MDAP-1能使细胞内氧化应激发光（附原文）

诸平

武汉大学新成果

刘志洪教授

Scheme 1. (A) Model Reactions of Benzohydrazide Derivatives and MDA; (B) The Design Principle and the

Reaction Mechanism of MDA Probe (MDAP-1)

Scheme 2. Synthetic Route of the Probea

Scheme 3. Proposed Synergistic Turn-on Mechanism for

MDAP-1

据美国化学学会主办的《化学与工程新闻》（C&EN）周刊网站2015年8月10日报道，《分析化学》（Anal. Chem.）2015年7月22日发表了武汉大学刘志洪教授等人合成出一种可以阐明氧化应激和疾病之间联系的荧光分子——Jin Chen, Lingyu Zeng, Tian Xia, Shuang Li, Tengfei Yan, Song Wu, Guofu Qiu, Zhihong Liu. Towarda Biomarker of Oxidative Stress: A Fluorescent Probe for Exogenous and Endogenous Malondialdehyde in Living Cells（点击论文标题可以免费下载原文） . Anal.Chem., Publication Date (Web): July 22, 2015，DOI: 10.1021/acs.analchem.5b02032. 

图1是应激发光物质，上面的分子是荧光探针(MDAP-1)，而下面的分子是丙二醛(MDA), MDA是一种氧化应激生物标志物,上述2种分子反应，在活细胞内会产生一种信号。为了揭开糖尿病、心脏病、癌症和许多其他疾病背后的生物学本质,科学家可能需要一种应力探测器。研究人员已经开发出一种适宜于对氧化应激的重要生物标志物,即丙二醛探测的荧光探针。这可能会帮助科学家更好地理解活性氧过多和人类疾病之间的潜在联系。通过在活细胞内对氧化应激的可视化,或者有朝一日在动物体内对氧化应激可视化,科学家可以扭转细胞损伤，监测实验处理的效果。

氧的“双”效应

氧气本身就是一把双刃剑，生命活动离不开氧气，但是氧在维系生命现象的过程中，同时也会产生对生命体有害的物质。2次获诺贝尔奖的奥托·瓦尔堡（Otto Warburg）医生，在癌症研究方面有杰出贡献，他认为：“癌细胞在一个高氧环境无法生长”，当正常细胞中的氧化酶被阻断或破坏，就会引起糖的酵解，而这种酵解正是引起癌症的主要原因。罗伯特·奥尔尼（Robert C. Olney）认为这种“氧化阻断作用”使组织成为发病的原因（引起疾病），而这种病理状态往往能被正确的氧化剂纠正；免疫力的原料是氧气，缺氧时机体重要脏器磨损同时也给细菌增长了机会!著名分子生物学家斯蒂芬·莱文(Stephen Levine)论证：“缺氧是造成许多疾病的主要原因之一。”所以说氧是人类生命最重要的元素，是良好健康状态的关键。我们可以一周不饮水，一月不吃食物，但是没有氧我们只能活几分钟。氧是生命供给和维持的元素。所有的身体活动需要氧。通过氧化作用，身体产生热量和能量，处理代谢废物和微生物。身体有三分之二的水，人体中的水10％存在于血，90％存在于淋巴液中。身体中的水氧元素的比重占九分之八。因此，人体中50％的重量来源于氧元素。最好的优化健康的方式就是使身体内每个细胞都充氧。在我们身体系统中氧越多，我们就可以产生更多的能量，就可以更有效的清除身体内代谢垃圾。好的健康依赖于能量的产生、控制、流动，这些活动都依赖与糖的氧化。身体内的代谢、循环、呼吸、消化、合成作用、排除的核心是氧化作用。氧可以净化血液，保持细胞免于代谢废物蓄积。充足的氧容许身体重建自己，并维持身体的免疫系统。健康的细胞需要氨基酸、糖、激素、酶、矿物质和氧。

缺氧与疾病

疾病和身体供氧不足存在明确关系已经被确认。身体充氧不足可以造成很多问题，从轻微的疲劳到危及生命的疾病。奥托·瓦尔堡博士（Dr. Otto Warburg）因为揭示了癌症的病因，分别在1931年和1944年两次获得诺贝尔医学奖。他的主要理论就是“癌症有一个主要的病因，那就是正常细胞的氧呼吸被乏氧状态细胞的呼吸模式所替代”(Cancer has only one prim cause. The prime causeof cancer is the replacement of normal oxygen respiration of body cells by ananaerobic " oxygen - less " cell respiration.）。一旦细胞有效氧水平低于正常细胞需要的60％时，细胞被强制变成另外一种次级的能量产生方式――酵解，而且细胞不能回复到原来正常的氧化模式，进而细胞失去对自身复制的控制。细胞开始无规则的复制自身，此种状态的发展最终必然导致癌症。奥托·瓦尔堡博士曾经指出，如果细胞没有被杀死，任何可以使细胞失去正常氧供应的物质都是致癌因素。他在1966年表示寻找新的致癌物质的工作是无益的，因为每一个致癌物质的作用结果都是一样的，细胞水平氧丧失。不停的寻找新的致癌物质是反作用的，因为那样会模糊主要的致癌原因，缺氧阻碍了适当的治疗。

对于奥托·瓦尔堡博士工作的证实

德国国家癌症研究院在1952年对于奥托·瓦尔堡博士的发现给予肯定支持。哈利·格德贝特博士（Dr.Harry Goldbatt,1891-1977 )继续进行实验研究，1953年在《实验医学杂志》（The Journal of Experimental Medicine）上发表了他的研究结果——Harry Goldblatt, Gladys Cameron. Induced malignancy in cells from rat myocardium subjected to intermittent anaerobiosis during long propagation in vitro. The Journal of Experimental Medicine, 1953, 97: 525-552.他的研究验证了缺氧在造成正常细胞变为癌细胞的过程中起了主要的作用。阿尔伯特·瓦尔博士（Dr. Albert Wahl）的研究也揭示了造成疾病的主要原因是身体正常氧化的不足，导致毒素蓄积，而这些毒素在正常细胞中是被氧化掉的。海恩里西研究基金会的温德尔·亨德里克斯博士（Dr. Wendell Hendricks）发表文章指出，“癌症是一种身体内氧化作用衰竭以至于细胞发生不受控制的变性。身体过多毒素蓄积以至于形成瘤体去固定这些毒素，使毒素细胞失去正常活性。真正的变性原因是低水平的体内氧化过程，低水平氧化细胞对于外来物质比较敏感脆弱。仅仅当氧化机制被恢复到比较高的效能水平，细胞对外界物质的敏感性才会被清除。斯蒂芬·莱文博士（Dr. Strphen Levine）研究证明“缺氧是所有变性性疾病的根本原因。”诺曼·美克韦博士（Dr. Norman McVea）研究证明“当身体有充足的氧，身体可以正常的清除有毒代谢物质从系统中，当体内没有大量的毒素蓄积时，人体自身免疫力将被提高。1980年8月22日的《科学》（Science）杂志，第209卷，Sweet F等人发表一篇名为“臭氧选择性抑制癌细胞生长的文章——Sweet F, Kao M S, Lee S C, Hagar W L, Sweet W E. Ozone selectively inhibits growth of human cancer cells. Science, 1980, 209(4459): 931-933. DOI:10.1126/science.7403859.其中写到“来源与肺、乳腺、子宫的癌细胞被一定浓度的臭氧选择性的抑制，浓度为0.3至0.8 ppm，实验时间8天，正常大气压下，同时人肺部成纤维细胞作用实验对照组。0.3至0.5 ppm的臭氧分别抑制癌细胞40％～60％，在此浓度水平的臭氧对正常肺细胞毫无影响。癌细胞暴露于0.8 ppm的臭氧环境，可以抑制90％的癌细胞生长，同时抑制对照组细胞小于50％的细胞生长。癌细胞抵御臭氧损伤的机制是不够健全的，所以臭氧对于癌症的抑制带有剂量依赖的选择性。以上研究人员得出结论明确表示，氧在健康和生命活动中起着重要作用。生活中恐惧、担心、压抑会抑制自由呼吸，降低身体氧摄入，自然对健康无益。

获得超氧状态

如何确定来我们的身体有充足的氧化能力去清除毒素和预防或者治愈疾病呢？科学研究已经反复证实通过重复性正确的使用臭氧，医用臭氧可以移除身体内蓄积的毒素；灭活患病细胞中的病毒、细菌、真菌、酵母菌、病原虫和癌。所有的有害细菌、病毒是厌氧的，不能生存繁殖在富氧的微环境中。我们现在可以区别细胞水平呼吸和酵解的化学机制。这归功于奥托·瓦尔堡博士（Dr. Otto Warburg）的工作。自从1926年，我们知道当一个细胞被削减到正常氧含量的40％以下，细胞呼吸被不可逆转的破坏。这样的破坏使细胞开始酵解糖，厌氧情况下，生成一氧化碳和乳酸，细胞只产生正常有氧氧化的六分之一的能量。细胞对于自身生长放弃控制，细胞开始无规则生长，这也就是“癌症”发生的诱因。

氧化应激可控、可视化

当氧气代谢的副产物活性氧自然形成，并超过体内抗氧化防御系统时，就会发生氧化应激（Oxidative Stress）。氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是破坏了强氧化剂和抗氧化剂的平衡导致的潜在伤害，氧化剂、抗氧化剂平衡的破坏是细胞损伤的主要原因。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。然而,人们很少知道在特定组织中激起的氧化应激。这些激进分子实际上就是自由基会与细胞组件,如细胞膜内的脂质发生剧烈反应。当活性氧攻击多不饱和脂肪酸时,他们产生丙二醛（malondialdehyde）。检测这种生物标志物最常见的方法，就是需要杀伤细胞的试验条件:强酸和高温。其他检测方法，如拉曼光谱（Raman spectroscopy）、电泳（electrophoresis）以及液相色谱都不适宜于活细胞。显微镜是一种流行的研究活细胞的方法，武汉大学分析科学研究中心刘志洪（Zhihong Liu）教授和他的同事们，想要创建一种可用于跟踪丙二醛的荧光探针。

以此设想作为起点,研究人员研究了丙二醛（malondialdehyde）与苯甲酰肼（benzohydrazide）的反应, 苯甲酰肼很容易与醛类发生反应。使苯甲酰肼的结构得到修饰,这样就会有选择性地与丙二醛反应,然后与一种含有荧光团的化合物即8-萘二甲酰亚胺（8-naphthalimide）连接。最终形成一种荧光分子,命名为MDAP-1，它与丙二醛反应其发光增加了170倍以上。然后，研究人员进行检查，看看MDAP-1是否会在细胞内提供一种很强的的荧光信号。他们在附有MDAP-1的乳腺癌细胞上，再加不同浓度（0.1、0.2或0.5 mM）的丙二醛,观察到荧光信号的强度随着丙二醛的浓度增加而增强。接下来,他们将一种包含0.1或0.5 mM过氧化氢的溶液加入到已经预加载MDAP-1的癌细胞之中, 过氧化氢会形成可以引发氧化应激的活性氧。再次显示, 过氧化氢浓度越高，导致荧光信号越亮。作为一种控制方法,他们将一种抗氧化剂即抗坏血酸（ascorbic acid）加入到承载探针的细胞和过氧化氢溶液之中,目的就是为了清除活性氧，其结果显示这些细胞并未发出荧光。

维也纳医科大学（Medical University of Vienna）的克里斯托夫·宾德尔（Christoph Binder）说:“这种方法可能不仅对于细胞内成像极为重要，而且可能在组织或动物体内成像也同样棒极了。”事实上, 武汉大学化学与分子科学学院、武汉大学生物医学分析化学教育部重点实验室曾玲玉（Lingyu Zeng音译）说，他们计划使用这种探针研究前列腺癌细胞中的丙二醛和患前列腺癌小鼠体内的丙二醛。更多信息请浏览原文。

相关参考：http://www.healingcancernaturally.com/ozone-cancer-treatment.html 

刘志洪，男，1974年9月出生。教授，博士生导师，研究生物分析。1996年6月于大连理工大学获工学学士学位，2001年6月于武汉大学化学系获理学博士学位，同时获评湖北省优秀博士论文。2002年1月至2004年1月武汉大学生命科学学院微生物遗传研究室作博士后研究；2003年底评聘为副教授；2004年获湖北省自然科学二等奖；2005年12月至2006年12月拟赴美俄亥俄州立大学（Ohio State University）从事生物化学方向博士后研究（WHU-OSU双边协作计划、美国国家卫生研究院 (NIH)基金项目）。已在相关领域发表论文近40篇，其中包括第一作者（及通讯联系作者）SCI源刊文章18篇。现为武汉大学化学与分子科学学院教授、武汉大学分析中心主任。