从一开始就是文化问题。在不知道相关分子性质的情况下，早期的微生物学家依赖于识别微生物的可遗传性状和化学活动，然后通过巧妙的实验对其进行分析。脱氧核糖核酸（DNA）作为遗传物质用来鉴定，以及随后DNA测序技术的蓬勃发展，将微生物学带入了基因组时代。科学家们不仅急于对单个微生物的基因组进行测序，还急于对包含整个生态系统中所有微生物DNA的宏基因组进行测序。
宏基因组学和微生物学研究呈指数增长。长期以来，生物学家一直怀疑地球上充斥着比他们所能看到或培养的要多得多的生命形式，现在有了证据。从人类肠道到海底，复杂的微生物群落塑造了生命的方方面面。这些新数据揭示了诱人的相关性，将不同的微生物群与从人类肠道健康到气候变化的一切联系起来。现在缺少的是表型：所有这些DNA序列实际上是做什么的？它们是如何做到的？
现在，研究人员开始利用各种技术探索这些问题。一些人正试图分离和培养目前仅从DNA序列所了解到的生物；而另一些人则将宏基因组测序推向新的方向，以对早期所遗漏的病毒、真菌和质粒进行分类。
创新文化
首批环境微生物组测序采样的样本之一是海洋，结果显示了以前从未表征过的大量细菌。当分子生物学家开始挖掘这些数据以了解这些生物体的基本生物化学组成时，药物化学家看到了潜在新药的丰富来源。
“不寻常的位置会导致不寻常的多样性，这将产生具有不寻常活动的不寻常的化学反应，而这作为一种策略，似乎已经取得了很大的成效。”英国阿伯丁大学化学系主任Marcel Jaspars说。Jaspars和同事最初从事的是PharmaSea项目，这是一个多机构合作项目，重点对海洋微生物组进行测序，并从这些微生物中寻找新的代谢产物。反过来，这些化合物可能被证明在药物开发项目中有用。PharmaSea项目于2017年结束，但Jaspars的团队仍在继续探索海洋深处。
“对我们来说，研究基因组并为天然产品寻找感兴趣的生物合成途径是很酷的。”Jaspars表示。例如，许多抗生素最初是在细菌中发现的，而参与PharmaSea项目的研究人员还发现了具有抗氧化性和其他有前景的药物特性的化合物。基因组数据揭示了这种有机体可以产生的大量代谢物，如蛋白质和多肽很容易通过这种方式识别。但一些最有趣的化合物来自复杂的代谢途径，仅从序列数据来看，这些代谢途径并不明显。为了解决这个问题，研究团队尝试在培养基中培养这种细菌，以研究它们的新陈代谢。
这是一个具有挑战性的过程。“我们必须尝试多种不同的条件，看看能否得到有趣的代谢物表达。”Jaspars说。由于专注于研究海洋生物，Jaspars的实验室必须复制深海的极端条件。通过修改培养基和使用特殊设备，如将样本置于相当于几公里海洋深度的压力室，他成功培养出了许多以前被认为无法培养的生物。Jaspars和同事们与位于加拿大安大略省多伦多的高级化学发展中心合作，确定了这种生物产生的代谢物。
在另一种方法中，该团队与微生物学家合作，在对实验室更友好的宿主中表达不可培养微生物的基因。“当有基因簇在那里时，通常可以在另一个宿主上操纵它，而非在原宿主上。”Jaspars解释道。
让新的生物体在培养物中生长不仅仅是实验室研究的一个有用工具，也是将基于微生物组的治疗方法引入临床的重要一步。例如，初步临床研究表明，将健康人的粪便细菌移植到患有慢性艰难梭菌感染的人体内可以治愈感染。然而，将这一发现转化为监管机构可批准的治疗方法却很困难，因为粪便不是一种明确的药品。
“要制造一种药物，并且必须让它能够成长。”位于英国欣克斯顿的威康信托桑格研究所宿主—微生物相互作用实验室教师组负责人Trevor Lawley表示。在2012年的一篇开创性论文中，Lawley和同事们开始解决这个问题，成功地从健康小鼠的粪便中培养出18种细菌，并使用确定的培养物治愈了另一组患有艰难梭菌感染的小鼠。
和Jaspars一样，Lawley将复杂的数据分析与老式的试错法结合起来。“我们犯了很多错误。”Lawley说。研究团队从一种培养基升级到另一种培养基，对每种培养基进行检查和测序，以确定哪些细菌仍然存在于原始粪便样本中、哪些已经消失。然后，他们修改了条件并再次尝试。
Lawley的实验室最终开发出一套用于培养人类微生物组的培养基配方。“现在我们可以采集你的粪便样本，在4周内将90%~95%的物种进行超纯化并存档。它使我们能够制造药物，并使表型生物学成为可能。”位于英国剑桥的生物技术公司Microbiotica正致力于将这种微生物疗法应用于临床。
虽然制造药物是最初的目标，但这项工作对基础研究有一个重大的附带好处。“我认为它改变了我们做宏基因组分析的方式，这实际上是非常有影响的。”Lawley说。通过培养大部分的人类肠道菌群，他的团队已经能够为之前未培养的物种组装完整的参考基因组。研究人员现在可以将这些参考基因组与他们在其他样本中获得的宏基因组序列进行比较，从而极大地改善了数据。
身边的真菌
细菌并不是唯一在人类肠道中安家的生物，尽管人们可能会从早期的微生物组学文献中获得这样的印象。“很多研究都集中在细菌成分上，因为它是一种容易实现的目标，也被认为是影响健康和疾病的最大因素。”位于得克萨斯州休斯敦的贝勒医学院分子病毒学和微生物学系主任Joseph Petrosino说。
Petrosino的实验室致力于开展人类微生物组计划（HMP）。最近，研究人员开始研究真菌。“许多人认为它们是病原体，但是健康个体的真菌多样性是什么样子的？”
聚焦于酵母和霉菌共同的基因组特征，研究人员在HMP粪便样本中寻找真菌，进而获得了对正常人类真菌群落的初步观察。结果显示，“真菌群落的多样性远不如细菌群落，而且随着时间的推移也不太稳定。”Petrosino说。自2017年发表这项工作以来，其他实验室已经开始研究健康和患病肠道中的真菌群落。“这可能比细菌微生物组领域研究晚了5年左右。”
研究菌群的挑战之一是样品中的真菌相对稀缺。例如，在一个粪便样品中，细菌DNA的绝对数量可以掩盖真菌序列。同时，活检样本中往往含有大量宿主细胞。“有些方法的发展是有所帮助的，但还没有真正迈出转变范式的一步。”Petrosino坦言。
尽管如此，该领域已经产生了一些诱人的结果。一项临床研究表明，在没有面包、啤酒、蘑菇和其他真菌来源的严格饮食中，个体最终会形成无真菌的肠道微生物群。“那么问题是我们吃这些食物是为了什么？它们对健康是有益还是有害？”Petrosino说。在另一个项目中，Petrosino实验室的研究人员正培养来自胃肠道活检的3D细胞来研究各种真菌和肠道上皮细胞之间的相互作用。Petrosino希望将这些模型与额外的真菌群落测序数据相结合，从而绘制出细菌、真菌和宿主细胞之间相互作用的完整图谱。
病毒式传播
尽管具有挑战性，但要将以前没有表征的细菌和真菌进行分类，仍然需要依赖于这些生物体的共同特征。例如，所有细菌都携带高度保守的16S核糖体RNA序列，这些序列随着进化时间的推移而缓慢变化。微生物组学研究中的一种常见策略是使用针对这些序列的PCR引物，然后根据它们的差异对样本中的细菌进行分类。
病毒没有这样的捷径。相反，研究人员对病毒组的研究依赖于生物信息学。“有多种方法可以丰富对病毒序列的计算。”加州大学旧金山分校神经外科助理教授Stephen Francis说。在一项对来自中国15万名女性样本的病毒多样性大规模研究中，Francis和同事进行了高通量测序，然后减去所有与参考人类基因组匹配的序列。然后，他们在剩余的序列和已知病毒序列数据库之间寻找匹配。
结果不仅揭示了众所周知的病原体（比如人乳头瘤病毒和乙型肝炎病毒）在人群中的广泛分布，而且还揭示了已整合到患者基因组中的内源性逆转录病毒序列的有趣差异。“我们一直受到病毒的‘狂轰滥炸’，有时当病毒内生到我们的基因组中时，它可以为整个物种提供某种功能上的好处或损害，所以我认为这是一个非常重要的事件，需要了解。”Francis表示。尽管这些古老的整合病毒序列曾被认为是“垃圾DNA”，但最近的分析表明，它们对婴儿进化以及人群疾病风险的变化等方方面面都有贡献。
Francis计划扩大病毒学分析范围以覆盖100万名女性。他认为，大规模的基于人群的研究将极大地促进人们对病毒和健康之间关系的理解。由于样本来自孕妇，研究人员可以寻找特定病毒和分娩结果之间的联系。“子宫内感染显然是一个需要了解的重要方面，特别是对于塑造生命后期的免疫反应。其他大型人群研究，比如英国生物银行的研究，为研究人员提供了更多的样本储备。”
链上的链接
细菌学家也开始超越16S核糖体RNA测序。许多人现在已经转向宏基因组研究，包括对样本中所有DNA进行测序，并尝试根据数据组装完整的细菌基因组。尽管这些项目近年来取得了令人瞩目的进展，但细菌生命的另一个重要方面——质粒仍难以研究。
作为保持自身与细菌基因组分离的一种小的环状DNA元素，质粒提供了一个深层次的基因库，这些基因库通常会赋予宿主诸如抗生素耐药性、新的代谢能力和毒性等特性。
“你可以使用常规测序来了解微生物群落中质粒的种类，但不能将这些质粒与它们所在的细菌宿主联系起来。”莫斯科爱达荷大学生物科学教授Eva Top说。许多质粒是混杂的，很容易在不同种类的细菌之间转移，所以即使科学家发现与一个物种相关的特定质粒，也不能证明它在其他物种中不存在。同时，一种细菌的某些菌株可能携带质粒，而另一些菌株可能不携带，并且在微生物生态系统中，质粒的分布会随着时间的推移而改变。
为了解决这个问题，Top和同事们采用了一种名为“邻近连接”的技术，该技术最初用于在免疫检测中将抗体连接在一起。通过修改这种方法，研究人员能够在裂解细菌进行测序之前结合质粒与宿主基因组。然后，他们可以获得宿主染色体及其相关质粒的序列数据，从而能够分析质粒在不同微生物组中的运动动力学。
“我们当然对质粒的基础生物学很感兴趣，但也对抗生素耐药性问题以及质粒在耐药性传播中所起的作用感兴趣。”Top说。到目前为止，她的团队已经揭示了某些细菌群体特别擅长提取带有抗生素抗性基因的质粒，其可能作为耐药性的储存库，然后传播到致病物种。研究人员还开始分析新引入的质粒是如何通过微生物组传播的，例如当动物粪便中携带抗生素抗性的质粒遇到农田中的土壤微生物组时。
不管他们采用何种具体方法，推动基因组学向新方向发展的科学家们对未来都很乐观。正如Petrosino解释的那样，“几十年来，研究人员一直在研究共生生物，但现在这项技术开始帮助我们提出不同类型的问题。”■
参考文献
1. T. D. Lawley et al., PLOS Pathog. 8, e1002995 (2012).
2. A. K. Nash et al., Microbiome 5, 153 (2017).
3. Liu et al., Cell 175, 347-359.e14 (2018). T. Stalder, M. O. Press, S. Sullivan, I. Liachko, E. M. Top, ISME J. 13, 2437-2446 (20 19).
Alan Dove是马萨诸塞州的科学作者和编辑。
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2020年10月9日《科学》杂志”。官方英文版请见https://www.science.org/content/article/genomics-comes-full-circle。
