原文链接：Metaproteomics reveals enzymatic strategies deployed by anaerobic microbiomes to maintain lignocellulose deconstruction at high solids | Nature Communications

摘要

经济可行的生产纤维素生物燃料需要在高固体装载条件下运行，通常在15%的重量百分比水平上。为此，我们表征了厌氧产甲烷微生物组解构和利用逐级增加的中期柳枝稷固体的自然能力。该微生物组在30 g/L至150 g/L范围负载下表现出不减的碳水化合物溶解能力。宏蛋白质组学分析显示了特定碳水化合物活性酶类别的丰度显著增加。在更高的固体负载下，辅助活性家族6酶的显著富集暗示了Fenton化学的作用。伴随这些反应的应激应答蛋白在更高的固体负载下同样上调，β-葡萄糖苷酶、木糖苷酶、碳水化合物去支链和果胶酶也同样上调，这些都表明去除降解抑制剂对于观察到的碳水化合物溶解能力至关重要。我们的工作揭示了自然微生物组在高固体负载条件下有效降解和利用木质纤维素的机制，为未来开发高效生物转化的明确培养物提供了见解。

图1 一个厌氧耐热微生物组在30至150 g/L的固体装载范围内表现出碳水化合物溶解的分数不减。

A 实验概述。用逐渐增加的柳枝稷半连续地喂养一个木质纤维素发酵微生物组。样品进行了碳水化合物溶解和宏蛋白质组学分析。宏蛋白质组学分析有两种方式进行; 整体样品分析（1D LC-MS/MS）和样品分级后进行多维（2D LC-MS/MS）分析。在多维度测量之前，每个样品通过离心分离为上清液（SNT）、浮游细胞（PC）和基质结合（SB）部分。

B 稳定的碳水化合物溶解（蓝色条）约为66.8%，随着固体负载的增加，底物溶解速率（红色圆圈）呈线性增加。30 g/L的数据在之前部分发表。数据表示了一个微生物组稳态条件下不同时间点的平均值（参见补充表2），误差线代表±一个标准偏差。总碳水化合物溶解的个体数据点（蓝色条）显示为每个固体负载的点（黑色圆圈）。碳水化合物溶解速率线性拟合线（红色虚线）基于碳水化合物溶解速率数据（红色圆圈），该数据是根据碳水化合物溶解数据（蓝色条）调整的，考虑到停留时间（以小时计）、柳枝稷总碳水化合物含量和柳枝稷装载浓度（分别为30、75、120和150 g/L）。

C 气体中甲烷含量（深绿色条）保持恒定，而气体产生速率（浅绿色加号标记）和甲烷产生（浅绿色交叉）与固体负载成比例增加。30 g/L的数据在之前部分发表。甲烷含量和气体产生速率的数据点是一个微生物组稳态条件下不同时间点的平均值（参见补充表2），所有误差线代表±一个标准偏差。气体中甲烷浓度（深绿色条）的个体数据点显示为每个固体负载的点（黑色圆圈）。甲烷气体产生率数据基于气体中的甲烷浓度和气体产生率。气体产生率（浅绿色虚线）和甲烷气体产生率（浅绿色点线）的拟合线均按线性拟合到数据。源数据作为源数据文件提供。

图 2 三种馏分中测出的 CAZymes 种类概览。

A 维恩图显示了三个馏分中量化的 CAZymes 的重叠情况。

B 每个馏分中定量的 CAZymes 在 CAZyme 类别（GH、CE、PL、GT、AA）中的分布情况，其链接显示了贡献的分类系统（上半部分）。产生小于 10 种 CAZymes 的门类被归类为 "其他"。

C 不同 CAZyme 种类的 CAZymes 总丰度趋势随每馏分固体负荷的增加而变化。对每个固体负荷与 30 克/升负荷进行双尾韦尔奇 t 检验，并进行 Benjamini Hochberg FDR 校正。+ 表示调整（adj.）p 值≤ 0.05，* 表示与各自的 30 g/L 条件相比，绝对折叠变化≥2×的调整 p 值≤ 0.05。各比较的精确 p 值列于补充数据 6。

D GHs 中各解构子类别的相对分布。数据以平均值 ± SD 表示（30 和 120 g/L 时 n = 4，75 g/L 时 n = 3，150 g/L 时 n = 5）。SNT 上清液、PC 浮游细胞、SB 底物结合、GH 糖苷水解酶、CE 碳水化合物酯酶、PL 多糖裂解酶、GT 糖基转移酶、AA 辅助活性。源数据以源数据文件的形式提供。

图 3 较高固体负荷下的 CAZyme 功能类别分析。

(左侧）如补充资料 3 所述，根据功能注释对不同 CAZyme 家族（GH、CE、PL）的独特 CAZyme 蛋白进行组织后的量化枚举。(右侧）热图描述了每种功能类别的 CAZymes 在每种馏分固体负荷下的总丰度变化。图中显示了各馏分与 30 g/L 固体的 Log2 差异。对每种固体负荷与 30 g/L 固体负荷进行双尾 Welch's t 检验，并进行 Benjamini Hochberg FDR 校正。+表示调整（adj.）p 值≤ 0.05，*表示与各自的 30 g/L 条件相比，绝对折叠变化≥2×的调整 p 值≤ 0.05。各项比较的精确 p 值见补充数据 6。SNT：上清液；PC：浮游细胞；SB：底物结合部分。源数据作为源数据文件提供。

图 4 细菌 AA6 蛋白的丰度与较高固体负荷的函数关系。

A 每个馏分中不同辅助活性（AA）家族表达的蛋白质数量。

B 每个馏分中 AA6 蛋白的总丰度在不同固体负荷下的变化（右 Y 轴，折线图），以及各门的相对丰度贡献（左 Y 轴，条形图）。误差带为 ± 标准偏差，* 表示双尾韦尔奇 t 检验校正 p 值小于 0.05，与各自 30 g/L 条件相比绝对折叠变化≥2×。

C 根据观察到的蛋白质丰度增加和已知功能提出的机理假设，描述了 AA6 蛋白质在较高固体负荷下通过 ROS 和 Fenton 化学作用实现增溶的作用。

D 每个馏分中已知对不同固体负荷的氧化应激有反应的蛋白质的平均趋势。细菌铁蛋白（Bfr；在 SNT、PC、SB 中分别为 18、23、20 个蛋白质）、超氧化物歧化酶（SOD2；15、11、7）和超氧化物还原酶（SOR；9、10、13）。所示为平均 Z 值，置信区间为 50%。+ 表示双尾韦尔奇 t 检验 p 值小于 0.05，* 表示 p 值小于 0.05 且与各自的 30 g/L 条件相比绝对折叠变化≥2×。各项比较的精确 p 值见补充数据 9。SNT：上清液；PC：浮游细胞；SB：底物结合部分。源数据以源数据文件形式提供。

图 5 微生物组在功能和空间上协调酶的表达，以在高固体含量下继续增溶。

A 在 150 克/升固体负荷下，与 30 克/升固体负荷下相比，三个馏分中主要酶类的总蛋白丰度的平均变化倍数（比率）。

B 这里显示的是每一类酶在各自馏分宏蛋白质组中所占的相对比例。定性描述了这些酶类别在三个馏分中的空间分布以及从 30 克/升到 150 克/升的分布变化。SNT：上清液；PC：浮游细胞；SB：底物结合馏分。源数据以源数据文件的形式提供。