手握TNT，直击Mtb（结核杆菌)

诸平

请注意这里的TNT,并非传统的三硝基甲苯（Trinitrotoluene），而是一种对付结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis简称Mtb)的新毒素——引起结核坏死的毒素（Tuberculosis Necrotizing Toxin简称TNT）。原来拟定的标题是“对抗结核分枝杆菌(Mtb)的新毒素”，当看完全文后，联想到图7，感到使用“手握TNT,直击Mtb”可能更加符合实际，更具有科普特色。

图7是韩国首尔国立大学（Seoul National University, SNU）高级融合技术研究所（Advanced Institutes of Convergence Technology）的马修·施瓦茨（Mathew Schwartz）提供，但是，需要说明，图7看上去，仿佛就像一只手掌中握着一个TNT球，通过形象化的爆炸，使结核坏死毒素（TNT）导致坏死细胞死亡，并从巨噬细胞（macrophage）中放出结核菌（tuberculosis bacteria）。

结核杆菌(Mtb)与结核病（TB）

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis简称Mtb)又被俗称为结核杆菌，是引起结核病的病原菌。这是1882年，德国细菌学家罗伯特·柯霍（Robert Koch，1843～1910）就已证明的。Mtb可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。结核病(TB)至今仍为一种重要的传染病。

随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5%～10%携带者可发展为活动性结核病。近20年由于艾滋病的流行，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且结核的病程发展更快。此外，在HIV感染的发展进程中，结核是最早发生的一种机会性感染，结核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。21世纪以来全球每年约有800万结核新病例，并导致约300万人死亡，居各种疾病死亡原因之首。中国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。

2015年3月，WHO关于TB的相关统计结果显示，TB仅仅是继艾滋病毒/艾滋病之后，在全世界由单一传染性病原体引起的最大杀手。2013年，有900万人罹患结核病，其中包括110万HIV携带者；150万人死于该疾病，其中包括36万人HIV呈现阳性；150万死亡者之中，女性死亡人数51万，其中包括18万人HIV呈现阳性；HIV呈现阳性的所有结核病死亡人数中，有一半是女性。95%以上的结核病死亡发生在低收入和中等收入国家，它还是导致15～44岁妇女死亡的五大原因之一，也是女性生育年龄段的主要杀手之一。2013年，估计有55万名儿童罹患TB，有8万名艾滋病毒阴性（HIV-negative）儿童死于TB。TB是艾滋病毒阳性者的首要死因，占所有艾滋病相关死亡总数的25%。2013年，全球预计有48万人患耐多药TB。每年罹患TB的估计人数正在下降，尽管降幅很小，但意味着这个世界正在按计划实现“到2015年扭转结核病蔓延”的千年发展目标。1990～2013年间，TB死亡率下降了45%；2000～2013年间，通过TB的诊断和治疗，估计已使3700万人的生命得以挽救。在全球范围内,2013年，有70%的TB患者是艾滋病毒感染者，这些患者开始接受抗逆转录病毒疗法(ART)治疗。2013年,登记在册感染艾滋病毒并参与防治结核病的筛查人数由2012年的410万人增加到550万人，而且这些感染HIV的结核病新病例中，有60万人已经接受异烟肼预防性治疗（isoniazid preventive therapy）。尽管如此，对于TB的防治工作依然任重道远，万万不可掉以轻心，以免导致更多耐药性结核病例。

结核病(TB)可防可治

TB是由经常感染肺部的细菌即Mtb引起。大约三分之一的世界人口有潜伏性结核，这意味着人们已经感染了结核菌，但（尚）未因病倒下，也不会传播疾病。已经感染了结核菌的人中，在一生中因结核病而病倒的危险为10%。但是，像是艾滋病毒携带者、营养不良或糖尿病等免疫系统受损的人，或者烟草使用者，他们的患病风险会高很多。当某人发展为活动性结核（病）时，一些轻微症状（咳嗽、发烧、盗汗、体重下降等）可能会持续数月。这可能导致延误就医，将细菌传播给他人。结核病通过空气在人与人之间传播。当患有肺结核的人咳嗽、打喷嚏或吐痰时，就会把结核菌喷到空气中。人们只需要吸入少数几个这类细菌就会获得感染。结核病病人在一年之中可以通过密切接触感染多达10～15人。如果不进行适当治疗，高达三分之二的结核病患者会失去生命。

TB是一种可防可治的疾病。活动性、对药物敏感性结核病可以通过标准的4种抗菌素6个月疗程进行治疗，同时由卫生工作者或经过培训的志愿者为患者提供信息、督导和支持。如果没有这种督导和支持，坚持治疗可能较为困难，疾病可能会蔓延。如果能够提供药物并适当服药，绝大多数结核病例均能得到治愈。据WHO统计结果显示，2000～2013年的10余年间，通过结核病的诊断和治疗，估计已使3700万人的生命得以挽救。

谁面临患TB的风险最大？

受到TB影响的大多是正处于生产力最强阶段的年轻人。但是，所有的年龄组均面临危险。95%以上的病例和死亡发生在发展中国家。据WHO报道，感染艾滋病毒的人患TB的可能性是正常人的26～31倍。有其他损害免疫系统疾病的人们患活动性TB的风险也较高。2013年，超过50万名儿童（0～14岁）患TB，有8万名艾滋病毒阴性儿童死于该疾病。烟草的使用大大增加了感染TB和死亡的风险，因此，我们对于吸烟带来的危害不能低估，就吸烟与TB相关性而言，全世界20%以上的TB病例由吸烟引起。

TB的全球影响

TB在全世界的每个地方都会发生。2013年，发生新发结核病病例最多的是东南亚和西太平洋区域，占全球新发病例的56%。但是，按人口计算，非洲出现新发病例的比例最大，2013年，每10万人中就有超过280个病例。2013年报告发生的结核病例中，大约80%在22个国家。一些国家的病例数出现了大幅下降，而在其他一些国家，病例数的下降却极为缓慢。例如，过去20年中结核病病例出现持续下降的22个国家中有巴西和中国。在过去的10年中，柬埔寨的结核病患病率下降了近50%。

TB和HIV

携带艾滋病毒(HIV)的人发展成为活动性TB的可能性是未感染艾滋病毒人群的26～31倍。2013年，全世界HIV携带者中有至少三分之一的人感染了Mtb，虽然他们未成为活动性TB患者。HIV和TB的并存具有致命性，每种疾病都会加快另一种疾病的发展。2013年，约有36万人死于与HIV相关的TB。大约25%的艾滋病毒阳性者死于TB。在2013年，估计有110万艾滋病毒阳性新发TB病例，其中78%生活在非洲。为整合TB—HIV活动，世卫组织提出了一个旨在减少死亡的12项内容方针建议，包括针对预防和治疗感染和疾病的行动。

耐多药TB

标准的抗结核药物已使用了数十年，而对这些药物的耐药性正在不断增长。WHO组织的调查结果发现，在每一个国家中都有对单一药物具有耐药性的菌株记录。耐多药TB是结核病的一种形式，它是由至少对异烟肼和利福平这两种最为有效的一线（或标准）抗结核药物没有反应的细菌引起的。耐多药TB的主要病因是治疗不当。不适当或错误使用抗结核病药物，或使用劣质药物均可导致耐药性。由耐药性菌株导致的疾病对传统一线治疗药物没有反应。通过使用二线药物，可以治疗和治愈耐多药TB。但二线治疗方案具有局限性，所推荐使用的药物不是总能得到。所需的长期化疗（高达两年的治疗）更加昂贵，患者也可能会产生严重的药物不良反应。某些情况下，也可能出现更严重的耐药性。广泛耐药TB是一种对多种药物耐药的TB，对其有效的可用药物甚至更少，包括最有效的二线抗结核药物。2013年，全世界约有48万人患有耐多药结核病，其中超过一半的病例发生在印度、中国和俄罗斯联邦。估计约有9%的耐多药结核病例患有广泛耐药结核。关于TB的更多信息以及WHO的应对策略，请注意浏览控制结核战略概要。

TNT:对付TB的新毒素

据物理学家组织网（phys.org）2015年8月4日转载来自阿拉巴马大学伯明翰分校（ University of Alabama at Birmingham）的消息，该校的研究人员已经发现了一种对付结核分枝杆菌的新毒素即使结核病坏死的毒素（Tuberculosis Necrotizing Toxin简称TNT）。

尽管从1882年德国细菌学家罗伯特·柯霍（Robert Koch，1843～1910）证明结核分枝杆菌（Mtb）是结核病的病原菌至今，已经有132年之久,但是一致尚未发现对致命病原体Mtb起作用的毒素。因Mtb每年造成900万人感染结核病,每年有超过100万人死于此病。

现在,美国阿拉巴马大学伯明翰分校（ University of Alabama at Birmingham）微生物学教授、迈克尔·尼德威斯（Michael Niederweis）博士及其同事，发现了第一个结核病致病细菌——Mtb的已知毒素。这种毒素被称之为使结核坏死毒素（Tuberculosis Necrotizing Toxin）或简称为TNT,是存在于超过600种细菌和真菌之中，但一致鲜为人知的新型创始成员类毒素,是由蛋白质序列相似性所确定的。迈克尔·尼德威斯发现之前,这些毒素被称为“未知功能4237域（Domain of Unknown Function 4237）” 。

 与相近的其它因为含有导致疾病或死亡毒素的致病菌（pathogenic bacteria ）相比较，Mtb中缺少某种毒素。Mtb是其生存在巨噬细胞内,而巨噬细胞是人体吞噬细胞的一种,分布于组织中,有免疫信息传递、协同和吞噬处理抗原功效，巨噬细胞也是吞噬和破坏感染细菌的免疫细胞。迈克尔·尼德威斯博士说,新发现的TNT，在诱导感染巨噬细胞的坏死死亡中发挥着关键作用。因此,TNT能够使Mtb细菌逃避巨噬细胞，传播给肺结核感染者体内的其他宿主细胞,因此导致Mtb的生存和TB的传播。

迈克尔·尼德威斯博士在关于TNT的论文中写道:“Mtb与控制被感染巨噬细胞命运的人体免疫系统之间的决斗，在确定感染结果方面至关重要。宿主细胞死亡的控制对于Mtb的生存、逃避及传播是极为重要的。” 迈克尔·尼德威斯博士等人的研究论文，已于2015年8月3日在《自然结构和分子生物》（ Nature Structural & Molecular Biology）杂志网站在线发表——JimSun, Axel Siroy, RaviK Lokareddy, Alexander Speer, Kathryn S Doornbos, Gino Cingolani, Michael Niederweis. Thetuberculosis necrotizing toxin kills macrophages by hydrolyzing NAD. Nature Structural & Molecular Biology, Published online 03 August 2015, doi:10.1038/nsmb.3064.

TNT姗姗来迟到的原因

为什么这种毒素(TNT)在一个多世纪以来一直尚未被发现呢?首先,是因为其在体外产生的数量非常稀少, 迈克尔·尼德威斯实验室要想探测到这种毒素，需要将其细胞培养滤液浓缩1000倍,相当于要将一加仑牛奶浓缩到约三分之一茶匙。其次是因为只有当这种毒素存在于宿主细胞胞质内部时才是致命的毒素;如果此毒素在血液中或被添加到体外宿主细胞的培养基中,其毒性荡然无存。第三是因为这种毒素与任何其他已知毒素毫无相似之处。

除了TNT，含有孔蛋白

迈克尔·尼德威斯发现了TNT，同时也在寻找完全不同的其他东西。他发现外膜蛋白可以作为一个入口，让细菌外面的营养素通过极其不透水的、Mtb的外膜屏障进入到内部。迈克尔·尼德威斯研究团队认为，他们已经找到了这样的一种孔蛋白的蛋白质,但它有一种不同寻常的性质，在外膜形成孔隙后这种蛋白质会立即与其末端部分断绝联系,而末端部分是有剧毒的,在像细菌一样的简单原核细胞和更复杂的酵母真核细胞、哺乳动物真核细胞以及鱼类真核细胞中，都是如此。2014年，在《美国国家科学院学报》（Proceedings of the National Academy of Sciences）上发表了一篇论文, 迈克尔·尼德威斯说这一发现“向Mtb是为数不多的、不会产生毒素的细菌病原体之一的论断发起了挑战。”详见Olga Danilchanka, Jim Sun, Mikhail Pavlenok, Christian Maueröder, Alexander Speer, Axel Siroy, Joeli Marrero, Carolina Trujillo, David L. Mayhew, Kathryn S. Doornbos, Luis E. Muñoz, Martin Herrmann, Sabine Ehrt, Christian Berens, Michael Niederweis. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosiswith exotoxin activity. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(18): 6750–6755.

2015年8月3日在《自然结构和分子生物》（ Nature Structural & Molecular Biology）杂志网站在线发表的论文，完全在功能和结构水平上，通过识别TNT-诱导坏死细胞死亡机制而建立了这种新范式。仿佛是一种视错觉,第一次看到一个花瓶,然后它似乎是两副面孔凝视对方, 迈克尔·尼德威斯起初认为，他发现了一种能够让营养素进入并可以携带一种人工制品的外膜孔蛋白。现在他终于明白了，认为这种蛋白质作为一种细菌自转运蛋白的蛋白质孔隙部分，类似于在其他细菌中,将TNT蛋白质输出到外膜之外。输出完成后,运输机的孔隙仍然保留着外膜上。

拓展研究，无巧不成书

TNT基因与600多种其他细菌和真菌物种的DNA序列具有一定的相似性，因此完全有可能将这种新型毒素，在其他病原体特别是依赖诱导坏死而继续生存或传播的微生物中的作用如何，进行拓展研究。

对TNT分子功能的艰难研究过程中, 迈克尔·尼德威斯实验室的博士后吉姆·孙博士发现，TNT的水解必要的辅酶是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。这就解释了为什么它杀死了每一种克隆的细胞类型,因为NAD+对细胞正常代谢是所必需的。研究人员只能够将其放置于旁边的一个诱导型启动子（inducible promoter），再来克隆TNT基因,诱导型启动子在诱导之前，一直是紧紧抑制转录的。在细胞内和体外TNT酶可使NAD+发生水解。由于抗体对抗TNT使水解受阻,而且特定的TNT点突变,可导致所有的酶活性灭活。非催化TNT突变体不可能灭杀巨噬细胞,对于TNT诱导细胞死亡而言，显示出水解酶活性是必须的。

如果TNT在结核分枝杆菌内生产,它会杀死该细胞。迈克尔·尼德威斯和他的同事们发现，结核分枝杆菌类似于细菌病原体酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）,会产生一种抗毒素来对付其自身毒素。TNT抗毒素与此毒素结合，阻碍其水解酶活性,从而使其在细菌内显示出无害性。研究人员已经将其命名为TNT抗毒素免疫因子(IFT，antitoxin immunity factor for TNT(IFT)）。

对TNT和TNT免疫因子（IFT）二者进入大肠杆菌来克隆的基因,其IFT保护细菌免于死亡,允许研究人员产生毫克量的TNT和IFT。在一项合作研究中, 来自托马斯·杰斐逊大学（Thomas Jefferson University）的一名教授，基诺·辛格拉尼（Gino Cingolani）博士在大约不过几周时间内,生产了纯化的蛋白质复合物晶体，并以1.1 Å的惊人分辨率确定了其分子结构。TNT分子形状像一个贪婪的手,手掌的一侧具有手指，而另外一侧具有一个扩展的拇指。IFT融入到TNT，恰好就像是手掌中握着一个球一样。

当致病性结核分枝杆菌生长在巨噬细胞吞噬体内部时,TNT迅速增加通向受感染的巨噬细胞胞质的入口，并水解NAD+,耗尽必要的辅助因子。这种通过下游信号启动坏死细胞死亡还尚未得到表征。奇怪的是，文献检索结果显示, 结核分枝杆菌细胞提取物中一个未表征的、热稳定的NAD+-糖水解酶（NAD+-glycohydrolase）活性，不但在半个世纪之前就有描述,而且还有一种未表征的、热稳定的水解酶活性抑制剂。迈克尔·尼德威斯实验室发现的TNT和IFT的一些生化特征，与20世纪60年代的报告中所描述的未表征蛋白质的生化特征是相匹配的。但是，缺乏现代设备和今天的抗体,以及存在于结核分枝杆菌内的TNT水平之低，严重阻碍了其研究人员在当时发现这种毒素的可能性，导致在132年之后发现是科学技术发展的必然结果。更多信息请注意浏览原文。