆生物标志物 Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease KajBlennow 1 ， HaraldHampel 2 ， MichaelWeiner 3 ， Henrik Zetterberg 1 1 瑞典哥德堡大学神经科学与生理学研究所临床神经化学实验室 2 爱尔兰都柏林圣三一大学医学院精神病学系 3 美国加利福尼亚大学旧金山分校磁共振波谱（ MRS ）室 摘要 深入的多学科研究为更细致了解阿尔茨海默病 （ AD ） 发病的分子机制提供了支撑。相关成果已经转化成为 AD 新的治疗策略，并认定为具有缓解病情 （ disease-modifying ） 效应。目前已有多种最有潜力的疗法在临床试验中验证，如 β- 淀粉样肽免疫疗法、分泌酶 （ secretase ） 抑制剂等。若将缓解病情治疗应用于 AD 早期阶段 （淀粉样斑块和神经变性广泛出现之前） ，则其疗效最为显著。因此有必要在 AD 痴呆前阶段通过生物标志物 （ biomarker ） 即可发现 （针对无症状个体则更理想化） 。本篇综述将介绍 AD 脑脊液 （ CSF ） 生物标志物的诊断原理和 诊断 价值，具体包括总 tau 蛋白 （ t-tau ） 、磷酸化 tau 蛋白 （ p-tau ） 和 42 氨基酸型 β- 淀粉样肽 （ Aβ 1-42 ） 。这些生物标志物可反映 AD 病变特征，可用于预测正常个体发生认知功能衰退，以及认知损害患者进展至痴呆的可能性。本文还将讨论新出现的血浆和 CSF 生物标志物，并探索采用蛋白质组学方法鉴定 CSF 生物标志物的策略。最后，将概述 CSF 生物标志物在药物研发和临床试验中的作用，展望 AD 生物标志物的发现前景及临床应用可行性。 Blennow K, Hampel H, Weiner M, et al. Cerebrospinalfluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 2010, 6:131–144. 前言 阿洛伊斯 · 阿尔茨海默 （ Alois Alzheimer ） 于 1906 年在德国蒂宾根 （ tübingen ） 一次会议上报告了首个阿尔茨海默病 （ AD ） 病例 。在报告中，他描述了 “ 粟粒样小体 ” （ miliary bodies ，即淀粉样斑块） 和 “ 致密原 纤维束 ” （ dense bundles of fibrils ，即神经原纤维缠结） ，两者现在被认为是 AD 典型神经病理特征。 1985 年，研究者成功纯化了淀粉样斑块核心成分，将这种细胞外沉积物鉴定为 4kDa 的 β- 淀粉样肽 （ Aβ ） 。这项突破导致了编码淀粉样前体蛋白 （ APP ，该蛋白可衍生出 Aβ ） 基因的克隆。 1986 年发现神经原纤维缠结由高度磷酸化的 tau 蛋白构成 。 1980 年代的上述重要成果开启了 AD 的现代研究，引发了对 APP 代谢和 Aβ 生成 （图 1 ） 、 tau 蛋白稳态 （图 2 ） 的深入研究。 本文要点 n 目前阿尔茨海默病 （ AD ） 临床诊断标准需首先确诊痴呆，并主要依赖于排除其他病症。 n 若 AD 缓解病情药物上市，将可应用于疾病极早期阶段 （神经变性病变严重和广泛存在之前） 。 n 伴轻度认知损害 （ MCI ） 的前驱型 AD 患者尚无法通过临床手段发现，因这类患者只有轻度情景记忆损害。 n 脑脊液 （ CSF ） 生物标志物总 tau 蛋白 （ t-tau ） 、磷酸化 tau 蛋白 （ p-tau 181 和 p-tau 231 ） 和 β- 淀粉样肽 1-42 （ Aβ 1-42 ） ，对 AD 患者和伴 MCI 的前驱型 AD 患者具有较高的诊断准确性。 n CSF 生物标志物正迅速应用于 AD 临床诊断，在临床试验中也具有应用价值，可实现单纯 AD 患者病例数的精简。 n 标示具有改善病情功效的 AD 药物，在具有改善认知功能的同时，还需具有影响核心病变进程的生物标志物证据。 APP 和早老蛋白 （ presenilin ） 基因 （ PSEN1 、 PSEN2 ） 所编码的蛋白均与 APP 代谢相关，这些基因突变是家族性 AD 的病因 。基于这些突变，大体上可将 Aβ ，特别是 42 氨基酸型 Aβ （ Aβ 1-42 ） 认定为 AD 进程的驱动因素。正因如此， “ Aβ 级联反应假说 ” （ amyloid cascade hypothesis ） 推测， Aβ 生成和清除的不平衡是引发 AD 的最初事件，随着 Aβ 负荷增加最终导致 tau 蛋白病变、神经元变性和痴呆 （图 3 ） 。 AD 研究进展已经转化为新的治疗策略，即研发具有缓解病情 （ disease-modifying ） 潜力的药物；目前已有大量抗 Aβ 候选药物进行各期临床试验，如 Aβ 免疫疗法、分泌酶抑制剂、 Aβ 聚集抑制剂等 。尽管取得了如此进步，但需注意 Aβ 级联反应假说在晚发型 AD 中的确定性并未被证实。 缓解病情药物应用于早期 AD 患者可能最为有效，此时淀粉样斑块和神经原纤维缠结尚不广泛，神经变性程度尚不严重 。因此，患者处于痴呆前阶段 （前驱型 AD ， prodromal AD ） ，甚至无症状阶段 （临床前 AD ， preclinical AD ） 时即得以发现。前驱型 AD 定义为因 AD 潜在病变所致的轻度认知损害 （ MCI ） ，而临床前 AD 以脑进行性 AD 病变但尚不足以影响认知功能为特征。如果某种 AD 药物标示具有缓解病情效应，则该药必须有影响疾病核心进程和神经病理学特征的证据，且对认知功能有积极疗效 。 AD 早期诊断和缓解病情药物开发过程中遇到的挑战，就是需要能够反映 AD 进程核心要素的生物标志物。为此，本文将综述 AD 脑脊液 （ CSF ） 和血浆候选生物标志物；重点放在成熟的生物标志物 （生物标志物通过不同研究团体在多项研究中评估） ，提供其临床操作的实用指导并讨论其在临床试验中的潜力。 脑脊液生物标志物 生物标志物是生物学进程和病理学进程的客观指标，用于评估疾病风险或预后、指导临床诊断或监测干预效果。 CSF 与脑细胞外隙直接接触，能够反映脑生化变化。因此， CSF 是 AD 生物标志物的首选来源。 AD CSF 生物标志物可分为基础生物标志物和核心生物标志物 （表 1 ） 。前者用于鉴别可能与 AD 混淆或并存的病症，后者用于确定 AD 的核心病变进程。通过腰椎穿刺获取脑脊液的步骤详见附图 1 和附表 1 。附表 1 中还提供了 CSF 样品处理的标准操作规程。 图 1 CSF APP 片段生成的代谢途径 a. 淀粉样肽形成途径中， β- 分泌酶裂解 APP 后，释放 sAPPβ 入细胞外液和 CSF ，质膜上剩余片段 （ CTFβ ） 经 γ ‑ 分泌酶裂解，生成 Aβ 1-42 和其他羧基端 Aβ 截断亚型 （从 Aβ 1-40 到 Aβ 1-17 ） 。经鉴定， β- 分泌酶为 β 位 APP 裂解酶 1 （ BACE1 ） ，而 γ ‑ 分泌酶为包含四种成分的酶复合体：早老蛋白、 nicastrin 、早老蛋白增强因子 2 （ presenilin enhancer 2 ， PEN2 ） 和前咽缺陷因子 1(anterior pharynx-defective 1 ， APH-1) 。 b. 在第二条途径中， APP 先后经 β- 分泌酶和 α- 分泌酶裂解，释放出 Aβ 短亚型 （从 Aβ 1-16 到 Aβ 1-13 ） 。 c. 在第三条途径中， α- 分泌酶从 APP 的 Aβ 段中部裂解，释放大分子的氨基端衍生物 sAPPα 入细胞外液和 CSF ，质膜剩余 CTFα 片段。 α- 分泌酶活性被认为由 ADAM 蛋白酶家族产生 。 p3 肽仅见于细胞培养研究 ，而未见于 CSF 。 缩写 Aβ ： β- 淀粉样肽； AICD ：淀粉样前体蛋白胞内域； APP ：淀粉样前体蛋白； CSF ：脑脊液； CTF ：羧基片段； sAPP ：可溶性 APP 胞外域。 基础生物标志物 基础生物标志物可反映血脑屏障 （ BBB ） 状态和脑内炎症过程 （附图 2 ） 。 BBB 由脑内毛细血管的限制性渗透作用所形成，以使神经元微环境保持可控状态。 CSF/ 血清白蛋白比值是衡量 BBB 功能的指标 。比值增加提示 BBB 受损，见于感染 、炎症性疾病 、脑肿瘤、脑血管病 （包括多种血管性痴呆，见表 1 ）等 一系列病症。单纯 AD 患者 CSF/ 血清白蛋白比值正常，但伴发脑血管病变者常增加 。因此，该比值可 有效 排除其他脑部损害并鉴别单纯 AD 患者。 中枢神经系统中，慢性炎症性疾病 （如多发性硬化） 和感染 （如神经包柔螺旋体病） 可发生免疫反应，产生鞘内免疫球蛋白 （ intrathecal immunoglobulin ） 。该反应可通过 CSF IgG 和 IgM 指数定量测定，或通过 寡克隆带 （ oligoclonal bands ） 定性测定 （见附表 3 ） 。 AD 患者绝大多数未见鞘内免疫球蛋白，或仅少量存在 （表 1 ） ，故该项检测是 AD 临床检查中排除慢性炎症和感染病症的有效手段。 核心生物标志物 理想的生物标志物应与疾病潜在的分子病理机制相关联 。已开发的 AD 核心生物标志物可反映淀粉样斑块、神经原纤维缠结和轴突变性病变 （见附表 2 ） 。而在活体患者中测定上述病变程度的方法极少。因此，多数 AD 核心生物标志物研究，集中在寻找生前 CSF 生物标志物与尸检神经病理结果之间的关联性。但由于 CSF 检查与尸检存在时间差，且上述研究还存在方法学问题，所以寻找两者之间的关联性仍存在困难。 两项尸检研究分别发现，死后脑室 CSF 和死前腰椎 CSF Aβ 1-42 均与淀粉样斑块负荷相关 。单光子发射断层扫描 （ PET ） Aβ 配体 的应用，可实现活体脑内纤丝状 Aβ 的直接可视化。几项研究显示 11 C-PIB 保留率与 CSF Aβ 1-42 水平相关联，即 11 C-PIB 结合率高者， CSF Aβ 1-42 水平较低 。这些数据提示 CSF Aβ 1-42 水平可反映脑内纤丝状 Aβ 1-42 水平和淀粉样斑块负荷。关于 AD 患者 CSF Aβ 1-42 减少被广泛接受的解释是， Aβ 聚集为斑块 （进而 Aβ 滞留于脑实质） 导致实际弥散入 CSF 的 Aβ 减少。 多项研究数据提示， CSF 中总 tau 蛋白 （ t-tau ） 水平可反映脑神经元和轴突变性的程度。罹患急性病症 （如脑卒中、脑肿瘤） 的患者 CSF t-tau 有短暂性升高，升高幅度与组织损伤程度及严重预后发生概率呈正相关 。 CSF t-tau 升高者由 MCI 进展至 AD 速度更快 ，且 AD 患者认知下降更迅速，死亡率更高 。而 CSF t-tau 极高者见于神经变性最迅速的病症，如克 - 雅病 。一项研究显示 CSF t-tau 与死后神经原纤维缠结负荷相关 ，提示产生神经原纤维缠结的神经元，可能会促进 CSFt-tau 水平升高。 CSF 中磷酸化 tau 蛋白 （ p-tau ） 似可反映脑内 tau 蛋白磷酸化状态和神经原纤维缠结形成。某些研究中分别测定患者生前和死后 CSF p-tau ，显示 CSF p-tau （磷酸化位点在 181 位苏氨酸，即 p-tau 181 ；或 231 位苏氨酸，即 p-tau 231 ） 与新皮层神经原纤维缠结病变，以及海马萎缩速度相关 。 CSF p-tau 181 升高者由 MCI 进展至 AD 速度更快 ， AD 患者认知下降更迅速 。 多项研究显示， CSFt-tau 和 p-tau 水平在 AD 患者和健康老年个体之间存在强烈相关性 。而此种相关性未见于克 - 雅病和急性脑卒中。在后两种病症， t-tau 水平极高 （反映神经元损伤程度） ，而 p-tau 水平正常 。汇总数据显示，主要应用 p-tau 检测即可将 AD 与其他类型痴呆相鉴别 。 核心生物标志物检测手段的开发 Aβ 为细胞正常代谢产物，经分泌进入 CSF ，这一过程的发现为开发 Aβ 这一生物标志物奠定了基础 。随后发现， Aβ 1-42 是淀粉样斑块中最丰富的 Aβ 亚型，由此导致了针对这一亚型检测手段的开发 。多种酶联免疫吸附测定 （ ELISA ） 研究均显示， AD 患者 CSF Aβ 1-42 水平较之年龄匹配正常老年个体降低约 50% 。 tau 蛋白有多种亚型和不同磷酸化位点 （图 2 ） 。 t-tau 检测最常用的是 ELISA 法，使用单克隆抗体可测得各种 tau 蛋白亚型，而与其磷酸化状态无关 。采用这一方法，多项研究报道 AD 患者 CSF t-tau 水平较之正常老年个体升高约 3 倍 。 而 ELISA 法测定 CSF p-tau 最常用的是 p-tau 181 或 p-tau 231 特异性抗体 （图 2 ） 。采用此法测定 AD 患者 CSF 均显示 p-tau 显著升高 。某项研究还直接比较两亚型 p-tau 检测，显示两者诊断价值相似 。 在发现 AD 或前驱型 AD ，以及鉴别 AD 与其他病症时， CSF t-tau 、 p-tau 和 Aβ 1-42 联合检测的诊断准确性优于单独检测 。由此已开发出同时定量检测上述 CSF 生物标志物的多参数检测系统。该检测系统采用 xMAP ® 技术 （ (Luminex ， Austin ， TX ， USA ） ，已应用于多项 AD 生物标志物的多中心研究，并显示较高的诊断性能 。 xMAP ® 法和 ELISA 法检测 CSF 生物标志物的实测值并不一致 。造成这种差异的原因可能在于检测所用抗体不同，以及抗体与磁珠结合、酶标板包被、定标及孵育等方法的差异。可引入校正因子以直接比较 xMAP ® 系统与不同 ELISA 法的测定值。 图 2 tau 蛋白亚型及其磷酸化位点 tau 蛋白是结合于微管的轴突蛋白，可促进微管的装配和稳定。 tau 蛋白在无髓鞘的皮层轴突中高度表达，特别是在记忆巩固脑区 （边缘皮层） 。 a. 6 种 tau 蛋白亚型由外显子 2 、 3 、 10 的不同剪接方式所形成 。这些亚型均含有三到四个微管结合域 （绿框；第 4 个结合域在 10 外显子内） 。 b. tau 蛋白具有多个苏氨酸和丝氨酸磷酸化位点，但在脑脊液中可定量的通常是苏氨酸 181 （ Thr181 ） 或苏氨酸 231 （ Thr231 ） 。 tau 蛋白磷酸化受多种激酶和磷酸酶调控而达到平衡 。高度磷酸化的 tau 蛋白可隔离正常 tau 蛋白和微管相关蛋白 （ MAP1 和 MAP2 ） ，导致微管被拆解，从而破坏轴突运输。并且，高度磷酸化的 tau 蛋白易于聚集成不可溶性原纤维 （即成对螺旋丝） ，进而形成更大的聚集体 （即神经原纤维缠结） 。微管稳定性的破坏和神经原纤维缠结的形成，均可损伤神经元和突触功能；不过， tau 蛋白磷酸化和聚集与阿尔茨海默病的因果关系尚不清楚。 缩写 S ：丝氨酸； T ：苏氨酸。 核心生物标志物的应用价值 阿尔茨海默病 大量研究显示 AD 患者 CSF t-tau 和 p-tau 水平显著升高，而 Aβ 1-42 水平实质性降低。这些研究均显示上述生物标志物可鉴别 AD 患者与健康老年个体，敏感性和特异性均达 80%-90% （框 1 ） 。需与 AD 作鉴别诊断的病症 （如抑郁症、帕金森病） 中，三项生物标志物则为正常 。三者或任意两者联合诊断，均优于单独诊断 。例如，一项 Aβ 1-42 和 t-tau 联合检测研究显示， AD 诊断的敏感性由 78%-84% （单独检测） 提高到 86% ，特异性由 84%-90% 提高到 97% 。 CSF p-tau 可辅助用于 AD 与其他痴呆的鉴别诊断，包括额颞痴呆和路易体痴呆 。然而，将 CSF 生物标志物用于鉴别 AD 与其他痴呆并非首选，原因如下：首先，多数 CSF 研究基于临床诊断病例，会产生数量可观的误诊 ；其次，相当多无痴呆的老年个体可伴淀粉样斑块和神经原纤维缠结，足以达到 AD 的神经病理学诊断标准 ；最后， AD 与其他类型痴呆的病理表现可见相当程度的重叠，特别是路易体痴呆和血管性痴呆 。因此，上述重叠现象从病理实质上证明，通过 CSF 生物标志物诊断 AD ，其敏感性和特异性不可能接近 100% 。 前驱型阿尔茨海默病 各项研究均显示 t-tau 、 p-tau 和 Aβ 1-42 联合检测对发现伴 MCI 的前驱型 AD 患者具有较高的预测价值 ，某项研究报告其敏感性达到 95% （框 1 ） 。其预测价值在大型多中心研究中均得到了证实，如 AD 神经影像学倡议 （ ADNI ） 研究 、 DESCRIPA 研究 、瑞典智能项目 等。这些项目研究结果表明，在认知损害人群中发现前驱型 AD ， CSF 生物标志物是有价值的临床诊断工具。 无症状阿尔茨海默病 某些研究通过在疾病临床前阶段检测 CSF 生物标志物，以确定是否可预测 AD 。两项人群研究发现，认知正常老年个体 CSFAβ 1-42 水平存在显著下降者，未来会进展为 AD ，而其 CSF t-tau 和 p-tau 则无变化 。另外一项临床研究报道认为， CSF Aβ 1-42 （而非 t-tau 和 p-tau ） 可用于预测健康老年个体认知功能下降 。并且，家族性 AD 的无症状个体亦具有较低的 CSF Aβ 1-42 ，且 CSF t-tau 和 p-tau 较高 。总之，上述结果支持了动物实验的研究数据，即认为 Aβ 产生进程是 tau 病变的上游事件 。 一项大型研究显示，认知正常老年个体中 PET 表现为 11 C-PIB 结合者，其 CSF Aβ 1-42 降低；而该项研究还显示， CSF Aβ 1-42 降低者同样见于某些无 11 C-PIB 结合个体 。可以解释这些结果的事实是， 11 C-PIB 可结合纤丝状 Aβ ，而不结合 Aβ 寡聚体或弥散性斑块 （见于 AD 极早期） 。这些数据进一步提示，对于认知正常老年个体，在其 AD 极早期即可将 CSF Aβ 1-42 用于 AD 预测。不过对于无症状个体 AD 的预测，其 CSF Aβ 1-42 水平与健康老年个体存在着较大的重叠。并且，通过生物标志物预测无症状人群 AD 的发生，在缓解病情的特效药物 （且较少副作用） 通过注册后才可能应用。 经证实的阿尔茨海默病病例 尸检证实的痴呆患者系列研究也显示， CSF 生物标志物具有诊断价值。在这些研究中， CSFt-tau 、 p-tau 和 Aβ 1-42 联合检测可鉴别 AD 患者和认知正常老年个体及其他类型痴呆 （如路易体痴呆、额颞痴呆和血管性痴呆） 患者，且具有较高的特异性和敏感性 。因此，上述患者系列研究显示，将 CSF 生物标志物作为跟踪神经病变的检测项目，其鉴别能力类似于或优于单纯采用临床诊断。 新型候选生物标志物 图 3 AD 淀粉样肽级联反应假说 该假说认为，脑内 Aβ 生成和清除不平衡导致 Aβ 水平增加是 AD 首发事件，并最终导致神经元变性和痴呆的发生 。现已确定，在家族性 AD 可见总 Aβ 或 Aβ 1-42 亚型生成增加，但在散发性 AD 中只有证据说明存在 Aβ 特异性清除障碍。对于这两种类型 AD ，均认为可溶性 Aβ 发生构象变化可致其易聚集为可溶性寡聚体，再形成更大的不可溶性纤丝 （见于淀粉样斑块） 。而 Aβ 发生构象变化的特异性分子机制大部分尚不清楚。沉积于斑块的纤丝状 Aβ 可能具有神经毒性，但突触缺失和疾病临床进展主要与可溶性 Aβ 水平相关 。数据显示，可溶性 Aβ 寡聚体可抑制海马 LTP ，由此破坏突触可塑性 。 tau 蛋白磷酸化和随后的神经原纤维缠结，以及炎症反应和氧化应激，被认为是 AD 的下游事件。 缩写 Aβ ： β- 淀粉样肽； APOE ：载脂蛋白 E ； APP ：淀粉样前体蛋白； LTP ：长时程增强。 CSF 中 AD 生物标志物除 Aβ 和 tau 蛋白外，许多文献中对其他生物标志物也有报道，但最初报道中颇有希望的结果并未能重复。在此仅对部分新型生物标志物作一综述，均显示对 AD 具有较高的敏感性和特异性，且见于至少两项独立研究。此部分还将讨论与 Aβ 和 APP 代谢相关的特定生物标志物。 BACE1 Aβ 通过 β- 分泌酶和 γ- 分泌酶依次作用于 APP 而生成 （图 1 ） 。实现 β- 分泌酶功能的 主酶 是 β 位 APP 裂解酶 1 （ BACE1 ） 。尸检发现 AD 患者脑组织中 BACE1 表达及其活性增强 。 BACE1 亦可在 CSF 中测得，在 AD 及前驱期 AD 患者均可见 BACE1 含量和活性升高 。总之，上述数据提示 BACE1 上调可能是 AD 的早期事件。 淀粉样前体蛋白亚型 在 APP 加工过程中， APP 氨基端的可溶性长片段 sAPPα 或 sAPPβ （ APP 分别经 α- 分泌酶或 β- 分泌酶首先裂解所形成） 分泌进入细胞外隙和 CSF （图 1 ） 。在散发性 AD 及 MCI ， CSF sAPPα 或 sAPPβ 水平报告未见变化，或略有升高 。尽管 sAPP 水平在脑内变化尚无一致报道，但作为 CSF 生物标志物，针对影响 APP 加工药物进行疗效监测， sAPP 也是有价值的工具 （表 2 ） 。 β- 淀粉样肽截短亚型 （ truncated amyloid ‑ β isoforms ） Aβ 1-40 是 CSF 中最丰富的 Aβ 亚型 。在 AD 和 MCI 均未见 CSF Aβ 1-40 有显著变化；而 Aβ 1-42 /Aβ 1-40 比值则见显著降低，这一变化较 CSF Aβ 1-42 更为显著 。其他的羧基端截短的 Aβ （ Aβ 1-37 、 Aβ 1-38 和 Aβ 1-39 ） 均见于 AD 患者 CSF 。在 CSF Aβ 1-38 升高的个体，可伴 Aβ 1-42 降低 ，提示 Aβ 1-42 /Aβ 1-38 比值可能会提高 AD 的诊断准确性。 几种更短的 Aβ 截短亚型也已被发现，可联合应用免疫沉淀法 （抗 -Aβ 单克隆抗体） 、基质辅助激光解吸 / 电离 - 飞行时间质谱法 （ MALDI-TOF-MS ） 进行定量检测 。有报道， CSF Aβ 1-16 水平在 AD 患者可见明显增加，并见预期的 Aβ 1-42 降低 。实验研究数据显示，在 APP 加工过程中，通过 β- 分泌酶和 α- 分泌酶协同作用这一新型途径，可产生 Aβ 1-14 、 Aβ 1-15 、 Aβ 1-16 等 Aβ 短亚型，而从 Aβ 1-17 到 Aβ 1-42 等长亚型则通过 γ- 分泌酶途径产生 （图 1 ） 。 β- 淀粉样肽寡聚体 可溶性 Aβ 聚集形成不可溶性纤丝状 Aβ （淀粉样斑块成分） ，被认为是 AD 的核心病理事件 （图 3 ） 。而实验数据发现，可溶性 Aβ 寡聚体可能抑制长时程增强 （ LTP ） ，在 AD 发病过程中亦发挥作用 。因此， CSF Aβ 寡聚体可能是 AD 重要的核心生物标志物。 某些初步研究发现 CSF 中可见 Aβ 寡聚体。某项研究中采用的抗体可与 DNA 标记纳米颗粒相耦联，被用于捕获 CSFAβ 寡聚体 （ CSF 分别取自尸检的 AD 患者和年龄匹配对照个体） 。经 PCR 法扩增发现，与对照样本相比， AD 患者 CSF 可见较高检测信号 。通过流式细胞术亦发现，在神经系统疾病患者脊椎 CSF 中存在 Aβ 寡聚体，但这一技术尚未见到用于诊断 AD 患者 。采用抗 Aβ 抗体对 CSF 样本进行免疫沉淀法检测，免疫印迹显示，在 AD 患者和认知正常老年个体的某些样本中，推测为 Aβ 二聚体处出现一条弱条带。但在 AD 患者群体中这一条带的变化并不一致 。因此，虽然 Aβ 寡聚体作为 AD 候选生物标志物极具吸引力，但针对这种分子还存在某些问题。 CSFAβ 寡聚体含量似乎大大低于 Aβ 单体。重要的是，尚需通过质谱分析以验证，通过上述技术测得的信号值是否反映了 Aβ 寡聚体的实际变化。并且，在大型临床试验中还需开发针对这些分子的适宜检测技术。 表 1 AD 的 CSF 生物标志物 生物标志物 病变机制 AD 中的变化 评 价 基础生物标志物 CSF 细胞计数 炎症反应 无变化 用于排除感染性疾病 CSF/ 血清白蛋白比值 BBB 功能损伤 单纯 AD 无变化 ；伴发脑血管病 AD 轻中度增加 比值增加提示 BBB 功能损伤 ；可见于 CNS 感染 （如神经包柔螺旋体病） 、炎症性疾病 （如吉兰 - 巴雷综合征） 、脑肿瘤和脑血管病 （包括血管性痴呆） IgG 或 IgM 指数； IgG 或 IgM 寡克隆带 鞘内免疫球蛋白生成 无变化 用于排除炎症 （如多发性硬化、狼疮性脑病） 和慢性感染 （如包柔螺旋体脑炎或梅毒） 核心生物标志物 Aβ 1 – 42 APP 通过促淀粉样肽途径代谢 在 AD 和前驱型 AD 显著降低 为脑内 Aβ 代谢和淀粉样斑块形成相关的 CSF 核心生物标志物 ； CSF Aβ 1 – 42 降低也见于路易体痴呆 p ‑ tau 181 和 p ‑ tau 231 tau 蛋白磷酸化 在 AD 和前驱型 AD 显著升高 CSF p ‑ tau 升高仅见于 AD ； p ‑ tau 181 和 p ‑ tau 231 两者水平密切相关，诊断准确性相似 t ‑ tau 轴突 （神经元） 变性 在 AD 和前驱型 AD 显著升高 CSF t ‑ tau 升高可见于急性脑损伤病症，如脑卒中、脑外伤和脑炎 ； CSF t-tau 极度升高伴 p-tau 正常，见于克 - 雅病 缩写 Aβ ： β- 淀粉样肽； AD ：阿尔茨海默病； BBB ：血脑屏障； CSF ：脑脊液； p-tau ：磷酸化 tau 蛋白； t-tau ：总 tau 蛋白 内源性 β- 淀粉样肽自身抗体 多项研究报道，在 CSF 和 / 或血液中存在自然生成的 Aβ 抗体 （呈游离态或与 Aβ 结合） 。而这些研究的结果中，该抗体的滴度水平却不尽一致， AD 病例中可出现上升 、下降 、未变 三种情形。这些研究中所采用的检测方法无法区分 Aβ 亚型各自的抗体，或是无法区分与抗体结合的 Aβ 状态 （单体或寡聚体） 。人类血浆中可见针对各型 Aβ （氧化型、焦谷氨酸型和突变型） 的自身抗体 。 Aβ 寡聚体的抗体活性最高，但这种活性程度仍无法鉴别 AD 患者和对照个体 。 神经元和突触生物标志物 神经元和突触蛋白可确定为 AD 有价值的 CSF 生物标志物，此类分子可能与认知功能和疾病进展有关。视锥蛋白样蛋白 1 （ visinin-like protein 1 ， VLP-1 ） 是高度表达的神经元钙离子感受器蛋白。在通过基因阵列分析寻找脑特异性蛋白生物标志物的过程中，发现了这一蛋白 。关于 VLP-1 的首次临床试验中发现， AD 患者 CSF VLP-1 水平显著升高。并且， VLP-1 区分 AD 患者与健康老年个体的诊断效度与 CSFt-tau 、 p-tau 和 Aβ 1-42 类似，敏感性和特异性均接近 80% 。携带载脂蛋白 E （ APOE ） ε4 等位基因 （ AD 遗传性危险因素） 的 AD 患者 CSF VLP-1 水平升高，且与简易智能状态测验 （ MMSE ） 分数呈负相关。因此， VLP-1 有希望作为 AD 潜在的 CSF 生物标志物。 神经丝蛋白 （ neurofilament ） 是轴突的结构成分，特别是在大型有髓轴突中高度表达 。相应地，在某些皮层下病变 （如血管性痴呆、正常颅压脑积水） 可见 CSF 神经丝蛋白水平升高 。在额颞痴呆亦见 CSF 神经丝蛋白升高，而在多数 AD 患者中则为正常 。因此， CSF 神经丝蛋白可用于鉴别 AD 、额颞痴呆和皮层下痴呆病证。 理想的突触蛋白生物标志物应能反映突触功能及相关的认知功能。采用液相等电聚焦 （ isoelectric focusing ） 电泳和蛋白质印记 （ Western blotting ） 等蛋白沉淀技术，已鉴定出多种突触前蛋白和突触后蛋白，包括 RAB3A 、突触结合蛋白 （ synaptotagmin ） 、生长相关蛋白 （ GAP-43 ） 、突触体相关蛋白 25 （ synaptosomal-associated protein 25 ） 和神经颗粒素 （ neurogranin ） 。免疫检测法显示， AD 患者 CSFGAP-43 水平高于对照个体和额颞痴呆患者 。并且该研究还显示， GAP-43 与 t-tau 水平呈正相关，提示两者均为反映轴突和突触变性的生物标志物。如果针对 CSF 中这些突触蛋白的检测得以证实，那么在新药临床试验中，药物对突触功能的效果可望通过这些蛋白进行监测。 F2- 异前列烷 （ F2 ‑ isoprostanes ） AD 发病机制中包括自由基对神经元的损伤 （附图 2 ） 。自由基损伤的重要后果即为脂质过氧化，并导致 F2- 异前列烷的产生，后者可作为该病变机制的生物标志物。多项研究显示， AD 患者 CSF F2- 异前列烷水平高于健康老年个体或非 AD 型痴呆患者 。 CSF F2- 异前列烷升高亦见于伴认知损害的前驱型 AD 患者 ，以及无症状的家族性 AD 突变个体 。相比而言，血浆 F2- 异前列烷的研究结果则与 CSF 研究相冲突，原因可能是血浆总 F2- 异前列烷为脑源性者远少于外周产生者 。 生物标志物在临床试验中的作用 除了作为临床诊断工具， CSF 生物标志物在新药研发过程中也有应用价值。这些生物标志物作为诊断性生物标志物可用于精简 AD 病例数和患者分层，作为安全性生物标志物可发现并监测药物的生化效应 （表 2 ） 。 精简 AD 病例数 由于 MCI 患者仅见轻度情景记忆紊乱，所以对临床医师而言，发现早期 AD 是一项巨大的挑战。并且这些患者可能并无其他症状，或症状较为模糊。要确定 MCI 患者是否为前驱型 AD ，临床上唯一的办法是对其认知功能进行数年的随访。但即使是在专业科研机构，经数年随访临床诊断为 AD 的准确性仍相对较低，敏感性和特异性为 70%-80% 。而对于早期 AD ，这一数字在初级医疗机构则更为低下 。 框 1 阿尔茨海默病生物标志物的评价标准 阿尔茨海默病生物标志物诊断价值的评价研究应包括，某种分子对本病敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值 。敏感性指该生物标志物确定某病的能力 （生物标志物阳性例数 / 总患病例数） ；特异性指该生物标志物确定未患某病的能力 （生物标志物阴性例数 / 总未患病例数） 。阳性预测值指生物标志物阳性者中确定患病的百分比 （生物标志物阳性确诊例数 / 生物标志物阳性例数） ；阴性预测值指生物标志物阴性者中确定未患病的百分比 （生物标志物阴性未患病例数 / 生物标志物阴性例数） 。依照里根夫妇研究所 - 国立衰老研究院联合工作组制定的理想阿尔茨海默病生物标志物判定标准，生物标志物的敏感性和特异性应 80% ，而预测值应 ≥80% 。 临床试验显示，对 MCI 患者使用胆碱酯酶抑制剂未见明显效果。试验的临床终点是 AD 转化率的降低程度 。而这些研究涉及 MCI 患者均未明确分型，这意味着半数受试者并非前驱型 AD ，故不可能转化为 AD 。因此，将这些患者纳入试验，会严重影响对药物可能临床效果的判定 。如果将 CSF 生物标志物阳性作为 MCI 试验附加的纳入标准，则将增加伴潜在 AD 病变个体的比例，由此增强判定药物阳性效果的可能性 （表 2 ） 。 患者分层 在临床水平和神经病理水平， AD 均为异质性疾病 。因此，具有缓解病情潜力的任何药物，都可能在 AD 各亚型间存在疗效差异。事实上，有报道说被动性 Aβ 免疫疗法对 APOEε4 携带者和非携带者即具有不同疗效和副作用 。 因为 CSF 生物标志物可反映 AD 核心病变进程，这些分子可应用于临床试验的事后分析，即基于其反映的潜在病变程度对患者队列进行分层。实际上，如患者亚组某种生物标志物特征提示存在淀粉样斑块病变 （如 CSF Aβ 1-42 降低） ，则该亚组患者对缓解病情的抗 Aβ 药物的反应程度，可能强于 CSF Aβ 1-42 水平正常的亚组患者 （表 2 ） 。 安全性监测 AD 缓解病情药物临床试验已由于副作用而受阻。 Aβ 疫苗 AN1792 临床试验中，值得注意的是少量患者发生脑膜脑炎，而在被动性 Aβ 免疫疗法 AAB-001 应用过程中导致部分患者出现血管源性水肿 。在诊断脑炎和 BBB 损伤性疾病所致水肿方面 ， CSF 分析是标准方法，可有效应用于 AD 缓解病情药物临床试验。 临床试验中，在患者基线水平、治疗前进行 CSF 分析可发现并排除混淆于 AD 的某些慢性感染或 CNS 炎症性疾病 （如神经包柔螺旋体病） 。假如将这些病例纳入，则会导致错误的结论 （如认为试验药物具有导致脑炎的副作用） 。基线 CSF 样本也可与治疗开始后的 CSF 样本相比较，通过比较有助于发现药物所致的 CNS 炎症激活副作用。因此， CSF 生物标志物可作为临床试验的安全性监测手段 （表 2 ） 。治疗期间纵向 CSF 采样可提示，是否试验药物长期应用可诱导损伤性免疫激活。 诊断性治疗标志物 （ theragnostic markers ） 表 2 CSF 生物标志物在 AD 临床试验中的应用 应用 具体描述 应用时点 涉及生物标志物及其作用 提高诊断准确性 提高受试者诊断准确性，强化患者队列为 AD 属性 试验启动前 t-tau 和 p-tau 升高、 Aβ 1-42 降低为 AD 指证 AD 病例分层 AD 患者 CSF 生物标志物显示 Aβ 代谢紊乱者，较之未显示 Aβ 代谢紊乱者，更易于对抗 Aβ 药物产生反应 事后分析 Aβ 1-42 可用于缓解病情抗 Aβ 药物试验的病例分层； p-tau 可用于减轻 tau 磷酸化或神经原纤维缠结病变药物试验的病例分层 安全性监测 抗 Aβ 候选药物 （如 Aβ 免疫疗法） 可能会引起副作用，如脑膜脑炎或血管源性脑水肿 基线评估及试验期间评估 CSF 细胞计数、 IgG 或 IgM 指数及 IgG 或 IgM 寡克隆带是发现并监测 CNS 炎症性疾病的标准检测项目； CSF/ 血清白蛋白比值是发现并监测血脑屏障损伤及所致脑水肿的标准检测项目 诊断性治疗 CSF 生物标志物检测可提示某种药物是否作用于 AD 患者 病变的分子机制 基线评估和试验时点评估 （包括研究最后一周） Aβ 1-42 是 Aβ 代谢和沉积的主要生物标志物； BACE1 抑制剂临床试验中检测 APP 亚型 （ sAPPα 、 sAPPβ ） 和 BACE1 活性有一定价值； p-tau 是检测 tau 蛋白磷酸化状态的主要生物标志物； t-tau 是有效发现并监测神经元或轴突损伤 （下游效应） 程度的生物标志物 缩写 Aβ ： β- 淀粉样肽； AD ：阿尔茨海默病； APP ：淀粉样前体蛋白； BACE1 ： β 位 APP 裂解酶 1 ； CSF ：脑脊液； p-tau ：磷酸化 tau 蛋白； sAPP ：可溶性 APP 胞外域； t-tau ：总 tau 蛋白 缓解病情的抗 Aβ 药物针对淀粉样斑块病变的效果，通常采用转基因 AD 小鼠进行评估；然而，对于散发性 AD 患者来讲，这种动物模型的预测价值较低 。生物标志物则可在动物实验和大型临床试验之间架起桥梁，可通过小样本临床试验，评价某种药物在人类是否具有缓解病情功效。只有最有前景的候选药物才可选作进一步的研究，因此提高了大型 Ⅱ 期、 Ⅲ 期试验的成功率。 对于 AD 这种缓慢进行性疾病来说，药物临床评估若采用量表评定，则需要较大的患者样本量和较长的疗程。对症治疗药物，如胆碱酯酶抑制剂可在短期内改善认知功能 （图 4 ） ；与之相比，缓解病情药物则不可能对症状及早起效。实际上，此类药物可能要经历数年才显示出认知下降速度的延缓 （图 4 ） 。因此，欲通过临床试验发现药物对认知功能的效果，缓解病情药物较之对症治疗药物需要更多的受试者，更长的疗程。 图 4 阿尔茨海默病药物疗效的认知功能量表评定 所示为理论上三种疗法 24 个月内对阿尔茨海默病的疗效差异。患者采用对症治疗药物 （如胆碱酯酶抑制剂） 期间，初始阶段 （前 6 个月） 可见认知功能改善，之后认知功能开始降低，但与接受安慰剂治疗的患者之间仍存在显著差异 。接受缓解病情药物治疗的患者认知功能降低程度弱于安慰剂治疗患者，但前者认知功能并未改善。因此，欲通过临床试验发现缓解病情药物对认知功能的疗效，需要比对症治疗临床试验更多的病例和更长的疗程。 CSF 生物标志物在病情缓解药物临床试验中具有应用价值，可提供药物潜在作用于病变过程的客观证据。事实上，若宣称某种药物具有病情缓解作用，则必须在改善认知衰退的同时具备上述证据 。 用于发现并监测药物生化效应的生物标志物，称为诊断性治疗标志物。这种生物标志物可用于发现并监测药物的特异性效果和病变过程的下游效应 （表 2 ） 。临床试验采用诊断性治疗标志物，可实现较少的患者数量和较短的疗程，因此对于确定是否继续昂贵的大型 Ⅱ 期、 Ⅲ 期临床试验有应用价值。在 AD 研究中采用诊断性治疗标志物是可行的，因为纵向采样发现，不同时点 CSF t-tau 、 p-tau 和 Aβ 1-42 水平个体内变异性较低 。其中某些生物标志物也可能作为替代性临床终点 （替代性生物标志物） ，不过这种可能性尚需临床试验的全面评定。最后，诊断性治疗生物标志物对于药物监管也有重要作用；原因在于，只有某药可改善认知功能则才能称之为缓解病情药物，而通过生物标志物可证实药物对核心病变进程的效果 。 目前，仅初步研究证据提示 CSF 生物标志物可作为有效的诊断性治疗标志物。重要的是，胆碱酯酶抑制剂和锂制剂 （已证实不影响 AD 发病分子机制） 对 AD 患者 CSF 核心生物标志物也不起作用 。而动物研究数据显示， γ- 分泌酶抑制剂治疗可降低皮层、 CSF 和血浆 Aβ 水平 。类似地，在非人灵长类， BACE1 抑制剂治疗亦可导致 CSF Aβ 1-42 ， Aβ 1-40 和 sAPPβ 水平降低 。 AD 患者接受有效的抗 Aβ 治疗后， CSF Aβ 水平是否发生变化尚不得而知。强化 Aβ 清除复合物 PBT2 的 Ⅱ a 期试验显示，治疗期间 CSF Aβ 1-42 水平呈剂量依赖性降低 。并且，淀粉样肽靶向药物 phenserine 的临床研究数据也提示， CSF Aβ 可能对评估疗效有应用价值 。由于 AN1792 Ⅱ a 期临床试验的中断，在治疗患者中 CSFAβ 1-42 未见变化，但可见下游生物标志物 t-tau 降至正常 。 γ 分泌酶抑制剂 LY450139 临床试验亦未显示对 AD 患者 CSF Aβ 1-42 的效应 （采用 ELISA 法测定） 。然而，采用该药物对年轻健康志愿者进行急性治疗，却显示对 Aβ 生成率有明确的抑制效果 （ Aβ 生成率通过同位素标记的新合成 Aβ 测定值与原有的未标记 Aβ 测定值之比获得） 。正在进行的某些缓解病情药物临床试验，已将生物标志物作为试验终点指标。这些试验将提供深入证据以证实是否生物标志物可用于评估缓解病情效应，并作为替代性生物标志物预测疾病结局。 血浆生物标志物 在外周血寻找可靠的 AD 生物标志物的努力取得了些许的成功。目前已提出数种候选的血液生物标志物，但独立研究尚难以证实这些分子的变化。在接下来的部分，将重点讨论血浆 Aβ ，它是最广泛应用的 AD 外周生物标志物检查项目。还将评价某些探索性研究，针对的新型血浆生物标志物显示的结果颇具前景。 血浆 β- 淀粉样肽 许多研究中检测 AD 患者血浆 Aβ ，将其作为生物标志物；但研究结果却不尽一致。某些研究者报告 AD 患者血浆 Aβ 1-42 或 Aβ 1-40 较年龄匹配健康对照个体轻度升高，但多数研究未发现两组间存在差异 。另外，某些研究检测血浆 Aβ 以探索其在认知正常老年个体中预测 AD 的价值，发现血浆 Aβ 1-42 和 Aβ 1-40 水平在临床前 AD 和未发生 AD 个体间均在较大的重叠。部分研究报告，血浆 Aβ 1-42 升高或 Aβ 1-42 /Aβ 1-40 比值升高是未来发生 AD 的危险因素，但另外的研究数据却与之相反 。这些令人失望的结果或许可以这样解释：由于血浆 Aβ 源自外周组织，并不能反映脑内 Aβ 的周转或代谢 。并且，因 Aβ 具有疏水性，需与血浆蛋白相结合，可导致其抗原表位被遮蔽及其他分析干扰现象 。 新型血液生物标志物 多种有前景的新型 AD 血液生物标志物已见于报道。某项研究中对 18 种血浆信号和炎症蛋白进行多变量联合检测，可准确发现 AD 患者，并预测 MCI 个体 AD 的发病 。通过对 120 种信号蛋白进行微阵列夹心 ELISA 法过滤筛选，确定了上述蛋白。未来尚需独立研究以判定这套蛋白是否是诊断前驱型 AD 的最佳生物标志物组合，并进一步评估这一方法的诊断价值。另一项研究探索性采用蛋白质组学技术发现，血浆中补体因子 H 和 α 2 - 巨球蛋白可见 AD 相关性升高，这一结果已通过半定量的免疫沉淀技术进行重复验证 。还有报道， AD 患者血浆中心房利钠肽原 （ pro-atrial natriuretic peptide ） 中间区 / 内皮素 -1 前体羧基端片段比值升高 。如果上述研究或其它结果在独立研究中可以重复，所采用的免疫分析技术适宜作为实验室常规检查项目，那么这组血浆蛋白也可能作为 AD 的筛查项目。 未来展望 CSF 生物标志物对于 AD 具有较高的诊断价值，联合应用这些生物标志物并结合脑结构影像学 （ CT 、 MRI ） 或功能影像学 （ SPECT 、 PET ） 将增加诊断准确性，优于单用 CSF 生物标志物或影像学技术。目前，仅少数研究直接应用上述项目。据报道， CSF 生物标志物联合 CT 或 MCI 测定内侧颞叶萎缩程度，可提高 AD 诊断的准确性 。另外，联合检测 CSF 生物标志物水平和脑结构异常程度 （通过 MRI ） ，可更准确地预测遗忘型 MCI 转化为 AD 的可能性，优于单独应用上述工具 。类似地，应用 CSF 生物标志物检测，同时采用 133 氙 （ Xe ） 吸入技术或 SPECT 技术检测局部脑血流，亦可提高前驱型 AD 的诊断准确性 。还有，尽管 11 C-PIBPET 联合 CSF 生物标志物检测的研究尚未开展，但有研究显示， 11 C-PIB 结合率与 CSF Aβ 1-42 呈强烈负相关 。 框 2 阿尔茨海默病研究性诊断标准 下述的可能阿尔茨海默病 （ AD ） 诊断标准包括核心标准 （早期记忆损害） 和支持标准 （一种或多种生物标志物阳性） 。 核心标准 存在进行性情景记忆损害持续 6 个月以上的证据 （患者自述或知情者报告） ，并经客观测试证实；记忆损害可单发或伴发其他认知功能变化 选择性支持标准 MRI 显示内侧颞叶 （海马、内嗅皮层、杏仁体） 萎缩 （可定性判定或容积定量，并参考年龄匹配人群的特征数据） 脑脊液生物标志物阳性结果 （ β- 淀粉样肽 1-42 降低、总 tau 蛋白和 / 或磷酸化 tau 蛋白升高） PET 显示双侧颞顶叶区葡萄糖代谢减少或 β- 淀粉样肽配体 （ 18 F ‑ FDDNP 或 11 C 标记匹兹堡复合物 B ） 结合率增强 存在家族性 AD 所致突变 选择性排除标准 病史显示症状突发，或早期症状中包括步态障碍、癫痫发作或行为改变 临床表现见局灶性神经系统体征，如轻偏瘫、感觉缺失、视野缺损或早期锥体外系体征 其他可致记忆损害及相关症状的病症，如非 AD 型痴呆、重性抑郁、脑血管病、中毒或代谢异常；或内侧颞叶 MRI 液体衰减反转恢复 （ FLAIR ） 或 T 2 加权信号异常，提示为感染或血管性损伤 框 3 阿尔茨海默病学会质量控制规程 此项质控规程的目的是实现科研和临床实验室脑脊液 （ CSF ） 生物标志物测定的标准化。达到这一目的将提高分析准确性并增强纵向稳定性。该规程实施后，生物标志物测定值在不同实验室间 （进而在不同文献间） 将可直接比较。 该规程由瑞典哥德堡临床神经化学实验室与阿尔茨海默病学会联合实施，多家生物技术公司和参考实验室为其中代表，如阿尔茨海默病神经影像学计划 （ ADNI ） 的生物标志物核心团队。 CSF 相关科研和临床实验室，以及制药公司均实施了该规程。 该规程只对通用的商业检测模式 （不适合家庭检测） 开放，共有两部分组成。第一部分为腰穿和 CSF 采样的标准化流程 （附表 1 ） 。第二部分为实验室外部质控程序，具体包括 CSF 样品分装并送至成员实验室进行生物标志物分析，以及随后将所得数据输入报表回传。 每个质控周期的最终报告中，均附加各实验室生物标志物测定值的信息，以便于成员实验室间进行生物标志物均值和变异性的比较。另外，还报告各实验室 CSF 生物标志物水平的纵向稳定性 （各检测时点间的偏差百分率） 。这些报告作为对成员实验室的反馈，能够发现生物标志物水平超出可接受范围，及其突然变化或纵向漂移。 在多种生物标志物联合检测模式确定后，需进行大型多中心试验以验证其诊断价值。在 AD 背景下，这项试验项目也可提供信息以服务于 MRI （检测脑萎缩） 和 PET （检测 Aβ 负荷） 检测，从而最精确地发现病变脑区。而高分辨率 MCI 扫描以及新型淀粉样肽配体 （如 AZD2184 ）， 是否可提高诊断敏感性和特异性，尚需补充相关数据 。一旦临床实践中推行上述生物标志物，费用方面的考虑就成为重要事项。 CSF t-tau 、 p-tau 和 Aβ 1-42 联合检测费用约为 200 美元，而结构性 MRI 检测和 11 C-PIB-PET 扫描则分别约为 500 美元和 5000 美元。 目前应用的 AD 诊断标准是 25 年前推行的 NINCDS-ADRDA 标准。而 AD 诊断采用这一标准，很大程度上有赖于排除其他痴呆 。并且，依照这一标准，诊断 AD 需首先判定患者为痴呆 （定义为认知症状程度已影响社会活动或工作能力） 。精神疾病诊断与统计手册第 4 版 （ DSM- Ⅳ ） 和国际疾病分类第 10 版 （ ICD-10 ） 标准，均为 AD 临床常规诊断所采用，也指出患者诊断为 AD 前应首先明确为痴呆 。如果缓解病情药物可应用于 AD 患者，那么依照这些标准无疑将早期 AD 患者排除在有效治疗之外。 新的 AD 研究标准允许将疾病早期阶段纳入到 AD 诊断中。该标准核心内容为临床表现情景记忆损害、伴一种或多种生物标志物 （ MRI 、 PET 和 CSF 生物标志物） 异常 （框 2 ） 。而生物标志物作为临床机构早期 AD 诊断项目应如何开展，尚需更细致的指南。指南中应详述以下项目：记忆损害评定量表、 CSF 生物标志物测定项目和参考值、 MRI 脑萎缩 （全脑、海马、内嗅皮层） 测定、 PET 脑区淀粉样肽配体结合测定。关于这些项目的研究才刚刚开始 。 CSF tau 和 Aβ 的检测方法已经过验证 。单中心研究对同一批样本同时检测，显示这些生物标志物的生物变异性较低 。然而，不同中心报告的患者生物标志物水平则存在变异 。 CSF 生物标志物水平在实验室间产生的这种变异，将使多中心科学研究和临床试验更加复杂，也使得其通用参考值的采用受阻。 产生各中心间 CSF 生物标志物水平变异的原因，可能在于临床操作过程的差别，比如腰穿、 CSF 采样及其他实验室操作步骤的差别，以及批间检测变异。这些变异均为临床化学检验所熟知，实行常规的实验室内部质控程序即可控制。为此，瑞典哥德堡临床神经化学实验室联合阿尔茨海默病学会制定了 CSF 生物标志物的质控规程 （框 3 ） 。该规程对腰穿、 CSF 采样和分析等步骤进行了规范。标准化操作规程将实验室检测前和检测中操作的变异降到了最低，从而实现了不同实验室和不同文献数据的直接比较。为克服 CSF 生物标志物的批间变异，生物标志物检测试剂盒供应商应实行新的质控标准。测定数据应通过校正曲线显示最低总体变异性，以及批间变异的严格限定值。要实现这一目标，需对关键检测试剂 （包括抗体和定标液） 进行严格质控。长期目标是，通过上述质控规程的实施，为 CSF 生物标志物更普遍应用于常规临床实践和多中心临床试验奠定基础。 结论 大量研究显示，联合检测 CSF 核心生物标志物 Aβ 1-42 、 t-tau 和 p-tau 将有效诊断 AD 患者，并发现 MCI 病例中的前驱型 AD 患者。里根夫妇研究所 - 国立衰老研究院 （ NIA ） 联合工作组，曾发布理想 AD 诊断生物标志物判定标准 （附表 2 ） ，而上述生物标志物正符合这一标准。 CSF 基础生物标志物也可作为鉴别单纯 AD 、排除其他病症的工具 （表 1 ） 。因此， CSF 生物标志物在临床诊断机构可能获得常规应用，但由于三种生物标志物联合检测对无症状 AD 的阳性预测值较低，故而在认知损害出现前采用上述生物标志物作为 AD 筛查手段受到了限制。 综述文献选择标准 通过 PubMed 检索关于阿尔茨海默病生物标志物的英文文献，采用下列关键词： “ Alzheimer ” 、 “ biomarker ” 、 “ cerebrospinal fluid ” 、 “ CSF ” 、 “ diagnosis ” 、 “ plasma ” 、 “ serum ” 、 “ amyloid ” 、 “ tau ” 、 “ treatment ” 和 “ therapy ” 。并且采用与各部分内容相关的关键词检索。另外，还从首次检索文献的参考文献中再选取文献，并重新阅读自身文献库中已有文献。 CSF 生物标志物也可作为有价值的新药开发工具。 CSF Aβ 1-42 、 t-tau 和 p-tau 作为诊断性标志物在临床试验中得到迅速应用，从而实现 AD 病例数的精简。而 CSF 基础生物标志物则作为安全性标志物。最后，小规模研究中应用 CSF 生物标志物，可为影响 AD 病变药物提供有价值的生化数据。而这些数据将为确定是否进行昂贵的 Ⅱ 期、 Ⅲ 期大型试验提供关键信息。 参考文献 1. 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No.:CD005593. doi:10.1002/14651858.CD005593(2006). 附表 1 LP 及 CSF 生物标志物分析流程 腰椎穿刺 步 骤 注 释 在 LP 前应进行 CT 或 MRI 检测 LP 禁用于颅内压增高者或脑占位病变者 检查患者是否使用抗凝药 LP 禁用于使用抗凝药 （如华法林） 患者 使用血小板聚集抑制剂 （如阿司匹林或 NSAIDs ） 并非 LP 禁忌症 在规定时间进行 LP （ 8 时 -12 时） 避免 CSF 生物标志物的昼夜变化 患者坐位或侧卧位；进针点位于 L3-L4 或 L4-L5 椎间隙 患者体位和进针点不影响结果 进针点区域皮肤按标准程序消毒 （使用无菌手套、口罩） 该步骤可降低局部感染风险 可进行局部麻醉 局部麻醉有诱发副作用的风险，可用于担心 LP 期间局部疼痛的患者。 使用小号针具 （直径 0.7mm 、 22G ） ；采用无创技术：平行于硬膜纤维斜向刺入 小号针可使硬膜的针孔更小，若硬膜纤维未截断则针孔更易于愈合，从而降低 LP 后头痛的风险 若见穿刺出血，前 1-2ml CSF 弃去；在新试管中收集 CSF 样本 CSF 样本受血液污染可干扰某些测定项目，特别是 IgM 分析 采用非吸附性 （聚丙烯） 试管收集 CSF 样品 聚苯乙烯或玻璃试管会将疏水性蛋白 （如 β- 淀粉样肽） 吸附到试管壁，而聚丙烯试管则可避免。 单管收集需达到标准量 （ 10-12ml ） ，采样后缓慢翻转试管混匀 CSF CSF 标准量并缓慢混匀可避免浓度梯度的影响 CSF 收集量不会增加 LP 后头痛风险。 LP 后嘱患者休息半小时 长时间卧床休息或其他步骤对 LP 后头痛风险无影响 CSF 样品需即刻送至当地实验室 室温下， CSF 样品中细胞将开始溶解，从而影响 CSF 细胞计数 实验室操作步骤 步 骤 注 释 CSF 基础分析 取部分样本用于 CSF 细胞计数 （直接操作） 原试管中 CSF 样本离心后将上清液分装至聚丙烯试管 当地实验室一般进行 CSF 基础生物标志物分析；另将部分 CSF 和血清送至专业实验室。 CSF 运输 CSF 核心生物标志物分析在专业实验室进行。 1ml 量即可满足 CSF 核心生物标志物检测，有必要可重测 CSF 可通过普通邮寄方式在室温下运输，并在 2 日内到达。如时间更长，样本需干冰冷冻运输。 CSF 核心生物标志物分析 在实验室进行特异性生物标志物分析前，所有 CSF 样本均应处于冷冻状态 （即 CSF 样本室温下送达者须冷冻，冷冻状态送达者需保持） 需进行二次分析以增强准确性 在每一轮应进行两次及以上室内对照 CSF 样本 （混合 CSF 分装品） 分析，以使批间变异性降至最低。 缩写 AD ：阿尔茨海默病； CSF ：脑脊液； LP ：腰椎穿刺 附表 2 理想 AD 生物标志物判定标准 理想诊断标志物判定标准 CSF 生物标志物现状 可探测到 AD 发病分子机制或神经病理学的基本特征 尸检和 PIB-PET 研究显示， CSF Aβ 1 – 42 是脑内纤丝状淀粉样病变的生物标志物 多途径证据显示 CSF t-tau 可反映轴突变性和受损的程度 ，但形成神经原纤维缠结的神经元可能也会释放 t-tau 尸检研究显示 CSF p-tau 可反映脑内神经原纤维缠结病变 在神经病理学证实 AD 病例中得以验证 在多项尸检确诊患者系列研究中证实，对于区分 AD 与认知正常老年个体及其他类型痴呆患者， CSF 生物标志物具有较高的敏感性和特异性 发现 AD 以及鉴别 AD 与其他类型痴呆的敏感性和特异性均 80% 多项研究显示， AD 背景下 CSF 生物标志物的敏感性和特异性为 80%-90% ；在大型前瞻性研究中亦为同样结果 在早期阶段 （如 MCI 期） 即可发现 AD 多项大型多中心研究显示，对于在 MCI 病例中发现前驱期 AD ， CSF 生物标志物具有较高预测值 具有可靠性 ELISA 法和 xMAP ® 法 （ Luminex ， Austin ， TX ， USA ） 等分析方法相关资料均可获取，检测方法具有极佳的抗体特异性和检测性能 生物标志物的批内和室内变异性较低，但室间变异性较高，凸显出标准化的必要性 无创性 LP 可视为适度的有创性操作 ，但大型前瞻性研究显示，该方法未见严重并发症，认知症状评估过程中，患者自述 LP 后头痛的可能性极低 操作简单、费用不贵，适合临床常规应用 在临床实验室中 ELISA 法为标准分析技术； CSF 生物标志物的临床应用日渐增加。 上述 AD 生物标志物标准由里根夫妇研究所 - 国立衰老研究院联合工作组制定 。 缩写： AD ：阿尔茨海默病； CSF ：脑脊液； ELISA ：酶联免疫吸附检测； LP ：腰椎穿刺； MCI ：轻度认知功能损害； PIB ：匹兹堡复合物 B ； p-tau ：磷酸化 tau 蛋白； t-tau ：总 tau 蛋白。 参考文献见附件 附图 1 患者坐位腰椎穿刺 棘突位置已作标记。进针点在 L3-L4 椎间隙，位于两髂后上棘连线中点。应戴口罩和无菌手套，进针周围区域进行标准消毒。可选做局部麻醉 （如 1% 利多卡因） 。可使用无创针 （ Sprotte ） 或标准的 Quincke 针 （ 0.7mm ， 22G ） 。为使硬膜针孔最小化，应平行于硬膜纤维斜向进针 （与脊柱成 90° 角） 。应缓慢进针并朝向头侧。进针至黄韧带 （弓间韧带） 时抵抗感略增，再进针几个毫米后抵抗感降低，提示进入蛛网膜下腔。之后抽出针芯，脑脊液 （ CSF ） 开始由针管滴出，前几滴 CSF 弃去。在聚丙烯试管中收集 CSF ，以避免疏水性蛋白 （如 β- 淀粉样肽） 吸附于管壁。操作结束时，缓慢退针 （无需复位针芯） ，穿刺部位绷带包扎。整个操作可在 30 分钟内完成。腰穿后头痛可见于少数患者，但程度通常较轻，无需处理或温和镇痛 （如扑热息痛） 即可 。不会发生其他类型并发症 （如脑内感染、血肿） 。腰穿并发症的发生率较低，这为其作为认知障碍患者临床评估的标准诊断步骤铺平了道路 。 1. 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Ageing Dev. 127, 129–132 (2006). 附图 2 阿尔茨海默病的 CSF 生物标志物 图示为神经元及周围星形胶质细胞和毛细血管，并标注阿尔茨海默病的核心病变进程及相应的生化标志物。其中包括 Aβ 斑块形成的生物标志物，即 Aβ 亚型 （特别是 Aβ 1-42 ） 、 APP 亚型 （ β-sAPP 和 γ-sAPP ） ，以及 BACE1 活性； tau 蛋白病变和缠结形成的生物标志物，磷酸化 tau 蛋白 （ p-tau 181 和 p-tau 231 ） ；轴突变性生物标志物， t-tau ；氧化应激生物标志物， F2- 异前列烷；血脑屏障生物标志物， CSF/ 血清白蛋白比值； CNS 炎症生物标志物，即 CSF 细胞计数和鞘内 IgM 和 IgG 生成。 缩写 Aβ ： β- 淀粉样肽； APP ：淀粉样前体蛋白； BACE1 ： β 位 APP 裂解酶； CSF ：脑脊液； p-tau ：磷酸化 tau 蛋白； sAPP ：可溶性淀粉样前体蛋白； t-tau ：总 tau 蛋白。 附图 3 鞘内免疫球蛋白生成 该术语指 CNS 慢性炎症和感染病症中免疫球蛋白的从头合成。免疫球蛋白生成可通过两种技术发现并互为补充。 IgG 和 IgM 指数可定量测定， CSF 中 OCB 可定性测定。 a. IgG 和 IgM 指数计算公式。通过该公式可得出 CNS 中生成的 IgG 和 IgM 含量。为补偿由血脑屏障正常进入血液的免疫球蛋白含量，公式中被除以 CSF/ 血清白蛋白比值。 b. IEF 凝胶显示 CSF 的 IgG OCB 。 CSF 蛋白在聚丙烯酰胺凝胶上分离并通过银染显影。正常情况下，多克隆 IgG 迁移较为弥散。通常将病例个体的血清和 CSF 并列分析。病例 1 为 AD 患者， IEF 电泳显示正常 （无 IgG OCB ） 。病例 2 为狼疮性脑病患者， CSF 中可见大量 IgG OCB 。 c. 琼脂糖凝胶和蛋白质印记 （ Western blot ） 可见 CSF IgM OCB 。正常情况下，多克隆 IgM 迁移较为弥散。病例 1 为 AD 患者，显示正常 （无 IgG OCB ） 。病例 2 为包柔螺旋体脑炎患者，脑脊液显示 2 条 IgG OCB 。 缩写 A D ：阿尔茨海默病； AsTf ：去唾液酸转铁蛋白； β-TP ： β- 微量蛋白； CSF ：脑脊液； IEF ：等电子聚焦 （电泳） ； OCB ：寡克隆带； S ：血清。 阿尔茨海默病脑脊液和血浆生物标志物（Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in.pdf
透视阿尔茨海默病生物标志物的研究、产业化和监管 Biomarkers for Alzheimer's disease ： academic, industry and regulatory perspectives Harald Hampel ， et al ，德国歌德大学精神病学、心身医学和心理治疗系等 摘要 随着阿尔茨海默病 （ AD ） 治疗策略的进步，有望延缓其发病和进程，从而大大降低 AD 的全球疾病负担 （ globalburden of disease ） 。为有效检验 AD 新药以尽早为患者提供治疗，亟需学术机构与企业和监管机构协作，制定和建立候选生物标志物发现和评定的标准及网络。生物标志物可用于药物安全性监测、症状前患者分层、治疗功效量化。具有上述特征的生物标志物，有助于在资产组合管理 （ portfoliomanagement ） 中实现客观的商业决策，也有助于新药的监管审批。 Hampel H, Frank R,Broich K, et al. Biomarker's for Alzheimer's disease: academic, industry andregulatory perspectives. Nat Rev Drug Discov. 2010: 9(7): 560-574 过去数十年来 阿尔茨海默病 （ AD ） 基础和临床研究的进展，使我们得以更透彻理解其分子机制和临床过程。 AD 为复杂的进行性疾病，其病变级联反应相互作用、序贯发生，包括 β- 淀粉样蛋白 （ Aβ ） 聚集与淀粉样斑块形成，以及 tau 蛋白 高度磷酸化和聚集与神经原纤维缠结形成。本病同时伴有相关的炎症反应和氧化应激过程。上述病理级联反应共同促成突触整合性的丧失和进行性神经变性 。上述研究进展已转化为具有疾病缓解 （ disease-modifying ） 潜力的多种候选新药，其中某些新药正通过临床试验进行评估 。转基因小鼠 AD 模型研究提示，多数疾病缓解新药对 Aβ 聚集早期阶段的效果最佳，而在严重斑块病变和神经变性形成的晚期阶段则效果欠佳 。然而，目前采用的诊断标准 （ DSM- Ⅳ 、 ICD-10 和 NINCDS-ADRDA ） 中，患者确诊 AD 需具备明显的痴呆症状，且对应于其神经病变进展程度。因此有必要改进本病的早期识别；事实上，如果有干预手段可延迟痴呆 1 年发生，据估计在 2050 年将减少发病人数 900 万 。 目前 AD 临床试验的 主要终点 为疾病症状的评定，如认知和功能损害。然而其检测效能并非由导致神经变性的关键性病理事件所决定，而是由多种因素所决定。因此，药物试验中采用临床评定量表作为结局检测指标，将难以确定新药对 AD 病变的效应。 框 1 生物标志物的验证 （ validation ） 和资格评定 （ qualification ） 为便于利益相关方之间的交流，有必要区别 “ 验证 ” 与 “ 资格评定 ” 。验证，通常指判定某项检测方法针对待测物的效能 （如敏感型和特异性） ，在监管部门文书中指批准临床诊断试剂盒以商业用途上市。资格评定，通常指通过质询药品开发相关事项确定其可信度。相关问题包括 “ 该药是否命中靶点，若是，达到何种程度？ ” ， “ 该药是否因其改变疾病机制而起效？ ” 或 “ 该药改变疾病病理生理机制是否具有临床相关性？ ” 通过资格评定需具备特定的患者人群和特定的治疗干预手段。例如，某个验证性检测项目若评定为 AD 生物标志物，其可能只适用于干预 β- 淀粉样蛋白 （ Aβ ） 生成机制的判定，而不适用于非 Aβ 机制判定。所以可以这样认为，某个检测项目若通过验证可以量化脑内或 CSF 中 Aβ 斑块 （或 Aβ 寡聚体、 Aβ 单体） ，就可将其评定为生物标志物，用于 β 位 APP 裂解酶 1 （ BACE1 ） 抑制剂的 AD 药物试验。当然，除了检测项目的验证性数据，资格评定还需要附加临床数据的支持。通过验证的检测项目可能并不具备生物标志物的资格，这就是验证与资格评定的区别。 生物标志物需要能反映临床实际情况，才可能最终作为替代性终点，从而合理地预测临床结局。 反映 AD 病变的 生物标志物 有助于相关药物的研发，由此对生物标志物的需求日益迫切。通过 AD 动物模型来确定某种疗法对散发性 AD 患者的疗效，仅具有较低的预测价值 。若采用人类生物标志物，通过短期的初步研究即可发现药物的生化效应，从而明确源自动物模型研究的候选药物是否影响患者的病变进程。在临床研究中，若生物标志物具有应用于特定患者人群的资格 （框 1 ） ，将有助于病例选择和疾病进程的药物疗效评估。在企业领导的新药研发过程中，生物标志物有助于候选药物的选择、作用机制的验证、剂量效应的确定，并可缩短临床试验周期、减少样本量。生物标志物还可作为临床结局的 替代性终点 （下文详述） ，从而强化了监管部门决策的客观性和有效性。例如，通过生物标志物项目，可认定某药是否可标明 “ 疾病缓解 ” 字样，而非仅对症治疗 。另外，生物标志物还可作为临床实践的诊断工具，从而在疾病早期和临床前阶段即可发现 AD 患者。最后，生物标志物也可作为疾病预防项目的筛选工具。 要实现上述目标，生物标志物必须具备下列条件： ① 测定方法可靠且经过验证； ② 具有作为诊断标志物的敏感性和特异性； ③ 对药物反应敏感； ④ 对临床结局具有预测性 。 临床试验中，生物标志物是反映 AD 病变核心事件或下游事件的指标，具有至少两方面的价值： ① 作为诊断生物标志物，发现并监测候选药物对疾病进程的效应； ② 作为安全性标志物，及早发现并监测候选药物的潜在副作用。 AD 新药临床试验中，作为安全性标志物的作用可能尤为重要，因为存在单克隆抗体相关性脑炎的风险 。生物标志物可为体液或组织中的 图 1 疾病缓解治疗效应的评定 a. 红色实线示意疾病缓解治疗或对症治疗期间认知衰退 （采用认知功能测验评定） 的进程，绿线示意接受安慰剂者的认知衰退进程。仅在停用治疗药物的第二阶段试验，疾病缓解治疗效应 （上方红色虚线） 才能够与对症治疗效果 （下方橙色虚线） 相区分。 b. 上方蓝色实线示意疾病缓解治疗期间脑萎缩 （采用 MRI 评定） 的进程，下方浅蓝实线和绿线分别示意对症治疗患者和接受安慰剂者的脑萎缩进程。上述差异在停用药物后继续保持，依据脑容量的结局指标，已能够区分疾病缓解治疗和对症治疗的效应差异，所以停药阶段的试验并非必需。 复合物，如某些脑脊液 （ CSF ） 检查项目 ；或为通过技术手段派生的 AD 病变相关产物，如脑影像学标志物。尤其是神经影像学技术 的进步，使得在 AD 临床极早期即可发现 Aβ 沉积、 tau 蛋白聚集和神经变性的证据 。然而，较之在医学其他领域生物标志物作为规范化标准的地位，目前 AD 生物标志物尚难以稳健地发挥 作用 。并且，有关 AD 诊断生物标志物的研究报道尚需遵循严格的质量标准，如诊断准确性研究的质量评价 （ QUADAS ） 标准 。 本文中将综述 AD 核心生物标志物的现状，这些候选标志物源自多种模式的研究，如神经影像学 （涉及结构、功能和代谢） 、神经化学和遗传学研究。针对企业利益相关者和监管部门，本文还将展望双方在生物标志物的探索和研发方面的共同远景。在我们看来，科学知识的整合，以及学术机构、制药企业和监管部门国际化、多学科的联合，将加快更为丰富的新型生物标志物的探索和共同开发，从而广泛地应用于 AD 等神经变性疾病的临床诊断和创新药物的临床试验。 影像学生物标志物作为临床试验终点指标 影像学检测作为 AD 临床试验的 次要终点 ，共有四种技术形态，即结构性磁共振成像 （ MRI ） 、功能性 MRI 、磁共振波谱 （ MRS ） 和单光子发射断层扫描 （ PET ） 。在结构性 MRI 研究中，特定脑区 MRI 测得体积与神经元数量成正相关 。血氧水平依赖性 （ BOLD ） fMRI 信号是脑区神经元信息输入和加工的主要指标 。 MRS 可显示脑组织生化成分的变化。采用 18 氟 -2- 氟 - 脱氧 - D - 葡萄糖 （ FDG ） ， PET 可显示神经元葡萄糖的消耗，葡萄糖消耗是神经元代谢的主要决定因素 。采用 Aβ 示踪剂， PET 可显示 AD 特征性的聚集体，即 Aβ 斑块 。 若某种神经生物学底物据推测适合作为生物标志物，就有望用于疾病缓解药物的评价。影像学技术可从宏观角度 （ fMRI 、 PET 、 MRS ） 和介观 （ mesoscopic ） 角度 （ MRI ） 提供脑区变化的信息。对于 AD 来说，了解脑内空间分布和颞叶动力学变化相当重要；原因在于 AD 为系统性脑病，进展过程遵循某种特定的模式，各阶段病变可能累及不同范围。另外，影像学生物标志物可作为预测性标志物，用于评定患者群体进展至痴呆的风险。比如，生物标志物可增加预测轻度认知功能损害 （ MCI ，临床上定义为难以截然区分为认知正常或痴呆的高危综合征） 转化为痴呆的准确性 。 结构性 MRI AD 的结构性 MRI 典型表现为海马旁回、海马、杏仁体、皮层后连合及皮层下核团 （包括基底前脑胆碱能系统） 灰质减少。在 纵向研究 中通过测定脑区萎缩速度， MRI 可作为潜在标志物辨别药物的疾病缓解效应和对症治疗效应 （图 1 ） 。表 1 和附表概述了基于 MRI 的不同疾病标志物的特征。 重复 MRI 扫描获取的体积测定值通常具有较高的可信度 ，这是将 MRI 作为疾病进展标志物的重要前提。并且一项多中心研究显示， 12 台不同型号 MRI 扫描仪人工和自动体积测量的变异度低于 5% 。为降低临床试验中不同 MRI 扫描仪测量的变异度，须进行 体模试验 （ phantomtest ） 以确保各中心的扫描仪质量达到最低标准。海马体积是 MRI 最常见的测量项目，可通过对 MRI 切片目测或手工绘图测定。而最新方法是将 MRI 在通用标准空间测得体积经自动化空间转换，再将皮层灰质密度、皮层厚度、白质密度的分布图或高分辨率空间 转换图 导出为单变量 或多变量统 计值。这种方法的劳动强度低于人工体积分析，目前在少数临床试验中已应用于次要终点的评定。然而，该技术的多中心可靠性尚未确定。 fMRI 的药理学应用 采用 fMRI 对 AD 患者的记忆进行研究发现，其内侧颞叶和顶叶存在激活模式的改变，异常部位与结构性 MRI 所见一致。首项单中心研究显示，这种方法能够发现药物对 AD 患者脑区激活的特定功效 （图 2 、表 1 、附表） 。而其针对 AD 患者的多中心研究和纵向研究尚未进行，这将是 fMRI 生物标志物研发的重要一环。 图 2 应用功能性磁共振成像 （ fMRI ） 探测胆碱能治疗对 AD 患者的皮层激活效应 AD 患者接受 3 个月的胆碱酯酶抑制剂开放标签治疗后，视觉感知任务中显示激活区域 （蓝色） 较治疗前缩小。在正常对照者中，视觉感知任务会募集顶叶参与，而在治疗者中表现为认知相关脑区的激活区域 （蓝色） 缩小。 质子 MRS 表 1 AD 的影像学生物标志物 方法 检测项目 横断面研究结果 纵向研究结果 展望 磁共振 成像 （ MRI ） 目测海马体积 针对 AD 和对照者有高度的辨别力 追踪观察难以识别萎缩 海马体积和全脑体积为最完善的结构影像学标志物，且均应用于临床试验。 其他影像学标志物可提供更全面的局部信息，但在应用于临床试验之前尚需要多中心评估。 手工测定海马体积 针对 AD 和对照者有高度的辨别力 ，预测 MCI 患者转化为 AD 准确度达 70%-80% 年萎缩率在 AD 患者和健康对照者分别为 3%-7% 和 0.9% 自动测定全脑体积 主要应用于纵向评价 年萎缩率在 AD 患者和健康对照者分别为 2.5% 和 0.4%-0.9% 自动测定局部脑萎缩类型 皮层和皮层下萎缩类型一致 AD 患者脑萎缩会扩展至全脑；难于导出应用于临床试验的效应值 功能性 MRI （ fMRI ） 激活过程中血氧水平依赖性 （ BOLD ） 信号成像 同一受试者各成像期间的 fMRI 数据具有高度可靠性 可见胆碱能治疗 AD 的特异疗效或脑局部激活改变 因其广泛应用，有望成为次要终点 最初的 fMRI 多中心研究呈现阳性结果 磁共振 波谱 （ MRS ） 单体素质子 波谱 NAA 测定 AD 患者和随后转化为痴呆的 MCI 患者均可见海马 NAA 水平降低 胆碱能治疗 AD 期间 NAA 水平升高 MRS 标志物可为结构性 MRI 和 fMRI 提供补充信息 已通过首项多中心研究的评价 正电子 发射断 层扫描 （ PET ） 葡萄糖 （ FDG ） 代谢 顶颞叶皮层可见典型的代谢降低；多中心之间的变异性较低 胆碱能治疗 AD 可见皮层代谢效应 FDG-PET 是多中心研究稳定有效的标志物，但因其费用和实用性导致应用受限 淀粉样蛋白影像 （采用 11 C-PIB ） 和胆碱能系统影像作为替代性终点的潜力尚不明确。 FDG-PET 和 11 C-PIB-PET 多中心研究尚不具有可行性 淀粉样蛋白 （ 11 C-PIB ） 活体人脑内可探测到淀粉样斑块和淀粉样血管病变 AD 进展过程中 11 C-PIB 摄入几乎未增加 乙酰胆碱酯酶 脑胆碱酯酶活性平均降低 30%-40% 乙酰胆碱酯酶抑制程度与 AD 认知改善程度相关 11 C-PIB ： 11 C 标记的匹兹堡复合物； FDG ： 18 氟 -2- 氟 - 脱氧 -D- 葡萄糖； MCI ：轻度认知功能损害； NAA ： N - 甲基天冬氨酸 质子 MRS （ 1 H-MRS ） 可对脑组织成分进行定量生化测定。已确立的最佳 1 H-MRS 标志物是 N - 甲基天冬氨酸 （ NAA ） ，这种氨基酸可反映神经元线粒体的功能状态 。在 AD 患者中均可发现其 NAA 水平降低与脑萎缩无关。首项单中心研究发现药物治疗可影响 NAA 水平，这项技术也已应用于多中心研究 （表 1 、附表） ；但尚未明确能否在临床试验中大规模应用。除此之外， 1 H-MRS 还可探测到其他多种代谢产物，如含胆碱复合物、肌酸及磷酸肌酸、肌醇、谷氨酸盐及谷氨酰胺，但其作为候选生物标志物的潜力尚存争议，有待研究确定 。 FDG-PET FDG-PET 通过测定局部葡萄糖代谢水平，反映静息态 （无认知激活） 神经元功能。 AD 的神经元功能受损， FDG 摄入率降低，突出表现在颞叶联合区，包括楔前叶和后扣带皮层。横断面研究和纵向研究显示，这一变化与认知损害程度密切相关。 FDG 摄入率的变化可客观测定，其变异系数低于标准的神经心理测试，因此可增加研究的强度 。 FDG 摄入率的变化通常与药物药效学作用相关，但也可反映疾病进程，特别是通过数月的随访测定。这项技术已应用于某些临床研究，并作为次要结局指标 。 淀粉样蛋白 -PET 多项研究显示， 11 C 标记的硫代黄素类物质匹兹堡复合物 B （ 11 C-PIB ） 可与 Aβ 选择性结合，对 AD 患者进行 PET 扫描即可显示 （表 1 、附表） 。这种淀粉样蛋白 -PET 扫描可提供关于 Aβ 斑块负荷的信息，且与脑解剖结构的变化无关 。 11 C-PIB 结合脑区与 Aβ 折叠体相关，后者可见于 典型斑块 和 弥散斑块 ，以及 淀粉样脑血管病 变 。 11 C-PIB 并不结合可溶性 Aβ 和 Aβ 寡聚体。 MCI 患者中有 2/3 可见皮层 11 C-PIB 摄入增加，从而具有进展至 AD 的可能性 。然而，相当多的非 MCI 老年受试者亦显示 11 C-PIB 摄入增加，但对其预后价值尚不清楚 。目前，新型 Aβ 示踪剂 Ⅱ 期试验已经启动，该物质由 18 F 同位素标记，较之 11 C-PIB 的半衰期更长，适用范围更广 。 胆碱能神经传递 图 3 生物标志物的 4 种类型，即靶点标志物、机制标志物、病理生理标志物和诊断标志物 依据生物标志物在商业、监管和临床决策中的贡献度，可将其分为 4 种类型；临床决策中的应用可再细分为临床科研和临床诊断 2 个方面。开发生物标志物的目的在于尽早将其应用于药物开发进程。首要步骤为证实待测复合物是否命中靶点并量化其作用程度。接下来按逻辑顺序检验以下三个方面： ① 命中靶点是否改变病理生理机制； ② 病理生理 机制的改变是否影响到 病变状态 ； ③ 病变状态的改变是否可预测患者临床状态的改善。若某种生物标志物能够证实治疗靶点的存在，或评价候选药物命中靶点的程度，就有可能获批作为早期发现和诊断 AD 的诊断性检测项目 （此时作用靶点在健康与患病状态之间存在差异） 。若某种生物标志物能够证实或量化药物的 作用机制 ，就有可能批准为治疗方案知情选择 （药物或初始剂量） 的诊断性检测项目。若某种生物标志物能够纵向量化患者的临床相关性病理生理效应，就有可能批准为治疗方案监测和个体化应用的诊断性检测项目；并且可用作替代性终点，为监管决策提供支持。另外，生物标志物还可保障医疗费用的合理使用，作为临床结局的衡量指标，为保险赔偿决策提供支持。 AD 患者由基底前脑到皮层区的胆碱能投射发生变性，已证实采用胆碱酯酶抑制剂治疗具有一定的疗效。针对胆碱酯酶、胆碱能受体和 胆碱转运体 的配体均已应用于人类研究 （表 1 、附表） ，但尚不符合生物标志物的资格要求。 影像学生物标志物的未来挑战 目前，临床试验中纳入影像学终点仍是基于各项独立研究。影像学操作和分析技术的标准化是多中心临床试验得到认同的先决条件。另外，监管部门也需要有关药物安全性或疗效的影像学证据。某种生物标志物如能够反映临床相关结局 （如认知功能降低） ，或能反映卫生经济学结局 （如入院率） ，则可作为替代终点。举例来讲，如果海马萎缩可反映记忆丧失这一临床相关结局，那么就可以将海马萎缩作为 替代终点 。不过这一相关性尚需未来加以研究并进一步确认。 然而，如果影像学标志物可反映疾病潜在进程，那么在概念验证 （ proof of concept ） 研究中可作为 预设的主要结局。临床病理学研究显示， MRI 判定的海马萎缩与海马神经元缺失相关 。因此，对于某些据称可减轻 AD 神经变性的新型复合物，可采用海马萎缩评估其作用机制。也就是说，在概念验证研究中，影像学标志物可能用于评估新型复合物可能的作用机制。例如， AN1792 疫苗试验 以及 AlZHEMED Ⅲ 期试验 均发现，治疗组脑萎缩和海马萎缩发生率高于未治疗对照组。然而，并未见到治疗组受试者认知降低速度高于安慰剂对照组的证据。上述例证说明影像学终点会发生非预期的结果，因而有助于我们更严格地评价对新型复合物作用模式的最初假设。 遗传分析在生物标志物研究中的作用 本文所论各生物标志物的应用均存在局限性，部分原因在于患病者和对照者内部均存在变异性 （实际上任何疾病的所有生物标志物都是如此） 。由于这种变异性，需要增加样本量以达到统计学意义；并且这种变异性在人类研究中明显高于动物研究，这其中有多种原因包括遗传变异性。所以，个体遗传分析有广泛的应用价值，具体表现在以下四个方面。 第一，某些生物标志物 （如 Aβ 42 ） 的发现直接源自对患病家族的遗传分析。在发现 AD 其他遗传性危险因素时，有必要通过同样途径来评价其蛋白质产物以及其他蛋白。近期研究中针对 AD 进行大型全基因组扫描 发现，聚集素 （ clusterin ， CLU ；也称载脂蛋白 J ） 和补体受体 1 （ CR1 ）为危险基因位点，提示这两种蛋白可能是有价值的 AD 生物标志物 （而载脂蛋白 E （ APOE ） 已公认在这方面并无价值）。这一结果也提示应重视对 补体 级联系统 （ CLU 和 CR1 均为其中一员） 的研究。 第二，现已明确，淀粉样前体蛋白（ APP ）或早老蛋白 （ PSEN ） 突变携带者，以及唐氏综合征 （ Down syndrome ） 患者或 APO ε4 等位基因纯合子携带者，在较明确的年龄段具有发生 AD 的极高风险。这就有望对这些特定人群生物标志物的症状前变化进行 跟踪 ，并联系其临床行为学状态。这种方法可提供丰富的信息，有效用于脑影像学生物标志物的分析 ，同样具有评估血液和 CSF 生物标志物的潜力 。 第三，个体间生物标志物水平的正常变异是标志物研究的问题之一；至少有部分属于遗传性变异，通过遗传分析即可明确。如研究提示，脑内微管相关蛋白 tau （ MAPT ）表达水平 和 CSFtau 蛋白水平 受 MAPT 单倍体的影响。这种现象在许多蛋白中都确实存在，其在血液和 CSF 的水平直接受到遗传变异的影响 。 第四，在生物标志物研究和临床研究中，将个体药物反应以及药物代谢过程 （个体间存在变异） 的数据纳入，将具有辅助价值。 阿尔茨海默病风险的基因检测 基因检测适用于早发型 AD 家族成员个体，并需依照 亨廷顿协议 （ Huntington's protocol ） 进行此项检测。基因筛查包括 PSEN1 ， PSEN2 ， APP 和 APOE 突变；但由于罕见 APP 或 PSEN2 突变，上述突变的筛查目前为专项检查。虽然针对典型晚发型 AD 进行的 APOE 遗传检测和预测性检测并不尽如人意 ，但 APOE ε4 纯合子的预测价值可与其他许多单基因遗传病 （ Mendelian disease ） 达到同等程度。实际上，人们对 APOE 基因分型的态度也在转变 ，遗传分析的预测潜力似乎也会有相当程度的增强。部分原因在于，针对 APOE 全基因位点 （包括 APOE 启动子的 TOMM40 区） 进行基因分型后，人们对其预测价值升高的评价日渐增多；同时全基因关联研究 （ GWAS ） 也有新发现 。 表 2 阿尔茨海默病候选的 CSF 核心生物标志物 待测物 （检测方法） 待测物特性和测试特性 个体间变异 AD 相关变化 评价性注释 评价 APP/Aβ 代谢 Aβ 42 （ ELISA ； Luminex ； Meso Scale Discovery ） 有多篇文献中评价混杂因素 ；测试特性包括 日内和日间 CV ，均已明确 6 个月和 24 个月的纵向 CV 分别为 5% 和 7% AD 和 MCI 期 AD 可降低 50% 结果一致，相关综述见文献 CSF Aβ 42 是针对 Aβ 代谢的 CSF 生物标志物的核心成分 Aβ 42 /Aβ 40 比值 （ ELISA ） 有多篇文献中评价混杂因素 ；测试特性包括日内和日间 CV ，均已明确 间隔 12 个月 和 24 个月 测定， Aβ 40 水平保持稳定 AD 可见比值降低，较 Aβ 42 变化显著 数据基于有限数量的研究，相关综述见文献 CSF Aβ 42 /Aβ 40 比值对 Aβ 生成代谢的评定较之单用 Aβ 42 更为准确 APP 亚型： sAPPα ， sAPPβ （ ELISA ； Luminex ； Meso Scale Discovery ） 测试特性和 CV 均有报道 未明 AD 中未见变化 数据基于有限数量的研究 APP 亚型无法应用于诊断，但对于临床试验 （如 BACE1 抑制剂） 有应用价值 BACE1 （酶活性测定） 测试特性包括日内和日间 CV ，均已明确 未明 AD 和 MCI 可见 BACE1 水平和活性升高 数据源文献采用不同检测方法 BACE1 活性的诊断价值有待深入评价，但对于临床试验 （如 BACE1 抑制剂） 有应用价值 Aβ 寡聚体 （ PCR 扩增法生物条形码测定 ） 未明 未明 一项初步研究显示在 CSF 中升高 针对早期方法的改进 Aβ 寡聚体是很有希望的候选生物标志物；但 CSF 中含量极低，检测方法开发有难度 总 Aβ 周转率 * 未明 未明 未明 方法学文献基于健康志愿者 临床试验中此法对于衡量 Aβ 生成和清除有应用价值；尚需改进方法以测定特定的 Aβ 亚型 （即 Aβ 42 和 Aβ 40 ） 的周转率 总 tau 蛋白 （ t-tau ） t-tau （ ELISA ； Luminex ） 有多篇文献中评价混杂因素 ；测试特性包括日内和日间 CV ，均已明确 6 个月和 24 个月的纵向 CV 分别为 6% 和 9% AD 和 MCI 期 AD 可见其水平显著升高 诸多文献的结果一致，相关综述见文献 CSF t-tau 是 CSF 生物标志物的核心成分，可用于临床试验中皮层轴突变性病变的监测 磷酸化 tau 蛋白 （ p-tau ） p-tau 181 （ ELISA ； Luminex ） 有多篇文献中评价混杂因素 ；测试特性包括日内和日间 CV ，均已明确 6 个月和 24 个月的纵向 CV 分别为 4% 和 7% AD 和 MCI 期 AD 可见其水平显著升高 诸多文献的结果一致，相关综述见文献 CSF p-tau 是 CSF 生物标志物的核心成分，可用于临床试验中 tau 蛋白磷酸化状态的监测 p-tau 231 （ ELISA ） 测试特性和 CV 均有报道 间隔 12 个月 和 24 个月 测定， p-tau 231 水平升高 AD 和 MCI 期 AD 可见其水平显著升高 诸多文献的结果一致，相关综述见文献 CSF p-tau 是 CSF 生物标志物的核心成分，可用于临床试验中 tau 蛋白磷酸化状态的监测 Aβ ： β- 淀粉样蛋白； APP ：淀粉样前体蛋白； BACE ： β 位 APP 裂解酶； CSF ：脑脊液； CV ：变异系数； MCI ：轻度认知功能损害； sAPP ：可溶性 APP 。 * 同位素标记亮氨酸注射，同时 CSF 持续采样，采用免疫沉淀、胰蛋白酶消化和质谱分析法测定 Aβ 。 这方面努力取得的成果将可能是，针对个体的 AD 发病风险进行预测性检测，并将其分为三类 人群 。第一类人群为 APOE ε4 纯合子携带者，具有高度的 AD 发病风险。其风险受到其他基因和 APOE 启动子多态性的调节 （约占人群的 3% ） 。第二类人群为 APOE ε4 杂合子携带者，具有中度的 AD 发病风险。其精确风险受到 APOE 其他等位基因 （ APOE ε2 风险低于 APOE ε3 ） 和 APOE 启动子多态性，以及其他 GWAS 新发现基因的调节。第三类人群为非 APOE ε4 等位基因携带者，具有低度的 AD 发病风险。要对检测数据进行解释，需开发出精准的 风险预测图 ，而再面向普通民众进行讲解仍是一项挑战。虽然还有待探索，但基因检测有望作为辅助应用项目，在相当程度上有助于 MCI 中 AD 易感者的发现 。 除了 AD 较常见的危险变异型，如 CLU 、 CR1 和 PICALM （磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装蛋白） ，随后还发现了个体中罕见的高危变异型， AD 风险的遗传学架构日渐明朗，我们将能够在症状出现前构建 AD 的风险预测算法。虽然这将会大大改善研究现状，但并不意味着这种预测算法必定会应用于高危人群的筛查 （详见我们推荐的诊断流程模式图，图 3 ） 。 生化生物标志物在临床试验中的应用 除了遗传学和影像学生物标志物， AD 还有两类生化生物标志物。第一类是核心生物标志物，反映 AD 的基 础性发病事件 （如 APP 和 Aβ 代谢失调） 。第二类是下游生物标志物，反映继发病变现象 （如轴突变性） 。较之 ADCSF 生物标志物探索所取得的成功，探索外周血可靠生物标志物的成果有限。事实上，虽然潜在的血液生物标志物见于许多文献报道，但缺乏其他团队的跟踪性研究，或是无法证实其确切诊断价值。不过，近期一项初步研究报告，血浆中 18 种不同的信号蛋白、急性期蛋白和炎症蛋白可构成有效的诊断模式，值得进一步研究 。血浆 Aβ 40 和 Aβ 42 均可在外周血测得，但在重复研究中无助于 AD 的发现 ，且并不能反应脑内 Aβ 的生成 。另一方面，多数研究集中在 CSF 生物标志物，其能更直接反映脑内的生化状态； CSF 可通过腰椎穿刺采集，并无显著不良反应 。 确立的 CSF 生物标志物 经过大量的独立研究，有四种 CSF 生物标志物通过了评定，即 Aβ 40 、 Aβ 42 、总 tau 蛋白和磷酸化 tau 蛋白 。 Aβ 40 、 Aβ 42 和磷酸化 tau 蛋白可反映 AD 病程的核心要素，即脑内淀粉样病变 和神经原纤维病变 。而总 tau 蛋白为轴突损伤的非特异性标志物，可反映神经变性的活跃程度 。 AD 不同阶段 （包括 MCI ） CSF 中均同时可见总 tau 蛋白和磷酸化 tau 蛋白升高和 Aβ 42 降低 （或 Aβ 42 /Aβ 40 降低） （表 2 ） 。上述 CSF 生物标志物高度的诊断价值已通过三项大型多中心研究的验证，即 AD 神经影像学倡议 （ ADNI ） 研究 、 DESCRIPA 研究 和瑞典智能项目 。 潜在的 CSF 生物标志物 还有多种候选生物标志物可反映 AD 的原发病变或继发事件。前者如 Aβ 寡聚体、 β 位 APP 裂解酶 1 （ BACE1 ）活性和含量、 APP 分泌亚型、 Aβ 降解产物 ；后者包括氧化应激反应、炎症反应和神经胶质增生等事件 。这些生物标志物的诊断潜力尚未充分研究，而部分生物标志物 （如 BACE1 活性 和 APP 亚型 ） ，也可提供某些候选药物 （如 BACE1 抑制剂） 生化效应的重要信息。 监测新药生化效应 由于 AD 症状进展缓慢且表现各异，在疾病缓解候选药物临床试验中，要发现患者认知下降速度的变化，需要极大规模的患者队列和长达数年的疗程。而首先进行小型短期试验，可提供药物对核心病变功效的生化证据，为是否开展 Ⅱ 期、 Ⅲ 期临床试验做出决策。 乙酰胆碱酯酶 （ AChE ） 抑制剂临床治疗试验可发挥概念验证的作用，将 CSF AChE 作为 AD 生物标志物可发现并监测药物生化效应。该项研究发现，治疗过程中 CSF AChE 活性显著升高，呈剂量依赖性并与药物作用机制和临床结局相关 。 CSFAChE 升高的机制尚不清楚，但可能与基因表达增强和 AChE 释放入 CSF 增多有关 （由毒蕈碱乙酰胆碱受体反馈环路介导 ） 。 CSF tau 蛋白和 Aβ 42 的个体内变异极低， 6 个月和 24 个月随访研究的变异系数分别为 4%-6% 和 7%-9% 。这些结果提示，即使生物标志物发生细微变化也可监测到。对转基因小鼠和豚鼠采用 γ- 分泌酶抑制剂治疗，显示其皮层、 CSF 和血浆 Aβ 水平均降低。 γ- 分泌酶抑制剂 LY450139 Ⅱ 期试验中，急性治疗可致血浆 Aβ 水平剂量依赖性降低，而慢性治疗仅见 CSF Aβ 42 有降低的趋势 。对猴类采用 BACE1 抑制剂治疗可致 CSFAβ 42 、 Aβ 40 和可溶性 APPβ 降低 。而且在 PBT2 （提示可影响金属诱导的 Aβ 聚集 ） 临床研究中，也见到 CSF Aβ 42 水平剂量依赖性降低 ；但其降低 Aβ 42 的潜在机制尚不清楚。 Aβ 靶向药物 phenserine 的小型临床研究也提示， CSFAβ 可有效用于其疗效评价 。 涉及神经元损伤的纵向研究 ，以及中止的 AN1792 Ⅱ a 期研究数据 中发现，如某种疗法可成功抑制神经变性进程，则总 tau 蛋白会降至正常水平。同样的情形亦可能见于磷酸化 tau 181 ，一项关于美金刚的初步研究支持这一结论 。 治疗初始 CSFAβ 42 水平降低 （斑块沉积所致） 的 AD 患者，治疗过程中其生物标志物水平 （特别是 CSF Aβ 42 ） 的变化目前并不清楚。治疗启动后其变化程度和方向也可能与 CSF 采样时点有关。总之，上述研究支持将 CSF 生物标志物作为临床试验中药物生化效应监测的有效工具。 透视生物标志物的产业应用 监测 新药生化效应 适合临床试验的生物标志物不仅有助于企业和监管部门决策，也可作为诊断标志物以实现合理用药。因此，生物标志物将适用于医药产品开发的各个阶段 （即从药物发现到临床应用，图 4 ） 。而且，生物标志物也可应用于本文推荐的诊断流程，其中纳入了风险评估筛查、诊断和预后，以及疗效监测 （图 3 ） 。这一诊断流程始于高敏感性、低特异性的检测项目 （费用较低） ，之后的检测项目特异性增加，且在疗效纵向评定中有应用潜力。 图 4 生物标志物的转化 生物标志物的应用从临床试验的研究工具，到监管决策的辅助工具，再到临床决策的商用辅助诊断项目，这一转化过程为有效选取不同患者人群提供了便利。作为研究工具，生物标志物能够发现大批高危人群（即金字塔底部），他们将从这种廉价、安全的一级预防策略中受益。诊断标志物可用于伴疾病早期表现的少数人群，经确诊后才能进行较昂贵且具较大风险的治疗性干预，并需对应于个体的病理生理状态，并能够监测疗效（即金字塔顶部）。在个体化治疗过程中，诊断标志物发挥作用有赖于信息技术的支持，称为 “ 临床决策支持系统 ” 。基因组学和分子影像学等不同的生物标志物均可应用于诊断流程。整个诊断流程始于风险评估（用于一级预防），接下来分别为筛查（用于早期发现和早期干预）、诊断和预后判断（用于疾病分期和治疗方案优化），最后为疗效监测（用于真正的个体化治疗）。该流程的起始检测项目敏感性高而特异性低，费用低廉，接下来的检测项目特异性提高，应用于纵向定量评定的潜力增加。依据患者现状（临床症状的有无），从不同节点（从金字塔底部到顶部）进入这一诊断流程。 药物开发中 AD 生物标志物的价值 采用相关的临床前模型，全面测定药动学与药效学之间相关性的过程将得以缩短，并且候选药物的选择和临 床剂量的确定将更为客观化。考虑到临床开发的费用问题、临床试验的长疗程 （相对于专利期） 以及受试者招募困难 （部分归因于在研药物的多重效应和患者维权意识的提高等） ，只有将无物种相关性的生物标志物作为转化性研究的核心要素，候选药物才有可能进入临床 （图 4 ） 。 无论是临床试验中的药理和毒理效应 评价，还是批准后增多的药效 和安全性评价，生物标志物均可基于表型或基因型，辅助实现患者分层和剂量优化。而且在试验招募中采取充实性策略 （即选取可能产生最大疗效或最小副作用的受试者） 还可缩短试验期限并改善反应速度。这方面最成功的例子是曲妥珠单抗 （ trastuzumab ，商品名赫赛汀， Genentech 公司） 治疗乳腺癌的 HER2/neu （也称 ERBB2 ） 试验 。进一步，生物标志物还可用于临床试验中患者个体的滴定用药，从而有效地实现治疗指标个体化。例如， Aβ 靶向药物对脑内无淀粉样斑块的患者不易起效，对于基线斑块生物标志物阳性的入组患者，低起始剂量可能也不显效，那么在接下来的剂量就需要增加了。 在 0 期药物试验发现生物标志物 针对临床诊断为 AD 的患者，目前的药效评价是根据其 AD 症状。虽然神经心理测试的改进可使 AD 诊断提前 （据推测） ，而未来有望在 AD 症状尚不明显时即予以确诊。正是在此阶段药物才可能产生更好的疗效，而非在脑内病变严重时才给予药物干预。这一点尤其重要，因为 AD 表现记忆丧失前已发生了长时间的病理生理变化，且难以通过临床诊断发现 。因此，在 AD 早期阶段有必要采用生物标志物 。 目前针对无症状期 AD 治疗药物的审批，尚无相应的监管制度。然而若要在疾病早期阶段能够开展疗效试验，适用于 AD 无症状阶段的新药能够批准上市，那么在 0 期临床试验 中应尽快采用潜在的生物标志物，以便为针对疾病早期进行的 Ⅰ - Ⅲ 期试验的设计提供数据 。早期病理生理相关生物标志物的应用，将使症状改善与治疗反应易于区分，新药标签批准和临床应用更趋合理 （价格亦然） 。标签内容可包括对缓解疾病作用的说明 （基于其对病理生理机制的修饰作用） 。相反，如果该药显示对治疗靶点有抑制作用，但并未影响下游生物标志物，那么就需重新考虑药物的归类及其作用靶点 （表 3 ） 。分子影像学生物标志物可提供 Aβ 斑块、 tau 蛋白和神经原纤维缠结的信息，且具有无创性和解剖特异性，因而具有特别的应用价值。 AD 生物标志物的临床应用 美国食品和药品管理局 （ FDA ） 和国立癌症研究院 已认定，在临床诊断方面 （并非作为替代终点） ，生物标志物具有极为重要的作用。通过生物标志物的应用，药物研发中可实现疗效量化 （基于人群均值和标准误分析） ，临床实践中可辅助诊断 （基于患者个体检测） 。而这两方面的需求正渐趋融合，其共同要素为纵向量化评定，即均需要对用药前后的疗效检测项目进行分析。作为诊断项目，生物标志物的应用对于医患双方具有同等的意义。举例来讲，基于国家肿瘤 PET 登记处的临床证据，医疗保险扩大了 FDG-PET/CT 的覆盖范围，其不仅可应用于诊断和分期，还扩展到随后的分型 （包括疗效的监测） 。并且，早期发现有助于实现早期干预，如能接受有效的个体化治疗，则患者预后良好且住院率降低。这些益处并非只存在于 AD ，但对 AD 尤其重要；因为在本病出现症状之前已具有显著的病理生理改变，但脑内病变组织难以获取，且需要对痴呆原因进行鉴别，进而识别症状的改善 （疾病缓解效应所致） 。一旦生物标志物被批准为 “ 具有应用资格 ” （监管指南中定义的术语） ，即可在临床试验设计中纳入针对患者个体进行剂量滴定的项目；而在临床试验中通过剂量调整将实现治疗结局的优化，最终的生物标志物数据将会为处方信息提供必要的资料 （表 3 ） 。因此，药物研发中适用于纵向疗效评定的生物标志物，将最有可能应用于个体化治疗。 生物标志物开发的经费来源 表 3 推荐生物标志物的临床研究与开发 生物标志物 纳入标准 （ 早期诊断 ） * 疾病分层 （ 预后诊断 ） * 疗效监测 （ 个体化治疗 ） * APOE 基因型 － ＋ － Aβ 42 ， Aβ 40 （血浆） ‡ － － － / ＋ Aβ 42 ， Aβ 40 （ CSF ） ＋＋ ＋ ＋＋ tau （ CSF ） ＋＋ ＋ ＋＋ p-tau （ CSF ） ＋＋ ＋ ＋＋ BACE1 （ CSF ） ＋ － / ＋ － / ＋ 结构性 MRI ＋＋ － ＋ 功能性 MRI － / ＋ － － / ＋ MRS － － － / ＋ FDG-PET ＋＋ － / ＋ － 淀粉样蛋白 -PET ＋＋ ＋＋ ＋＋ －：无法应用；－ / ＋：一定条件下应用，如血浆 β- 淀粉样蛋白 （ Aβ ） 测定应用于被动免疫疗法；＋：一般应用；＋＋：常规应用。以上内容源自近期召开的 阿尔茨海默病学会科研圆桌会议 。 APOE ：载脂蛋白 E ； BACE1 ： β- 位 APP 裂解酶 1 ； CSF ：脑脊液； FDG ： 18 氟 -2- 氟 - 脱氧 -D- 葡萄糖； MRI ：磁共振成像； MRS ：磁共振波谱； p-tau ：磷酸化 tau 蛋白； PET ：正电子发射断层扫描。 * 括号中内容为在临床实践中的潜在应用。 ‡ 血浆成分测定可能混杂血浆中的其他蛋白，可能难以准确反映病变状态。 不论是作为替代终点还是作为标准的生物标志物，生物标志物若要达到监管机构的评定要求，其研发经费和风险可能不允许企业单独投资，若代之以 协作体 或公私合作模式则又显复杂。针对这些经费、风险和复杂性等问题，在 FDA 、欧洲药品管理局 （ EMA ） 及其他监管机构将要发布的协调性指南中，有望对生物标志物的资格评定有较为实用的论述 （而显示疗效和安全性必备的纯粹统计学指标则很难达到） 。在这些指南中将会明确标明生物标志物的资格级别及其相应应用范围 （也就是说生物标志物有望批准应用） 。 不利因素 某种生物标志物需能够显示研发药物的疗效 （即将该候选药物作为阳性对照品） ，才有资格认定为针对疾病缓解效应的生物标志物。一旦具有相同作用机制的两种药物均存在疗效与生物标志物之间的相关性，那么就可以将这种生物标志物作为具有这种作用机制的药物的替代终点。而如果某种生物标志物与不同作用机制的药物疗效均相关，则可将其作为与作用机制无关的生物标志物。 虽然 0 期阶段会有多家公司开展合作 （如 ADNI 项目，见补充信息） ，而疗效评价试验本身所针对的是特定复合物。首家研发成功的公司可能会最早进入市场，但也将承担很多风险，这样其竞争者应用的生物标志物在资格评定方面就会有效地规避风险，从而减少开发经费、降低监管风险、加快上市速度。一旦第二家公司成功推行同样的生物标志物，就可能将其升级为替代终点，当然带来的效益归属于这家竞争者，最终有利于监管者和患者。 类似于儿科试验指南（ 《联邦食品、药品和化妆品法案》 505A 条儿科专卖权企业资质认定指南 ），有关专卖权规定可能会弥补上述不利因素；并且，针对生物标志物资格认定的监管指南的辅助作用更为直接，尤其是降低了特殊研究平台 （如在体影像学研究） 的复杂性。同时，生物标志物上市后可能会批准为替代终点指标，所以治疗和诊断项目合作开发的指南也将有所帮助。 透视生物标志物的监管应用 就监管方面的价值来讲，药物疗效和安全性的确定常规须经过至少 2 项独立的随机、双盲、安慰剂对照临床试验，且期限至少为 6 个月。进一步的要求为，疗效必须建立在一项认知域，以及一项功能域 （如日常生活能力） 或总体域 （如临床改善总体印象） 之上，且这两项终点指标均需具有显著差异。在对症治疗和疾病缓解治疗药物关键性的 Ⅲ 期试验中，均需要评定这两项主要结局指标。然而，鉴于 AD 的症状进展特征及其与药物作用机制的相关性，要认定某药具有疾病缓解效应，可能需要较长的研究周期，并需设计不同于评定症状改善的替代性试验 。 因此，应用针对疾病缓解药物的生物标志物，以及寻找合适的替代终点，是药物开发的利益相关者积极支持的项目 （如欧洲 EMA 发布 《药物开发新方法的资格评定》应用指南部分 、 《 疗效评定预见性的改善》脑部疾病部分 ，以及美国 FDA 发布的 关键路径项目 ） 。但是针对 AD 的治疗药物 （特别是具有疾病缓解作用的药物） ，在生物标志物应用于结局评定时，仍需考虑到其特殊的监管要求。 生物标志物作为替代性终点 虽然生物标志物在药物开发早期阶段的应用已经确立，但其在关键性疗效研究中的价值仍然有限。生物标志物如能起到临床相关性终点 （可直接反映患者的感受、功能或存活状态） 的作用，就可考虑将其作为替代性终点，继而有望用于特定疗法的疗效预测和评定 （框 2 ） 。然而，即使生物标志物水平与疾病分期 （未经治疗） 有极佳的相关性，也并不足以将其作为替代性的临床终点 。尚无任何的影像学或生化标志物有资格成为 AD 的替代性终点，因为生物标志物的药物诱发性变化应同时与预期的临床结局评定，以及疾病进程相关联 。另外，在某药理论上具有某种作用机制的基础上，还应有充分的证据 （如基于临床前模型） 证实其可延缓疾病进程。 框 2 替代性终点的资格评定 生物标志物作为替代性终点，在资格评定时应讨论以下方面的事项： l 基础科学问题与临床试验之间存在合理的相关性 l 替代性终点与临床结局之间是否存在强烈的、独立的、持续的相关性 （必要非充分） l 随机临床试验中替代性终点改善的证据是否持续导致目标结局的改善 l 治疗反应幅度较大，且精确而持久 l 其可能获益是否大于其潜在伤害及费用 所以，尽管目前生物标志物尚不能作为关键性疗效试验的主要结局指标 （即替代性终点） ，但仍可针对药物开发的其他方面提供决策依据。例如，在 Ⅱ 期研究 （如用于概念验证、剂量确定） 中生物标志物可作为预设的主要结局指标，或在疗效试验中可更有效地界定患者中的风险人群 （如充分纳入可能有疗效反应的人群，框 3 ） 。通过这种途径，生物标志物的应用将缩短 Ⅱ 期研究周期，并减少样本量；如潜在生物标志物可作为替代性终点，与传统上应用临床结局作为主要终点相比，决定性疗效试验的周期将更短，样本量将更少。 框 3 监管部门对临床试验中生物标志物应用潜力的意见 脑脊液标志物 （如磷酸化 tau 蛋白升高、 Aβ 1-42 降低） 是有助于体现 AD 特征的标志物，具有高度的敏感性和特异性；但在作为疾病状态标志物方面还需体现其价值。 脑影像学 （如内侧颞叶 MRI 扫描） 是有助于体现 AD 特征的标志物，能够充分发现 AD 高风险人群，而 MRI 系列扫描有助于成为疾病状态标志物。脑影像学还可作为剂量确定研究或概念验证研究的终点指标，作为关键性研究的次要终点。针对 Aβ 或局部葡萄糖 （ 18 氟 -2- 氟 - 脱氧 -D- 葡萄糖； FDG ） 代谢的 PET 也是有助于体现 AD 特征的标志物。 FDG-PET 的潜在应用为，在概念验证研究作为疾病状态标志物，以及在关键性研究中作为次要终点。 生物标志物作为替代性终点的问题和关注事项 如上所述，仅依据药物具有调节生物标志物水平的药理效应，并不能将此生物标志物认定为替代性终点，因为这需要合理的解释。比如，对 AD 有效某种疗法应能延缓内侧颞叶萎缩 （ MRI 测量） ，不过在疫苗 AN1792 试验中， Aβ 抗体增加的患者显示临床改善同时，脑萎缩程度似乎有所加重 。这是一个完全出乎意料的结局，说明针对疗效 （即便是潜在疗效） 所设定的生物标志物证据并无预测价值。 需给予更多关注的情况 （虽然是潜在性事件） 是，未验证的生物标志物可能会取得预期效应。如果对医疗产品的临床效应并未知晓，但仍依据生物标志物推测药物对患者具有有益的预期功效，并再将这一推论转变为具有有益的临床预期效应。即便这一推论是错误的，这一并无疗效的药物 （甚至可能有毒性反应） 仍可能会被批准。因此，在目前仅依据生物标志物的反应 （即将其作为替代性终点） ，批准某种 AD 药物是不可能的。然而，如文中其他部分所述，某些具有这些用途的生物标志物正接近于通过批准。一般原则下，如果某药依据临床结局可确定其疗效，且试验具有合理规模和周期，该药就可能被批准；但如果试验中将生物标志物指标作为主要结局，则将不会给予经费支持。也就是说，临床结局较生物标志物更为可取。在临床结局无法实际评价的情况下，可能会考虑采用生物标志物作为替代性终点；比如在验证预防 AD 效果的研究中，治疗启动后数年内临床结局 （如 AD 临床发病年龄） 可能都不会发生。 CSF 神经化学标志物针对 AD 具有高度的敏感性和特异性，可考虑作为辅助诊断项目；再以神经影像学工具 （如 MRI 或 Aβ-PET ） 作为补充，就可能用于 AD 人群中特定药物的疗效评定。全球性多中心的研究项目 （如 ADNI 开展的项目，通过预设数种神经化学和神经影像学生物标志物，实现跨地区、跨平台的标准化应用） ，应有助于上述生物标志物 （至少某些） 进一步的资格认定。 生物标志物的创新性开发 FDA 和 EMA 等监管机构已普遍将生物标志物确定为高度优先开发的项目，特别是在痴呆领域。为培育这一领域的创新性，诸如生物标志物联盟、关键路径项目、创新性医疗项目等合作项目 （均由不同的利益相关方参与） ，受到了热烈的欢迎和积极主动的支持。我们相信这种公私合作模式 （框 4 ） 将会激励新型生物标志物的探索与开发，并针对生物标志物的验证性要求达成进一步的共识。而 EMA 和 FDA 就监管实践进行协调性对话中将会支持上述项目，针对 AD 还会考虑借鉴其他领域 （如肿瘤、心血管病） 生物标志物的经验。因此，监管者鼓励不同利益相关方就生物标志物的开发尽早与监管机构合作，以实现监管要求与药物研究阶段更好地协调。 讨论与展望 学术机构、制药企业和监管部门已达成共识，生物标志物在临床试验中具有三方面的潜在应用。一是将生物标志物作为诊断工具，充实 AD 患者样本量，排除其他原因所致疑似 AD 的痴呆病例。但这可能会使新药的临床适应症在一般人群中受到限制。同时，如果具有疾病缓解效应的候选药物对疾病早期更具预期疗效，那么生物标志物将成为疾病早期发现的必备检查项目。 二是生物标志物用于发现和监测药物的生化效应，有助于药物开发。在药物对 AD 动物模型的效应转化为临床疗效的过程中，非影像学生物标志物的应用将会增加预测强度。动物模型中显示可减轻斑块负荷的 40 多种分子中 ，某些品种针对 AD 患者的治疗缺乏预测或临床效应。另外，在昂贵且耗时的大型 Ⅱ 期、 Ⅲ 期临床试验之前，采用生物标志物进行小型短期临床试验，就能够验证候选药物的疾病缓解效应。实际上，生物标志物已应用于 AD 患者的 Ⅱ 期、 Ⅲ 期临床试验，监管部门对此并无异议。不过在生物标志物作为 Ⅲ 期试验的替代性终点之前，应建立生物标志物药物诱发性变化与预期临床结局的关联性。 ADNI 等大型全球性多中心项目，将会支持这方面的验证和资格评定工作。 三是生物标志物应用于临床试验可尽早发现药物的特异性副作用。例如， Aβ 免疫疗法试验有发生脑炎 和血管源性水肿 的风险，但临床手段很难发现，而通过 MRI 和 CSF 分析则易于发现。另外，如果将 MRI 和 CSF 纵向测定作为临床试验的一部分，就能够提供明确的信息，认定该候选药物与这种类型的不良事件有无关联。 虽然已证实某些 MRI 、 PET 和 CSF 生物标志物可作为临床试验的诊断标志物，但仅有部分报道提示生物标志物可用于发现和监测神经变性过程中的药物疗效 ，且尚不具有替代性临床终点的资格。希望监管部门尽早参与到生物标志物开发过程中，这将使针对生物标志物资格认定的监管要求 更趋协调 ；而通过不同利益相关方加强协作，生物标志物联盟将会为 EMA 和 FDA 就监管实践进行的协调性对话营造气氛。 另一项挑战是尚无经认定具有疾病缓解效应的药物，从而应用于验证某种生物标志物是否与药物生化效应相关联，并由此预测临床结局。同时，药物若标注具有疾病缓解效应，必须具备影响疾病核心进程和神经病理特征的证据。这种双向依赖性使得 AD 药物开发和生物标志物研究陷入了类似于 “ 第 22 条军规 ” 的窘境。不过，正在进行的疾病缓解药物临床试验均将生物标志物作为终点指标。这些研究的汇总证据将会确定，生物标志物是否可作为某种复合物预期作用机制的有效概念验证工具，进而作为预测临床结局的替代性终点，成为药物宣称具有疾病缓解效应的依据。 框 4 公私 合作模式 如同科研工作需要多学科协作，生物标志物开发也需要各利益相关方之间的高度协作，才能将基础研究转化为临床决策。虽然个体组织内部可能实现科研成果的增长，但会受到该组织拥有的资源资本和智力资本的限制。并且，如果一家单位仅有能力投资于生物标志物 （针对某种病变或某个研究领域） 的开发，但没有 AD 诊断产品补充上市的话，那么就不可能获得其投资回报。与适销产品无关的生物标志物开发，不会是可行的和可持续的商业模式。 因此，通过联合投资和资源技术集中，才有望在这一领域取得显著进步；其回报就是可以共享成果 （如临床试验数据） ，从而 激 发市场和商品开发的竞争。为实现各自不同的目标，多个行业可通过战略联盟实现扩张，这方面有许多实例 ，生物标志物联盟就是例证。该团体由政府部门、学术机构、企业、患者维权人士和专业组织组成，为生物标志物开发架起了沟通桥梁。尚有几大类疾病仍是公共卫生关注的薄弱点，包括肿瘤、神经疾病、代谢紊乱及免疫和炎症性疾病。而 AD 神经影像学项目 （ ADNI ） 采用公私合作模式，在 5 年时间内对正常个体、 MCI 患者和 AD 患者进行追踪，其目标为借助于最先进的技术和平台描绘人脑的形态学改变，并建立与疾病进展的联系。类似项目在欧洲 （欧洲 AD 委员会 ADNI 项目） 、日本和德国 （痴呆能力网络项目） 均已启动。最终希望这些研究能够活跃医疗产品的开发，为患者带来更安全、有效、廉价的治疗方法。 注释： β- 淀粉样蛋白 （ Amyloid-β ， Aβ ） ：源自淀粉样前体蛋白的易聚集性多肽。其中有 42 个氨基酸的多肽亚型是 AD 斑块的主要成分。 tau 蛋白 ：位于神经元轴突的微管相关蛋白。高度磷酸化 tau 蛋白为 AD 神经原纤维缠结的主要成分。 《精神疾病诊断和统计手册》第 4 版 （ DSM- Ⅳ ） ：该手册概述了精神疾病的诊断标准，由美国精神病学会发布。 《国际疾病统计分类》第 10 版 （ ICD-10 ） ： 本书概述了人类疾病的诊断标准，由世界卫生组织发布。 美国国立神经病学、语言障碍和卒中研究所－阿尔茨海默病及相关疾病学会 （ NINCDS-ADRDA ） ： 两家组织联合发布了 AD 诊断标准。 主要终点： 指临床试验拟回答的一项主要问题。 生物标志物： 指生物学过程或发病过程客观指标，用于评价疾病风险或预后，以及指导临床诊断或监测治疗干预效应。 替代性终点： 临床试验中临床终点的替代指标。 次要终点： 只作为临床试验疗效特点的补充性终点，不足以完全显示其疗效特点或支持其疗效宣称。 纵向研究： 在较长期限内重复观察同一批患者的试验研究。 体模试验 （ phantom test ） ： 采用标准尺寸和密度的塑料圆筒对磁共振成像设备进行校正。 转换图 （ transformation map ） ：描述空间扭曲的空间延伸性向量场，用于将脑部三维影像重排为通用的标准空间。 典型斑块： 指具有典型淀粉样特征的 β- 淀粉样蛋白致密聚集体，由肿胀的神经炎症细胞和反应性神经胶质细胞包绕。 弥散斑块： 只能通过免疫组化方法检测到的 β- 淀粉样蛋白聚集体。 AN1792 疫苗试验： 第一项 Aβ 主动免疫疗法治疗 AD 临床试验。 亨廷顿协议： 对有亨廷顿病家族史的个体可提供遗传咨询 （包括症状前 DNA 检测预测发病可能性） 。若获得申请，该个体要通过一系列细致的咨询，确保其理解与其遗传状态相关的事项。 TOMM40 ：位于第 19 对染色体、编码线粒体蛋白的基因，邻近载脂蛋白 E 基因。 风险预测图： 描述随年龄变化 AD 发病风险的图表。危险程度经过遗传状态的校正 （特别是载脂蛋白 E 基因型状态） 。其他基因对该图表的影响较小 （ APP 和早老蛋白突变家族除外） 。 0 期试验： 首次进行的探索性人体试验，采用单一的亚治疗剂量，仅纳入少量受试者，可提供药物药动学和药效学的初始信息。 参考文献 1. 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Psychiatry 61, 95–102 (2004). 附表 阿尔茨海默病的影像学生物标志物 生物标志物 检测方法 横断面研究 多中心稳定性 AD 相关变化 阶段评估 评价 海马体积 目测 与海马实际体积有高度相关性 （ R 2 约为 0.9 ） ，与对照组相比， AD 诊断准确度为 80%-90% ）， 尚未评估其对 MCI 转化为 AD 的预测价值 多中心研究已经开展，但多中心稳定性尚未系统评价 纵向变化的准确度仅处于机会水平 尚需经过多中心的系统分析 适用于基线诊断评估 ，不适用于追踪随访 手工测定 重测信度较高 ，与对照组相比， AD 诊断准确度为 80%-90% ，预测 MCI 转化为 AD 的准确度为 70%-80% 横断面研究的多中心变异度在 5% 以下，低于纵向研究数据 年萎缩率在 AD 患者和健康对照者分别为 3%-7% 和 0.9%-1.4% 已作为临床试验的次要终点 目前最完善的影像学生物标志物；尚需评估纵向研究的多中心变异度 自动测定 与手工测定有高度相关性 （ R 2 0.8 ） 。 AD 与对照者间群体辨别力为 83% ， MCI 与对照者间为 73% （仅为 事后检验概率 ） 未见评估 检测方法已经建立，并应用于小样本研究，预测非痴呆老人随后认知衰退的准确度约为 80% 目前仅小型单中心研究 该方法仍需主要检测人员输入，且尚需大样本的单中心和多中心研究的评估 内嗅皮层 （ ERC ） 手工测定 对有 AD 表现的患者并无额外益处。预测 MCI 转化为 AD 的准确度，与海马体积测定相比有小幅升高 未见评估 AD 患者 ERC 萎缩速度 5 倍于对照者 目前仅小型单中心研究 考虑到繁重的检测方法，随机对照试验中海马体积测定可能并无额外价值 全脑体积 自动测定 主要应用于纵向评定 多中心研究已经开展，但多中心稳定性尚未系统评价 年萎缩率在 AD 患者和健康对照者分别为 2.5% 和 0.4%-0.9% 已用于多中心临床试验 脑整体特性测定的启发价值有限 局部灰质 基于体素的形态测量 AD 和 MCI 有一致的脑萎缩模式，但尚未建立起统计模型以确定单独个体的发病风险 横断面研究的多中心稳定性在 5% 以下 ，纵向研究数据尚未评估 随后转化为 AD 的 MCI 患者局部灰质萎缩速度加快 ，尚未建立发病风险的统计模型 临床试验背景下的试验性标志物 尚需建立个体发病风险预测的统计模型 基于形变的形态测量 AD 和 MCI 有一致的脑萎缩模式，预测个体发病风险的统计模型提示，预测 MCI 转化为 AD 的准确度为 80% ，辨别 MCI 和对照者准确率为 90% 未见评估 AD 患者脑萎缩会扩展至全脑 ；尚无个体的效应值以解释临床试验结果 试验性标志物 评估全脑变化具有高度的空间分辨率，故有应用前景；尚需大样本的单中心和多中心的深入研究 皮层厚度 基于皮层曲率的自动测定 辨别 AD 和对照者的准确率为 90% 未见评估 AD 皮层年萎缩率平均为 0.18mm 试验性标志物 可直接测定效应值，且数值表达的意义充分，有望作为临床试验终点 基底前脑 萎缩 无名质厚度和信号强度测定 AD 与对照者间有显著差异 ，且与胆碱能治疗反应相关 未见评估 未见评估 试验性标志物 有应用前景的预测胆碱能系统整合性的标志物，尚需临床病理研究的深入验证 BOLD 信号 fMRI 前后比较 同一受试者不同成像期间的 fMRI 数据具有高度可靠性 总变异度中扫描仪差异不足 10% 。纵向研究和多中心研究中已采用质量控制规程 胆碱能治疗对 AD 注意网络可见特异性的局部激活效应 。面孔识别任务中，胆碱能治疗可致时间依赖性海马激活改变 小型单中心研究的试验性标志物 由于其广泛的应用，可望作为次要终点。首次 fMRI 多中心研究为阳性结果，显示其有应用前景 MRS 单体素质子波谱分析、波谱成像 （ 化学位移成像 ） AD 患者和随后进展为痴呆的 MCI 患者可见海马 NAA 减少 采用不同类型扫描仪的 5 家单位检测 NAA 变异度低于 5% 胆碱酯酶抑制剂治疗 AD 可见 NAA 增加。 NAA 相关的治疗反应和初始 NAA 低值可预测阳性治疗结局 。 用于临床试验背景下单中心研究的评估 MRS 标志物可为结构 MRI 和 fMRI 提供补充信息 FDG-PET 感兴趣区 （ ROI ） 分析和体素分析 局部测定值有良好的重现性，变异系数绝对值约为 16.5% 多中心变异度较高 AD 患者联合皮层代谢率 3 年间降低 16%-19% ，而正常对照者未见降低。吡拉西坦和胆碱能治疗 AD 可影响皮层代谢 。 用于临床试验背景下单中心研究的评估 作为多中心研究的标志物，潜在具有极为稳定和有效的特点，但受其费用和实用性的限制 淀粉样蛋白 -PET PIB 活体人脑内探测淀粉样斑块和淀粉样血管病变具有高度特异性 未见评估 AD 进展过程中 11 C-PIB 摄取未进一步增加 试验性标志物 引人关注的潜在诊断标志物，尚需对 PIB 阳性的健康受试者和 MCI 患者进行深入的跟踪研究，尚不明确是否可作为替代性终点 胆碱能系统 -PET 胆碱酯酶标志物 目前应用的所有胆碱酯酶抑制剂在标准临床剂量下，可使脑 AChE 活性降低 30%-40% 未见评估 乙酰胆碱酯酶抑制程度与 AD 认知改善程度相关 试验性标志物 引人关注的潜在生物标志物，用于确定新型复合物的作用方式 附表参考文献（详见附件） 透视阿尔茨海默病生物标志物的研究、产业化和监管（Biomarkers for Alzheimer's.pdf
据最新的一篇研究结果和相关的分析显示，在尿液中可能更容易找到生物标志物。 生物标志物的研究没有像很多人预想的那样取得很多成果。有可能是我们找错地方了吗？血液流经全身各组织器官，理论上可以收集各器官的标志物信息，最常用于寻找标志物。然而，标志物的本质是变化，由于血液属于内环境的一部分，受机体稳态的调节，引入到血液中的变化更倾向于被消除。而尿液是血液通过肾脏而形成的，用于排泄机体的废物。它没有稳态的调节，可以不断累积机体排出的变化，是能容纳更多变化的场所，可能更适合寻找标志物。 在这个研究中，作者利用抗凝剂干扰大鼠的凝血状态，将变化直接引入到血中，并采用相同的方式分析干预前后血液及尿液中的蛋白质谱，发现在尿液中能见到更多的变化蛋白，并且一些变化的蛋白与凝血功能相关。说明了尿液是比血液更好的生物标志物来源。国际上以前也有一些同时在血液和尿液中做的标志物研究，有些也发现了标志物在尿液里表现的变化更显著，但是都没有分析标志物的本质是变化，也没有提出稳态的机制可能是这个现象发生的根本原因。 全世界已经做过的标志物研究中，远超百分之九十几都是在血液里寻找。如果有了这个理论的指导，能把这些经费和精力的一部分投入到尿液生物标志物的研究，一个新的尿液生物标志物的时代很快就会到来。 更多详情请见 SCIENCE CHINA Life Sciences （《中国科学 生命科学》英文版）2014 年第（7）期封面文章： Changes of proteins induced by anticoagulants can be more sensitively detected in urine than in plasma LI MengLin, ZHAO MinDi, GAO YouHe*
正式发表的版本 EHp.PDF 生物标志物/生物监测与环境健康研究 生物监测是指定期有计划检测和评价人体接触化学物质的负荷水平以及可能的健康影响。它强调检测的系统性和连续性，不是单纯的一次对生物材料的测定，是贯穿于检测-干预-评价的系列活动。由于生物监测可直接测定人体内化学物的水平，因此可反映从各种途径摄入体内的化学物的总量，在环境与健康的暴露评价中占有十分重要的地位。 美国全国科学理事会将生物标志物描述为反映生物系统或样本中所发生事件的指标，并将其视为研究接触外源化学物与健康损害之间关系的工具。经过验证的生物标志物应用于职业与环境卫生的生物监测和危险度评价。美国德克萨斯州大学公共卫生学院教授、国际暴露分析学会前主席Ken Sexton博士指出：对人体生物材料中化学物的测定，是评价暴露污染物水平的金标准 。 我国的生物监测工作始于上世纪50年代初，应用简单的定性方法测定接触铅作业工人的尿中粪卟啉，用于铅中毒的辅助诊断，弥补当时没有血铅和尿铅测定的不足，作为铅中毒诊断的辅助指标。50年代后期开始了尿铅的测定，为铅中毒诊断服务。60年代中期，开始了对苯作业工人进行尿酚的测定，为生物监测的雏形，研究发现尿酚仅可以反映苯暴露程度，但是不能应用于苯中毒诊断。对碳氧血红蛋白的研究发现，这个指标可以作为一氧化碳中毒急性期病人的诊断的证据，也可作为接触一氧化碳的生物监测指标。1977年WHO组织了全球生物监测研究规划，中国预防医学科学院环境卫生与卫生工程研究所参加了此项研究。监测了铅、镉和有机氯化合物，选择的生物材料是血、乳汁等。并依据国际通行的规范进行生物监测中质量保证与控制，报告了我国城市居民血铅水平和血镉水平 。在职业卫生领域，我国学者对职业性接触铅、汞、镉、有机磷农药、三硝基甲苯和甲苯等多种职业人群开展生物监测研究工作。研究了生物材料的采集、处理和分析方法，制定了质量控制方法。对血、尿、呼出气等多种生物材料应用于生物监测的可行性进行了研究，并探讨了应用于人群健康监护和职业病辅助诊断的作用。在吸收国外经验的基础上，结合我国的生物监测研究成果，提出生物组织中毒物或其代谢产物的最高耐受界限值。1999年推荐职业接触甲苯、铅、镉、三氯乙烯和有机磷酸酯农药6种生物监测指标和生物接触限值；2004年颁布了职业接触二硫化碳、氟、苯乙烯、三硝基甲苯和正己烷5个限值；2006年颁布了职业接触五氯酚、铬、汞和酚4个生物接触限值标准。目前我国共颁布了15个生物接触现值标准。其中，除引进和参考国外标准外，也不乏通过我国学者自主研究而制定的现值标准。2009年，在 “十一五”科技支撑项目和卫生公益性行业科研专项的支持下，在8个省市开展人群中重要环境化学物负荷水平研究，该调查采集了18000多名6~60岁一般人群的生物样本，报告了我国一般人群中重金属、农药、有机物等共60种化学物的负荷水平，提出了现阶段我国人群中化学物负荷水平的基础性数据 。 分析检测技术的进步为生物监测提供了发展的机遇。GC-MS、LC-MS/MS、ICP-MS以及NMR光谱等高分辨高灵敏的分析技术的普及和应用，它们具有可同时进行定性和定量分析对多种物质，在检测生物材料中多种化学物质和生物大分子的优势，为职业卫生和环境卫生研究提供了新的手段。 基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及表观遗传学研究的迅猛发展，使得我们可以在DNA、RNA、蛋白大分子、代谢小分子、DNA甲基化，以及其它表观遗传水平上筛选多个与环境暴露以及疾病相关的生物标志物，为生物监测的发展提供了前所未有的手段。例如人类基因组计划使得检测数以千计的基因变异成为可能，可筛选疾病相关的易感性标志物。随之启动的环境基因组计划在探索环境基因交互作用致疾病的方面做出诸多的探索。在这些研究中，常用的检测指标是单核苷酸多态性（SNP）和基因拷贝数变异（CNV）。SNP作为疾病易感性标志物，经历了早期的候选基因研究策略到目前的全基因组关联研究过程，发现了大量与慢性病相关的易感性标志物。但是,人群研究发现这些标志物的效应都比较弱，OR值多在1.2~1.5之间。由此也引发了研究中忽视多基因相互作用以及环境因素作用的讨论 。目前多数GWAS的研究中，除涉及对吸烟和饮酒两个因素外，对饮食、生活和职业环境因素大都没有进行定量分析和测定。由于职业和特殊环境人群暴露具有明确和可以测量的特点，在有针对性地研究易感性标志物更有其独特的优势。在对接触苯 、PAHs 、三氯乙烯 暴露工人中展开的探索工作成效显著。 生物监测生物样本中环境化学物质是评价的暴露水平直接证据，在研究环境与健康（疾病）关系中起关键枢纽作用。在制定和修改卫生标准，甄别和保护高危人群发挥重要作用。在流行病研究中，一般可以获得外环境暴露-疾病（反映）资料。如若有相应的反映内暴露和早期效应的生物监测数据，并进行综合分析，则有可能获得外暴露-内暴露剂量-不同阶段健康效应-疾病的系列证据，这些结合了人体生物材料中化学物定性与定量的测定数据和相关效应的研究结果，在解释环境与疾病的关系、提供预防干预策略具有重要意义。由于技术手段的限制，目前还鲜见这类在同一人群中多层次生物标志物的系统研究。 大样本的生物监测样本研究可以获得稳定人群统计学数据，受偶然因素影响较小且代表性强。美国疾病预防控制中心的生物监测实验室 应用 美国全国健康和营养调查项目采集的血和尿样本，对目标物水平进行分析测定，综合了6000多名美国一般人群血和尿中化学物的基础数据，发布《人体暴露环境化学物国家报告》，该报告迄今已经发布4版 。 实践表明，这些资料对评价人群体内化学物的种类和负荷水平、建立生物接触限值，为临床医生和公共卫生医师用于判断某个个体或者群体是否存在异常的暴露，并进一步寻找暴露来源，以及确定高危险人群有重要意义。长期的系列生物监测研究，可获得人群污染负荷的动态变化趋势，与历史数据相比较，或者作为参照与未来的数据比较，评价针对特定化学物的控制效果。 除了事故暴露外，多数情况下人体暴露于多种污染物，表现为多种化学物质的低浓度混合暴露的弱效应。很多的生物监测和暴露生物标志物研究中，一般仅对几个化学物质进行测定，会产生以偏概全的错误。因此，迫切需要引用暴露组的理念指导生物监测研究。即在对生物样本中的化学物进行特征谱的全面分析之后，结合定量测定的结果、健康效应和毒理学信息，选择有代表性的指标进一步验证和研究。此外，还需要关注终身暴露情况以及生命关键时期的监测 。 涉及生物监测和生物标志物的人群观察研究设计必须考虑其本身的生物学特性。例如，转录组、蛋白组、代谢组以及表观遗传标志物都存在器官组织特异性,并且随暴露时间和疾病进程的发生动态变化。因此，对这类指标，在收集样本的种类和采样时机的要求十分严格，需要控制若干可能的混杂因素，目前广泛使用的病例-对照研究设计不具有优势。而以对特殊暴露人群的随访研究设计更适合这类指标的研究，尤其是可以动态连续观察其变化规律。基因分型指标由于不受组织类型、暴露环境和疾病过程的影响，广泛适用于横断面研究、回顾性病例-对照研究和队列研究。 生物监测和生物标志物在环境健康领域的应用还面临着诸多挑战，首先是在理论上仍需要有重大突破，尤其是在暴露谱和暴露指纹谱与环境和健康结局的相关方面；其次，对微量样本的高通量超痕量的定性和定量检测分析技术以及大数据分析软件需要进一步提高和改善，以满足研发的需求。最后，研究成果的应用转化也亟待加强，加快研究成果的转化和应用方面还有很多工作要做。 环境与健康问题正在成为公众和政府关注的热点，研究环境污染与疾病的关系以及对健康影响的规律是公共卫生领域的重要课题。生物监测技术的进步，为认识和研究环境与健康的关系提供了前所未有的契机。随着对人群生物监测和暴露评价的重要性的认识的深刻，这一领域的发展将迎来新的机遇。 参考文献 Ken Sexton, Larry L. Needham and James L. Pirkle.Human Biomonitoring of Environmental Chemicals. American Scientist, 2004 92(1)38-45 沈惠麒、顾祖维、吴宜群 《生物监测和生物标志物的理论基础及应用》 北京大学医学出版社 2006 闫慧芳，朱宝立，黄汉林，邵华，宋新魁，余善法，彭珊茁，张云江，李建国，姬红蓉，张晓曦，张龙连，郑玉新。 中国一般人群血尿重金属和有机溶剂负荷水平调查方法和实验室质量控制。 中华预防医学杂志，2014,48（2）：147-150. Vlaanderen J,Moore LE, Smith MT, Lan Q, Zhang L, Skibola CF, RothmanN, Vermeulen R. Application of OMICS technologies in occupational and environmentalhealth research; current status and projections. Occup EnvironMed. 2010 Feb;67(2):136-43 Lan Q, ZhangL, Li G, Vermeulen R, Weinberg RS, Dosemeci M, RappaportSM, Shen M, Alter BP, Wu Y, Kopp W, Waidyanatha S, Rabkin C, Guo W, Chanock S,Hayes RB, Linet M, Kim S, Yin S, Rothman N, Smith MT. Hematotoxicity in workers exposed to low levels of benzene. Science. 2004Dec 3;306(5702):1774-6. Yang X, Zheng J, Bai Y, Tian F, Yuan J , Sun J,Liang H, Guo L, Tan H, Chen W, Tanguay Wu T. UsingLymphocyte and Plasma Hsp70 as Biomarkers for Assessing Coke Oven Exposureamong Steel Workers Environ Health Perspect. 2007November; 115(11): 1573–1577. Li H, Dai Y, Huang H, Li L, Leng S, Cheng J, Niu Y,Duan H, Liu Q, Zhang X, Huang X, Xie J, Feng Z, Wang J, He J, Zheng Y. HLA-B*1301as a Biomarker for Genetic Susceptibility to Hypersensitive Dermatitis Inducedby Trichloroethylene among Workers in China. Environmental Health Perspectives.2007; 115(11):1553-6. U.S. Centers for Disease Control and Prevention.Fourth national report on human exposure to environment chemicals . .http://www.cdc.gov/exposurereport/pdf/FourthReport_UpdatedTables_Sep2013.pdf Rappaport SM. Biomarkers intersect with theexposome. Biomarkers. 2012 ;17 (6):483-9 EHP中文版2014-2社论
近期，有个标题为 “清华教授发现全新肿瘤标志物 研发试剂可测癌症”的新闻很火，科学网有多篇相关评论博文，其中至少有两篇还被编辑置顶推荐。我本打算对该新闻不做任何评论，无奈如鲠在喉，不吐不快，只好写此博文，谈谈自己的粗浅看法。 从中新社的 这篇新闻的报道来看，清华罗永章教授的这个成果至少有三个亮点： 1) “在国际上首次发现Hsp90α(热休克蛋白90α)为一个全新的肿瘤标志物“;2) “ 患者只需取一滴血液，通过试剂盒检测，即可用于病情监测和治疗效果的评价，为指导肿瘤个体化治疗提供辅助依据”；3）“自主研发的Hsp90α定量检测试剂盒已通过临床试验验证，获得了国家第三类(最高类别)医疗器械证书，并通过了欧盟认证，从此获准进入中国和欧盟市场“。如果都是真的，这个成果确实称得上是重大成果，尤其是能进入欧盟市场很不容易。本文先简单分析一下这三个亮点是否属实，或者准确。 首先看 罗教授是否是 在 “ 国际上首次发现 Hsp90α 为一个全新的肿瘤标志物 ” 。 Hsp90 (heatshock protein 90) ，是一类分子伴侣蛋白，是 热休克蛋白家族中的一类， 90 是指其分子量为 90 kDa, Hsp90α 是其中的一个亚型，这类蛋白的主要功能是辅助其它蛋白正确折叠，在蛋白质遇热时能稳定蛋白，这也是该类蛋白名称的由来， Hsp90 可以帮助蛋白降解，还可以稳定一些肿瘤生长所需的蛋白，因此，抑制 Hsp90 ，就可以这些肿瘤生长所需的蛋白，从而达到抗癌的作用，这也是 Hsp90 抑制剂抗癌作用的大致机理。目前，至少有几十个正在进行或已经结束的临床试验来检验 Hsp90 的多种抑制剂抗癌疗效，一个 III 期临床试验已经结束，该试验药物有望不久被美国 FDA 批准上市。在这些药试验过程中，检测 Hsp90α 是证明其 抑制剂的有效方法，因此，至少在 10 多年前， Hsp90α 作为一种潜在的肿瘤生物标志物就有报道，检测 Hsp90α 的试剂盒也早就应用于临床前的动物试验。而罗教授在 2009 年才开始第一篇有关 Hsp90α 的论文，因此，目前没有任何证据表明罗教授在 “ 国际上首次发现 Hsp90α 为一个全新的肿瘤标志物 ” ，简单文献检索表明： 在国际有影响的期刊上，已经有多篇有关 Hsp90α 是肿瘤标志物的综述文献，作者都不是 罗教授，显示他在这个领域既不是首创者，也很可能不是最有影响的学者 。 该成果的另一亮点是“滴血 验癌”， 患者只需取一滴血液就可搞定。这个其实并没有什么神奇，能做到只需一滴血，主要原因有两点：第一点：试验方法灵敏度高，尽管该报道并没有具体报道该试剂盒的作用原理，但是几乎可以肯定是基于 ELISA技术（即： 酶联免疫吸附），相信搞生物的网友大多对该技术不陌生， ELISA技术基于结合强度和特异性很高的抗原-抗体反应，即使是很少量的抗原，也可以通过该技术检测出来。第二点：Hsp90α的含量高，Hsp90在没有受到热压力的细胞中，占蛋白总量的高达1-2%，而当细胞受热时，该数字更可以升至4-6%。因此，就技术本身而言，ELISA技术作为一种成熟而广泛应用的技术，可以说本身没有多大的难度，目前，应用于非临床试验研究的检测Hsp90α的试剂盒，国际上有不少公司生产出售。 所以罗教授的成果的亮点就剩一个了，即通过了临床试验验证。该检测方法能在中国获得CFDA的批准，似乎并不能证明罗教授的技术比国外同行的更胜一筹，因为中国的临床试验，一直为国内、国际同行所诟病，其靠谱程度，估计在医院工作的网友更清楚。如果该技术在欧洲通过临床验证，并被欧盟EMA批注，上述的怀疑那简直就是污蔑了。然而，无论是EMA官方网站还是google网上检索，都没有发现罗教授的这个技术“通过了欧盟认证”、“获准进入中国和欧盟市场”。如果有网友发现相关报道或其它证据证明该检测技术已被欧盟认证，欢迎留言、评论。本文无意贬低罗教授的成果，只是觉得任何成果都不应该被过度评价和放大，而应该实事求是的评价。 下面就谈谈自己所粗略了解的美国 FDA 批准的现在用于临床的蛋白肿瘤标志物。肿瘤标志物是生物标志物的一类，由于肿瘤 / 癌症的研究最为广泛、深入，临床需求也最大等多种原因，肿瘤标志物是生物标志物的研究最多的。生物标志物的定义多种多样，最为权威的大概要数 NIH 在 1998 年的定义： a characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biologic processes, pathogenic processes, or pharmacologic responses to a therapeutic intervention. 生物标志物根据其检测目的和功用，可至少分为如下10类（恕不能 一一翻译）。从报道看，罗教授的检测 Hsp90α试剂盒貌似属于p rognostic biomarkers( 预后生物标志物 ) Translation biomarkers are used in both a preclinical (i.e. animal models) and clinical setting Early detection biomarkers are used to identify the earliest stages of disease onset Diagnostic biomarkers are used to identify the presence or absence of a specificdisease state Staging biomarkers are used to distinguish between different stages of a chronic disorder Prognostic biomarkers are used to determine patient survival probability Disease biomarkers are related to a clinical outcome or measure of disease Predictive or efficacy biomarkers are used to predict the efficacy of a specific drug therapy Target biomarkers are used to determine the interaction of a drug or small molecule with its target Mechanism biomarkers are used to report on the downstream effects of a drug Toxicity biomarkers are used to determine the toxicological effects of drugs on an in vitro or in vivo system Surrogate biomarkers are regarded as valid substitutes for measuring clinical outcomes 生物标志物可以是蛋白质，也可以是 DNA, RNA 等，下面主要谈谈蛋白类生物标志物。迄今为止，被美国 FDA 批准的现在用于临床的蛋白肿瘤标志物只有 23 种 / 类（参见下表，个别方法含有多种蛋白标志物）。而在 Pubmed 上文献检索显示，用 “biomarker” （生物标志物）做关键词，有 63 万篇文献，改用 “cancer biomarker” （肿瘤生物标志物）则还有 23 万篇，即使该用 “lung cancer biomarker” （肺癌生物标志物，罗教授的试剂盒就是用于肺癌的），仍有 1.8 万篇。这和只有区区 23 种临床应用的蛋白肿瘤标志物有很大反差，23万 VS. 23，正好相当于发表一万篇 肿瘤生物标志物论文才有一种肿瘤标志物成功应用于临床，真正地“一将成名万骨枯”！ 这充分显示出生物标志物应用于临床并不是一件容易的事，尤其是在监管严格的美国，事实上，最近10年，平均1.5年才有一种新的肿瘤蛋白标志物检测技术被美国FDA批准。值得注意的是，这些蛋白肿瘤标志物绝大多数都是基于免疫反应来检测的 ( 包括 ELISA, 免疫组化 ) ，但是这些标志物在被发现过程中，有些是采用基于质谱技术的蛋白质组学来最先确定的，比如同时检测 5 中肿瘤标志物的 OVA1 技术 ( 表中第三种， FDA2009 年批准 ) ，用于 卵巢 癌早期诊断，就是最初是采用 SELDI 质谱技术鉴定了， 7 种蛋白标志物，后来通过优化，采用了 5 种蛋白，并且由于多种原因，最终采用了 ELISA 技术。目前限制质谱技术在临床应用的原因有多种，如 : 1) 样品前处理时间过长，无法实现高通量； 2 ）仪器本身价格昂贵且样品分析时间过长； 3 ）重现性不够高； 4 ）技术本身和仪器使用难度较大，最终数据解释不易等。 美国 FDA 批准的现在用于临床的蛋白肿瘤标志物 生物标志物 临床应用 肿瘤类型 组织来源 方法 申请类型 批准年份 器械类别 产品代码 Pro2PSA Discriminating cancer from benign disease Prostate Serum Immunoassay PMA 2012 3 OYA ROMA (HE4+CA-125) Prediction of malignancy Ovarian Serum Immunoassay 510(k) 2011 2 ONX OVA1 (multiple proteins) Prediction of malignancy Ovarian Serum Immunoassay 510(k) 2009 2 ONX HE4 Monitoring recurrence or progression of disease Ovarian Serum Immunoassay 510(k) 2008 2 OIU Fibrin/ fibrinogen degradation product (DR-70) Monitoring progression of disease Colorectal Serum Immunoassay 510(k) 2008 2 NTY AFP-L3% Risk assessment for development of disease Hepatocellular Serum HPLC, microfluidic capillary electrophoresis 510(k) 2005 2 NSF Circulating Tumor Cells (EpCAM, CD45, cytokeratins 8, 18+, 19+) Prediction of cancer progression and survival Breast Whole blood Immunomagnetic capture/ immune-fluorescence 510(k) 2005 2 NQI p63 protein Aid in differential diagnosis Prostate FFPE tissue Immunohistochemistry 510(k) 2005 1 NTR c-Kit Detection of tumors, aid in selection of patients Gastrointestinal stromal tumors FFPE tissue Immunohistochemistry PMA 2004 3 NKF CA19-9 Monitoring disease status Pancreatic Serum, plasma Immunoassay 510(k) 2002 2 NIG Estrogen receptor (ER) Prognosis, response to therapy Breast FFPE tissue Immunohistochemistry 510(k) 1999 2 MYA Progesterone receptor (PR) Prognosis, response to therapy Breast FFPE tissue Immunohistochemistry 510(k) 1999 2 MXZ HER-2/neu Assessment for therapy Breast FFPE tissue Immunohistochemistry PMA 1998 3 MVC CA-125 Monitoring disease progression, response to therapy Ovarian Serum, plasma Immunoassay 510(k) 1997 2 LTK CA15-3 Monitoring disease response to therapy Breast Serum, plasma Immunoassay 510(k) 1997 2 MOI CA27.29 Monitoring disease response to therapy Breast Serum Immunoassay 510(k) 1997 2 MOI Free PSA Discriminating cancer from benign disease Prostate Serum Immunoassay PMA 1997 3 MTG Thyroglobulin Aid in monitoring Thyroid Serum, plasma Immunoassay 510(k) 1997 2 MSW Nuclear Mitotic Apparatus protein (NuMA, NMP22) Diagnosis and monitoring of disease (professional and home use) Bladder Urine Lateral flow immunoassay PMA 1996 3 NAH Alpha-fetoprotein (AFP) b Management of cancer Testicular Serum, plasma, amniotic fluid b Immunoassay PMA 1992 3 LOK Total PSA Prostate cancer diagnosis and monitoring Prostate Serum Immunoassay PMA 1986 2 LTJ, MTF Carcino-embryonic antigen Aid in management and prognosis Not specified Serum, plasma Immunoassay 510(k) 1985 2 DHX Human hemoglobin (fecal occult blood) Detection of fecal occult blood (home use) Colorectal Feces Lateral flow immunoassay 510(k) – CLIA waived 1976 2 KHE 注：表中数据来自文献2. 上述中新网的报道还提到，罗教授的 Hsp90α 检测 试剂盒 “ 获得了国家第三类 ( 最高类别 ) 医疗器械证书 ” 。生物标志物的临床检测使用是按照医疗器械来审批的，中国和欧美类似，医疗器械的审批都分为三类，第三类确实是最高类别，但是这个不是根据技术先进程度或者难度来衡量，而主要是根据医疗器械的用途和当医疗器械提供不正确结果（即假阳性、假阴性）时对病人所带来的风险。美国的医疗器械的临床使用申请主要分为两类 :PMA(premarket approval application) 和 510(k), 由于自己对这两种申请途径不熟悉，不敢妄言，感兴趣的网友可以参见文末英文文献，该文献有较详细的介绍 。 主要参考资料（本文参考了不少资料，未能一一列出） 1. 清华教授发现全新肿瘤标志物 研发试剂可测癌症 , http://news.sciencenet.cn/htmlnews/2013/11/285143.shtm 2. Füzéry, Anna K., et al.Translation of proteomic biomarkers into FDA approved cancer diagnostics:issues and challenges. Clinical proteomics 10.1 (2013): 1-14.
Chen Zhonghong, et al. Distribution of sterane maturity parameters in a lacustrine basin and their control factors: A case study from the Dongying Sag, East China. Pet.Sci.(2011)8:290-301 Abstract: Fifty samples from the source rocks in Member 3 and Member 4 of the Paleogene Shahejie Formation in the Bohai Bay Basin, East China, were analyzed to investigate the distribution, evolution of the molecular maturity ratios C29ββ/(ββ+αα) and C2920S/(20S+20R) and their control factors in the natural geological profile and sequence. The results showed that progressive changes in molecular maturity parameters are associated with major changes in thermal evolution of related biomarkers. Increases in the C29ββ/(ββ+αα) and C2920S/(20S+20R) ratios result from the difference in the relative rate between generation and thermal degradation of isomers involved. The samples from a hyper-saline environment below 3.5 km in which evaporitic rocks deposited shows high response of Sr/Ba, Sr/Ca, Fe/Mn, Pr/n-C17, Ph/n-C18 and gammacerane and low response of Pr/Ph. There presents negative reversal of biomarker maturity C29ββ/(ββ+αα), C2920S/(20S+20R) and Ts/(Ts+Tm) in the samples from hypersaline environment, refl ecting that the gypsum- halite have negative effect on the isomerization of biomarker and thermal evolution of organic matter. The minerals in evaporites also retard the conventional thermal indicators including vitrinite refl ectance (Ro) and pyrolysis peak temperature Tmax at the depth below 3.4 km (i.e. 3.4 km), and these parameters also show the inhibition from overpressure in the range of 2.4-3.4 km. This result will be helpful in the interpretation and application of molecular maturity parameters for similar saline lacustrine basins. Key words: C29 24-ethyl cholestane, biomarker, thermal maturity parameters, saline basins, Dongying Sag
陈中红 , 等。东营凹陷古近系升藿烷生物标志物参数分布及演变规律。沉积学报， 2011, 29(1):173-183 摘要：为研究实际地质体或地质剖面中的 C31 到 C3517α( H) ， 21β( H) 升藿烷生物标志物构型转化参数 22S /( 22S +22R) 及升藿烷指数 C35 /Σ( C31—C35) 等的分布、演化特征，对东营凹陷主要烃源岩层系古近系沙河街组三段 ( 淡水 — 微咸水层系 ) 和沙河街组四段 ( 咸水层系 ) 的系列样品进行了研究，分析样品来源于 1 300 ～ 4 000 的暗色泥岩，其中 2 800 ～ 4 000 m 的样品对应于东营凹陷古近系烃源岩的生油初期到生油晚期。研究结果表明， C31 、 C32 、 C33 、 C34 、 C35 升藿烷 ( 17α( H) ， 21β( H) ) 构型转化参数的分布除与异构体之间的手性碳立体构型转化作用有关外，不同异构体之间降解或裂解速率和新生成速率的差异也是其主要控制因素，沉积环境 ( 如高盐环境 ) 也在一定程度上影响了其分布 ; 从未熟 — 低熟状态到成熟状态，相关升藿烷构型转化参数 22S /( 22S + 22R) 总体均表现出随埋藏深度增大而加大的特点，并从离散状态聚集到热演化的平衡状态附近 ; 在到达成熟状态后，相关升藿烷的构型转化参数 22S /( 22S + 22R) 从缓慢增大过渡到一个持续的热演化平衡状态，并且该构型转化参数的热演化平衡状态对应于生油门限附近 ; 在高盐环境中除 C33 升藿烷保持不变的热演化平衡状态外，其它升藿烷均呈现不同幅度的逆转特征，表明高含量的盐类矿物对升藿烷成熟度参数亦具有抑制作用或迟缓效应 ; C31 、 C32 、 C33 、 C34 、 C3517α 升藿烷之间的 22S /( 22S + 22R) 分布型式复杂多变，其中对于成熟源岩样品， C35 升藿烷 22S /( 22S + 22R) 值变化强烈，表现出 “ 翘尾 ” 状的上升型特征和 “ 坠尾 ” 状的下降型特征，而对于低熟 — 未熟样品， C32 升藿烷的 22S /( 22S + 22R) 显示相对高值，并且多数样品显示为 C31 ＜ C32 ＞ C33 ＜ C34 ＞ C35 的偶数碳优势的特征 ; 研究显示 C31 到 C33 升藿烷的构型转化参数 S /( S + R) 热演化平衡值均为 0 ． 6 ，而 C34 S /( S + R) 及 C35 S /( S + R) 热演化平衡值相对较高，沙三段、沙四段的 C34 S /( S + R) 及沙四段的 C35 S /( S +R) 分别达到 0 ． 63 、 0 ． 62 、 0 ． 65; 升藿烷指数 C35 /Σ( C31—C35) 受热演化影响也比较明显，在生油期间随着埋藏深度增加而减小，在高盐环境中表现出相对高值，研究表明该指数的变化与其 22R 异构体演化有关，并且参数 C31 /Σ( C31—C 35) 、 C 32 /Σ( C 31— C 35) 、 C 33 /Σ( C 31— C 35 ) 、 C 34 /Σ( C 31— C 35) 、 C 35 /Σ( C 31— C 35) 演化特征截然不同。 关键词升藿烷构型转化参数生物标志物湖相源岩东营凹陷 CHEN Zhong-hong, et al. Distribution and Characteristics of the Homohopane Molecular Parameters in Paleogene System of the Dongying Sag. Acta Sedimentoligica Sinica, 2011, 29(1):173-183 Abstract The Paleogene system in the Dongying sag is a representative lacustrine basin in the eastern China ． To investigate the distribution and characteristics of the homohopane maturation parameters ， the main source rocks from Member 3 ( deposited in fresh and brackish water ) and Member 4 ( deposited in salty water ) in Shahejie Formation ( burial depth from 1 300 m to 4 000 m ) were investigated ． The range 2 800 ～ 4 200 m coincides with the " oil window"from the early of oil generation to the late of oil generation ， which can well represent the evolution of homohopane maturation parameters during the process of oil generation ． The results demonstrate that the main controlling factors for the distribution of C31 ， C32 ， C33 ， C34 ， C35 ( 17 α ) homohopane parameters are the isomerization and different decomposition rates as well as generation rates between different isomers ． Depositional environment ( such as high-salt environment ) also impacts their distribution to some extent ． For immature and low-mature samples ， the related parameters 22S / ( 22S + 22R ) increase with burial depth from a disperse state to a equilibrium state ， while for the matured samples the parameters increase slowly and then transit to a continuous thermal equilibrium state ． In high-salt environment most homohopanes show reversal in different degree except C33 homohopane which remains unchanged in an equilibrium state ， indicating that high content of saline minerals also has inhibited or retarded the homohopane maturity parameters ． The thermal equilibrium of the parameters coincides with the threshold of oil generation and can be seen as a good indicator for oil generation ． The distribution patterns of C31 ， C32 ， C33 ， C34 ， C35 ( 17 α ) 22S / ( 22S + 22R ) are complex and diversified ． For the matured source rock samples ， the C35 homohopane 22S / ( 22S + 22 R ) shows a strong change and is characterized by obvious " rise and" " fall" ． While for the immature samples ， C3222S / ( 22S + 22R ) displays some remarkable high value ， and most immature samples demonstrate characteristics of C31 ＜ C32 ＞ C33 ＜ C34 ＞ C35 and exhibits an advantage of even-number carbon ． The study shows that the thermal equilibrium values for C31 ， C32 ， C33 isomerization parameters are 0.6 consistently ， while the equilibrium values for C34and C35 homohopanes are comparatively high ( the equilibrium of C3422S/ ( 22S + 22R ) for Member 3 and Member 4 are 0.63 ， 0.62 respectively ， and the equilibrium of C3522S / ( 22S + 22R ) for Member 4 reaches 0.65 ). The homohopane index C35 / Σ ( C31-C35 ) is also impacted by thermal evolution ． In the oil window the index firstly decreases as the burial depth increases ， and in the 3.6km high-salt environment ， the index shows opposite trend and relatively high values ． The study indicates that its change is dominated by 22R isomers ． The parameters C31 / Σ ( C31-C35 ) ， C32 / Σ ( C31-C35 ) ， C33 / Σ ( C31-C35 ) ， C34 / Σ ( C31-C35 ) ， C35 / Σ ( C31-C35 ) show different characteristics in their distribution and evolution in the profile ． Key words homohopane ; isomerization ; biomarkers ; lacustrine source rocks ; Dongying sag
阿尔茨海默病近20年来的研究进展是神经病学最热门领域之一。从只能对中晚期患者进行精神行为症状的对症处理，到能够改善痴呆症状的胆碱酯酶抑制剂的广泛运用，到近5年来AD的生物标志物研究，已经将AD的治疗和干预从中晚期提前到轻度认知功能障碍阶段。这些研究进展修正了既往人们对阿尔茨海默病的认识，过去简单的将阿尔茨海默病与老年性痴呆划等号，甚至包括医学教材中也强调明显影响日常生活和社会活动才能作出诊断。 而在今年美国阿尔茨海默病协会更新的AD分级诊断指南中，将AD分为无症状的临床前期，出现轻度认知功能障碍症状的临床早期，以及明显影响日常生活能力的典型期。这一重大的诊断标准更新体现了尽可能早期干预的概念，就如同无症状的冠心病，或者超早期原位肿瘤的诊断指标一样，AD的认知损害症状出现之前10年就已经在脑内有严重的病理改变，而到了痴呆的阶段则相当于肿瘤的晚期，或是心功能失代偿阶段。而生物标志物的检测贯穿了AD的全部阶段。 在目前已经被确认的生物标志物中，与AD发病密切相关的指标包括脑脊液中 淀粉样蛋白和tau蛋白的升高，此外，直接标记脑内淀粉样斑块的PIB-PET表达增高也是AD进展的特异性标记。而头颅核磁共振检查连续随访能够反映记忆相关脑区的萎缩。但是，脑脊液检测为有创性操作，多数患者不愿意接受；而PET检测高达数千元的费用也不可能广泛应用到诸多AD患者中去。因此，努力寻找血液中特异性指标或者组合自然成为AD研究的重点突破方向之一。 近年来飞速发展的蛋白质组学技术提示了可能：2007年来自美斯坦福大学医学院神经疾病及神经科学系，Satoris公司，瑞典哥德堡大学（UniversityofG?teborg），波兰弗罗茨瓦夫医科大学（WroclawMedicalUniversity）等多国研究人员组成的研究团队从血浆中分离鉴别出了18个信号蛋白，被证明可以能用于阿尔茨海默病诊断的的生物标记蛋白组合，这一研究成果当年发表在《自然医学》（NatureMedicine）杂志上。 近3年来全球多中心采用Satoris公司设计的蛋白质组芯片，证明用这18个生物标志蛋白来预测阿兹海默症与诊断结果相比有高达90%的准确率。提示不远的将来通过滴血鉴定作为AD重要生物学标志物时代的到来。 因此，时代周刊展望未来AD的诊断进展时，将AD的血液指标检测放在了2010年度10大医学进展的第3位。但是一些AD临床专家指出，AD的平均发病年龄在65岁左右，其它因素包括急性心脑血管病、全身麻醉等可以导致临床症状的早期出现，而高教育水平、良好的心态和生活习惯，以及缺少心脑血管危险因素的老年人具有较强的脑功能储备，可以延缓认知损害症状的出现时间。因此，只有将患者的临床评估和多个生物标志物结合起来综合分析，才能对其进行正确的诊断和分级。 网上找到的内容如下： Top 10 Medical Breakthroughs AIDS Drugs Lower the Risk of HIV Infection Synthetic Cell Blood Test for Alzheimers FDA Approves Botox for Migraines Taking the Resuscitation Out of CPR The FDA Restricts Avandia Blood Test for Heart Attack Predicting IVF Success Artificial Ovary Creating iPS Cells Safer and Faster 3. 老年性痴呆 症的血液检测 3. Blood Test for Alzheimer's 虽然临床医生用以诊断疾病的方法越来越先进，但即便运用最尖端的成像与分子探针手段，老年性痴呆症(亦称阿尔茨海默病)仍然难以确诊。只有在尸检时才能确定一个人是否患有这种退化性疾病，因为到那时，病理学家可以证实大脑中是否存在病斑等 老年性痴呆 症的标志性特征。但是，一种颇具前景的新型血液检测手段或能在疾病发展过程中提前做出确诊，从而给预防痴呆和智力衰退提供了可能性，甚至在最早的症状出现以前。 新的检测手段通过分析血液中二十多种蛋白，诊断老年性痴呆症的准确率高达80%。这只是旨在提前发现和确定老年性痴呆症的一系列最新手段之一，这些手段还包括测试脊髓液。提前确诊可以帮助患者充分利用行为干预手段，如保持社会接触和学习新事物以保持大脑活跃，从而减缓 老年性痴呆 症造成的智力衰退。 Despite the increasingly sophisticated methods clinicians have for diagnosing disease, Alzheimer's remains out of reach for even the most advanced imaging and molecular probes. The degenerative illness can be definitively diagnosed only at autopsy, when pathologists can confirm the presence of hallmark plaques and tangles in the brain. But a promising new blood test may help confirm a diagnosis early in the disease's progression, which opens the possibility for prevention of dementia and mental decline even before the earliest onset of symptoms. The new test analyzes more than two dozen proteins in the blood, and is 80% accurate in identifying patients with the disease. It is only the latest in a series of new methods, including tests of spinal fluid, aimed at detecting and confirming Alzheimer's earlier in patients' lives. Quicker diagnoses could help patients take advantage of behavioral interventions such as keeping the mind active by maintaining social contacts and learning new things that may slow the mental deterioration of Alzheimer's.
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