体细胞胚胎发生（简称：体胚发生）是植物的体细胞在特定条件下，不经过性细胞融合而通过类似于合子胚发生的方式发育成完整植株的离体再生途径。这一技术方法被广泛应用于植物的种质资源保护与利用、优良品种选育与推广以及转基因和基因编辑育种技术构建等领域。迄今为止，研究者发现WUSCHEL（WUS）、BABY-BOOM（BBM）和LEAFY COTYLEDON1/2（LEC1/2）等多个转录因子单独过表达即可诱导植物全能性的表达并促进体胚发生，但潜在的分子调控模块和遗传通路仍不清晰。
近日，南京林业大学陈金慧教授课题组和德国弗莱堡大学Thomas Laux教授课题组在New Phytologist在线发表了题为“miR394 enhances WUSCHEL-induced somatic embryogenesis in Arabidopsis thaliana”的研究论文，发现miR394通过抑制其靶基因LCR的表达，促进了WUS介导的体胚发生。
图1. 拟南芥间接体细胞胚胎发生
作者以体胚发生能力较弱的Ler生态型为材料，通过构建LhG4/pOp二元表达系统，发现PLT2启动子单独异位表达WUS或者一起异位表达MIR394B和WUS，均抑制了体胚发生。但是，单独pOp:WUS能够促进体胚发生，说明了pOp启动子在没有LhG4的情况下出现了渗漏（leaky）表达，而这种WUS的渗漏表达正好处于一个适量的表达强度，作用于体胚发生的促进。同时，单独pOp:MIR394B不能促进体胚发生，但是pOp:MIR394B/WUS促进体胚发生的效果比pOp:WUS更好。这些结果表明，WUS对于体胚发生的促进可能具有剂量效应，同时miR394能够增强适量WUS所介导的体胚发生。
图2. miR394促进WUS介导的体胚发生
为了进一步验证关于WUS促进体胚发生具有剂量效应的推测，作者通过构建DEX/GR诱导表达系统，发现随着DEX处理浓度的增加，体胚诱导效率表现出先上升后下降的趋势，与预期相符。并且，通过过表达MIR394B或MIM394（靶标模拟）能够分别促进和抑制WUS介导的体胚发生。这些结果表明，WUS介导的体胚发生确实存在剂量效应，而且miR394对于适量WUS所介导的体胚发生是充分且必需的。
图3. miR394/WUS介导的体胚发生具有剂量效应
此外，本研究通过三步法进行拟南芥的体胚发生，作者进一步研究了miR394/WUS作用于体胚发生是否具有阶段效应。结果显示，miR394和WUS共表达在第一阶段（即由低浓度2,4-D处理的体胚发生早期阶段）对体胚发生的促进效果最为明显，而在后两个阶段的处理效果仅为第一阶段的1/3。因此，miR394和WUS作用拟南芥体胚发生具有阶段效应。
图4. miR394/WUS介导的体胚发生具有阶段效应
为了进一步解析miR394/WUS促进拟南芥体胚发生的机制，作者比较分析了野生型（Ler）、35S:MIR394B、35S:WUS-GR以及35S:MIR394B 35S:WUS-GR的转录组数据。结果发现，单独过表达miR394对全基因组转录水平影响不大，但当miR394和WUS共表达时，相比于单独过表达WUS增加了很多差异表达基因，且大多不同于WUS在茎尖分生组织中的靶基因和其他体胚发生中的差异转录基因。
图5. miR394增强体胚发生过程中WUS诱导的差异表达基因
同时，转录组数据显示miR394的过表达降低了其靶基因LCR的表达水平。进一步的试验结果显示，无论是LCR基因功能缺失突变（lcr），还是表达不受miR394靶向的LCR4m（pLCR:LCR4m），均表现出与Ler类似的体胚发生效率。但是，lcr 35S:WUS-GR的体胚发生效率要远高于单独的35S:WUS-GR，并且几乎不受MIM394的影响；同时，pLCR:LCR4m 35S:WUS-GR的体胚发生效率要远低于单独的35S:WUS-GR。这些结果表明，miR394通过靶向并干扰LCR基因的表达，从而增强适量WUS介导的体胚发生促进功能。
图6. miR394-LCR模块作用于WUS介导的体胚发生
南京林业大学林学院博士后鲁路为论文第一作者，南京林业大学陈金慧教授和德国弗莱堡大学Thomas Laux教授为论文的共同通讯作者。该研究得到了德国科研基金项目（DFG）、江苏省重点研发计划项目、江苏省“青蓝工程”、江苏省特聘教授项目、南京林业大学博士研究基金和江苏高校优势学科建设工程专项的联合资助。Reference:
Lu Lu, Anna Holt, Xinying Chen, Yang Liu, Steffen Knauer, Elise J. Tucker, Ananda Kumar Sarkar, Zhaodong Hao, Farshad Roodbarkelari, Jisen Shi, Jinhui Chen, Thomas Laux. miR394 enhances WUSCHEL-induced somatic embryogenesis in Arabidopsis thaliana. New Phytologist. 2023. DOI: 10.1111/nph.18801
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