本期作者：阿飞

2018.1.12

     今天继续跟大家一起学习中国农科院徐云碧老师发表在PBJ上有关BSA分析的综述（Bulked sample analysis in genetics,genomics and crop improvement，DOI: 10.1111/pbi.12559）。这篇文章中详细介绍了BSA的技术方法、取样/分组策略和分析方法等内容，同时也对BSA技术在遗传学、基因组学和作物改良等方面的应用进行了介绍和展望。

    BSA（bulked sample/segregant analysis）可以翻译为“混合样本分组分析法”、“分离群体分组分析法”或“集团分离分析法”。该方法由Michelmore等人于1991年首次提出，并成功在莴苣中筛选出了与霜霉病抗性基因连锁的分子标记。传统意义上的BSA分析（bulked segregant analysis），主要是选择双亲群体分离后代中具有极端表型的个体进行混样，通过比较不同极端混样池之间的多态性并结合表型进行目标基因定位的方法。像MutMap或MutMap+等基因定位的方法，都是基于BSA分析的基本原理结合高通量测序/分析技术而开发出来的。随着分子育种技术的不断发展，BSA技术（bulked sample analysis）不仅可以应用在双亲群体的基因定位种，也可以在多亲群体、自然群体或者一些特殊组配的群体中应用，甚至可以用于全基因组的关联分析或对数量性状QTL进行定位。

    BSA分析中最基础的部分应该是遗传群体的构建。遗传群体可以分为单亲群体（比如EMS突变体库）、双亲群体（比如F2、F2:3、BC、RIL或DH）、多亲群体（比如NAM和MAGIC）以及自然群体等。不同群体的构建方法和遗传特点可以参见我们上周有关遗传群体介绍的推送（扒一扒遗传分析中群体那些事儿）。不管是什么样的群体，只要目标性状有明显分离并容易分组，应该都可以混样进行BSA分析。当然对于自然群体的BSA分析来说，不同个体之间因具有较大地遗传背景差异，非目标性状应变异广泛，目标性状应差异明显并且表型鉴定要严格控制条件。

      一般情况下，BSA分析主要用于受环境影响较小的质量性状基因或主效基因的初步定位，现在也有一些利用BSA进行微效基因或QTL的定位报道。BSA分析的有效性很大程度上依赖具有极端表型个体的鉴定和混样，也就是个体表型鉴定的准确性。特别是一些容易受环境影响的表型，更应该严格控制，将非遗传性的影响因素，比如土壤环境、地理位置、生物或非生物胁迫等因素的影响降到最低。同时，BSA分析中混样的目或群体大小同样重要。对单基因控制的性状，群体或混样的大小与群体类型、标记密度以及目标区间的重组频率等因素有关；对于多基因控制或数量性状来说，群体或混样的大小还要考虑目标基因的数目、目标基因间的互作以及目标基因在染色体上的分布等情况。对于质量性状或差异明显的性状来说，两个极端池可以分别包含30~50个单株，最少也得20个单株以上，总的群体大小可以控制在200~500；对于效应值较大的QTL来说，两个极端池每个最少也要混20个单株以上，效应值居中的QTL每个极端池至少要包含50个单株，相应的群体大小应该控制在500~1000，效应值较小的QTL每个极端池应该包含至少100个单株，对应的群体大小在3000~5000。

      取样和混池之后需要对样本进行检测，以发现不同样本之间的多态性。这些检测手段可以是DNA水平、RNA水平，也可以是蛋白质水平。DNA水平的检测可以是分子标记、基因芯片、GBS（genotyping by sequencing）或全基因组/外显子组测序等；RNA水平主要是指RNA-Seq测序，但当目标位点没有表达或者没有检测到表达时，最终的分析结果可能受到影响；蛋白水平的分析主要是指蛋白芯片检测，由于蛋白芯片对微环境非常敏感，检测的稳定性还有一定的挑战。（其余的内容在今天就不跟大家解读了，感兴趣的同学和老师可以查看原文）

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