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一、产品简介:
过氧化氢(H2O2)是重要的活性氧之一,不仅具有损伤生物大分子、产生细胞毒害的能力, 而且还可以作为信号分子, 在生物和非生物胁迫应激、细胞程序性死亡以及生长发育调控过程中起重要作用。它与钛盐反应生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀,可被浓硫酸溶解后,在波长415nm波长下有最大吸收峰。其颜色深浅与H2O2浓度成线性关系 。
二、试剂盒的组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入 4mL 水,涡旋振荡充分溶解,若有沉淀,可静置 10min(或更长时间)或转移至 2mLEP 管中 5000rpm 室温离心 5min,取上清液用于检测。 |
试剂二 | 液体5mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体23mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 液体×1支 | 4℃保存 | 10mmol/mL标准品母液 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪、可调式移液器、丙酮、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备:
① 组织样本:称取约0.1g组织,加入1mL丙酮,进行冰浴匀浆,转移至EP管中,用丙酮定容至1mL,8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞加入1mL预冷丙酮,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);用丙酮定容至1mL,8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测。
2、标准溶液的配制:把10mmol/mL(=10000μmol/mL)标准品母液用丙酮稀释成1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μmol/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (μmol/mL) |
Sx | 10000 | 4990 | 10 | 20 |
S1 | 20 | 940 | 60 | 1.2 |
S2 | 20 | 950 | 50 | 1.0 |
S3 | 20 | 960 | 40 | 0.8 |
S4 | 1.2 | 500 | 500 | 0.6 |
S5 | 0.8 | 500 | 500 | 0.4 |
S6 | 0.4 | 500 | 500 | 0.2 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至415nm。
② 操作表:
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用丙酮适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(μmol/mL)。
2、按照样本质量计算:
H2O2含量(μmol/g质量)=(x×V1) ÷(W×V1÷V)×D=x÷W×D
3、按细胞数量计算:
H2O2含量(μmol/104 cell)=(x×V1) ÷(N×V1÷V)×D=x÷N×D
4、按液体体积计算:
H2O2含量(μmol/mL)=x×D=x×D
V:加入提取液体积,1mL; V1:加入反应体系中样本体积,0.25mL;
W:样本质量,g; N:细胞数量,以万计;
D:稀释倍数,未稀释即为1。
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