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NC：应对干旱 细菌崩了 真菌依然很稳（纯网络分析发Nature子刊）
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应对干旱，细菌崩了，真菌依然很稳
Soil bacterial networks are less stable under drought than fungal networks
Nature Communications, [11.935]
doi.org/10.1038/s41467-018-05516-7
Published online 02 August 2018
第一作者：Franciska T. de Vries1
通讯作者：Franciska T. de Vries (email: franciska.devries@manchester.ac.uk)
合作作者： Rob I. Griffiths 2, Mark Bailey2, Hayley Craig1, Mariangela Girlanda3,4, Hyun Soon Gweon 2, Sara Hallin 5, Aurore Kaisermann1, Aidan M. Keith 6, Marina Kretzschmar5, Philippe Lemanceau7, Erica Lumini 4, Kelly E. Mason 6, Anna Oliver2, Nick Ostle8, James I. Prosser 9, Cecile Thion 9, Bruce Thomson2 & Richard D. Bardgett1
主要单位：
1 英国，曼彻斯特大学，地球与环境科学学院（School of Earth and Environmental Sciences, The University of Manchester, Oxford Road, Manchester, M13 9PT, UK）
2 英国，沃灵福德生态与水文中心（Centre for Ecology & Hydrology Wallingford, Maclean Building, Benson Lane, Crowmarsh Gifford, Wallingford, Oxfordshire, OX10 8BB, UK）
译者有话说
本文是一篇生态方面的文章，我是冲着这篇文章的网络进行学习的，这篇文章确实对网络进行了深入的探索，值得我进行深入学习，并且这篇文章对网络分析的流程基于R语言，同样符合我的分析习惯，这给我了无限的诱惑和动力。本文处理设置有时间梯度，结合细菌真菌网络通地上部植株进行关联，最后耦合氮循环。从小到大，以小见大。最终干旱改变植物，植物改变微生物，微生物反作用植物，一日干旱，便将地上地下相互影响持续很长时间。这与我所关注的土壤反馈，土壤记忆息息相关。辅助结论生成的重要分析还有结构方程模型。所以我将在之后的篇章中为大家揭示本文网络的魅力。
摘要
土壤微生物群落在生态系统功能中发挥着至关重要的作用，但目前尚不清楚微生物群落的共现性网络如何响应类似极端气候等环境扰动。由于微生物群落网络的变化可能会影响群落功能及其对逆境的敏感程度。因此，这方面的研究很重要，但是却存在很大欠缺。本文在草地生态系统的研究表明了干旱使得土壤细菌共现性网络更加不稳定，而且在土壤湿度恢复过程中，细菌群落的变化与土壤功能联系更加紧密。此外，干旱改变植被组成，导致土壤水分的减少，这些结果对细菌群落组成及其共现性网络有长远的影响。本文结果表明干旱影响土壤微生物群落，作为反馈土壤微生物群落也会影响地上部植被，最终地上地下协同抵抗干旱。这一发现为地上地下协同抗干扰的研究提供新的见解。
背景
土壤中有着及其丰富的微生物群落，并且对土壤功能有着重要影响。对于干旱等的极端气候条件，高度多样化的微生物群落是如何应对并恢复群落功能，是研究土壤功能的一个重要挑战。许多研究表明，极端气候，如干旱，往往会改变生态过程和植被演替，并对土壤微生物群落也产生一定的影响。研究表明，不同组成的微生物群落对干旱的反应不同，通常土壤真菌群落比细菌群落更稳定，但是适应性较差。此外，受干旱影响的植被对土壤真菌和细菌群落的恢复有着不同的调节作用，例如植物在干旱条件下，更多的减少对细菌群落的碳源供应，而不是真菌群落。虽然之前的研究对土壤微生物群落响应极端气候等干扰提供了重要的见解，但他们专注于土壤微生物群落中有限的特性和功能,而不是土壤中整个微生物共现性网络中大量微生物种类及其直接和间接的共现性关系。极端气候不仅可能重塑土壤微生物网络，而且他们在网络中的一些性质决定了他们对干扰的响应能力。
微生物生态网络在某种程度上表征群落中微生物之间的关系，并且越来越多的证据表明，生态网络的特性能够影响群落对极端气候等环境变化的响应。例如，一些理论研究推测,由弱相关性组成的网络比那些由强相关性的生态网络更稳定，网络中模块化和负相关关系的存在增加了网络在扰动下的稳定性。此外，通过模型研究表明，在食物网中增加几个强相互作用的关键点可以破坏食物网的稳定性。因此，如果群落中有很相当比例的微生物菌群是通过正相关联系在一起的，那么这个群落就被认为是不稳定的;在这样的群落中，菌群可能会对环境波动做出同步反应，从而产生正反馈和共同波动。负相关可以稳定群落随干扰的波动，促进网络的稳定性。目前，越来越多研究者在生态学研究中使用到了网络分析，但我们对微生物群落潜在的复杂相互作用，以及它们如何应对极端季候干扰，如何恢复了解甚少。
这里，我们研究了长时间的夏季干旱如何影响土壤真菌和细菌网络，以及这种响应是否与这些网络中的一些属性相一致。我们还检测了土壤细菌真菌群落响应干旱的过程是如何影响地上部植被的，以及植被响应微生物群落后会对土壤功能造成怎样的影响。相比于真菌群落，土壤细菌群落的抗逆性较差，但恢复能力很强，我们猜想：共现性网络的属性可以表征微生物群落稳定性，并且在干旱影响下，会更加明显表征细菌群落的波动。首先，我们预计细菌OTUs之间的相关性总体上要强于真菌OTUs，且在真菌网络中，负相关性所占的比例会更大。我们分别在细菌和真菌网络中使用所有可能的相关关系，包括弱相关和非显著相关，来验证这些假设。其次，我们猜想在共现性网络中，细菌共现性网络会包含更多的OTUs，而且这细菌网络中节点连接也更加紧密。第三，我们猜测细菌的正相关网络模块化程度比真菌低。我们使用仅包含显著正相关的共现网络测试了后两个假设。真菌和细菌群落的正相关关系可以代表一系列相互作用，也可以简单说这些具有正相关作用的微生物群体对环境干扰的响应是相似的。尽管我们需要谨慎，但共现性网络已经表明可以揭示微生物类群共同波动和群落稳定性的信息。第四，我们预计干旱引起的植被生长组成的变化可以和微生物网络的恢复联系起来，与真菌群落的联系将更加紧密，因为真菌是植物碳(C)投入根际的首批消费者。最后，鉴于土壤微生物群落与生物地球化学循环之间存在联系的证据，我们猜想干旱引起的真菌和细菌网络的变化将影响土壤功能。以上假设通过盆栽试验验证，实验设计包括均匀度不同的，生长习性截然不同草本植物组成:一种生长快速，营养耗竭型牧草(Dactylis glomerata)和草本(Rumex acetosa)，以及一种生长缓慢，资源利用保守型牧草(Anthoxanthum odoratum)和草本（Leontodon hispidus）。
- grass: 指一般的青草或牧草。
- herb: 指可供药用或生产食物调料用的草。
分别以四种植物中其中一种植物为支配种，并模拟不同均匀度的植物群落，设置三个不同均匀度的处理，低均匀度和中等均匀度和高均匀度（包含所有草本并且丰富度相同）（方法m见补充表1）。该实验设计模拟了一系列由干旱改变的植被群落，并用以评估这些植被群落对第二个生长季的干旱响应过程。然后，我们分别量化了植被群落、土壤细菌和真菌群落及其共现网络对干旱的响应，以及随着时间推移的温室气体(CO2和N2O植物和微生物的呼吸产物以及微生物的硝化和反硝化过程)的变化。
我们的研究结果表明，在一些重要的网络属性上，细菌和真菌群落显著不同，这可能是他们面对干扰群落具有不同稳定性的原因：相比于真菌群落，细菌群落更加不稳定性，且不稳定性受干旱影响。研究还表明干旱所导致生长速度较快的草本类型占据主导地位，并且会直接或间接的影响细菌群落及其共现性网络。这种影响可能是长期的，并且可能加剧了地上部植被类型的变化，使得地上部植被和地下微生物群落联合响应干扰能力受到影响。
结果
1. 细菌和真菌群落
Bacterial and fungal communities
真菌和细菌群落都十分稳定，但也会受到干旱的影响（图1）。在干旱时期真菌的丰富度和均匀度增加，但在恢复湿度一周后会迅速恢复到对照水平。于此不同的是，干旱降低了细菌的丰富度和均匀度，这一效果即使在恢复湿度一周后依然如此，最终持续了2个月。我们使用Bray-Curtis相似度来衡量细菌和真菌群落的恢复能力。当干旱处理和对照处理微生物群落之间的相似性显著低与干旱处理之前的群落时，认为微生物群落受到干旱的影响尚未恢复。当群落相似度之间没有显著差异时，认为群落未受干旱影响基本恢复。本研究发现，经历干旱处理的细菌群落同对照的相似度显著低于干旱前不同处理土壤细菌群落相似度，并且这一现象在干旱处理的各个阶段（干旱结束，恢复湿度一周）都十分相似，表明了干旱对土壤细菌群落的持续影响。与此相反的是，无是实在干旱发生的任何阶段，干旱组合对照组的真菌群落相似度差异要小得多。此外，相比于细菌群落，为响应干旱，真菌群落中有相当比例的OTUs相对丰度增加(图1a和补充图1)。
在细菌和真菌群落中，我们鉴定出高丰度的并受干旱影响指示OTUs(方法，补充图1)，并根据在干旱影响下这些OTU丰度上升还是下降，分为干旱敏感型和耐旱型指示OTUs。基于细菌群落，本研究在Verrucomicrobia菌门和Alphaproteobacteria菌纲中我们均发现了干旱敏感型和耐旱型指示OTU，在放线菌门（Actinobacteria）中发现了额外的一些干旱敏感型指示OTU。真菌群落中的耐旱型指示OTU属于子囊菌门Ascomycota和球囊菌门Glomeromycota门（补充数据2）。另外真菌群落中所有干旱敏感型OTU属于接合菌门Zygomycota，尤其是在其中的被包霉科Mortierellaceae。
图1. 细菌真菌群落对干旱的响应
Fig. 1 Bacterial and fungal community response to drought.
图1a 表示在干旱前，干旱结束，恢复湿度早期，恢复湿度晚期的群落的NMDS排序分析。除了开始，无论哪个阶段，干旱处理组合对照组群落均显著不同。
图1b 表示干旱处理组和对照组在不同干旱处理节点细菌群落丰富度变化情况，表明了干旱改变细菌群落丰富度，并且对细菌群落丰富度造成持续影响。
图1c 表明了干旱处理组和对照组在不同干旱处理节点细菌群落均匀度变化情况，表明了干旱改变细菌群落均匀度，并且对细菌群落丰富度造成持续影响。
图1d 表明了干旱处理组合对照组群落之间的相似度，表明在经历干旱后两组群落差异变大，在经历两个月湿度恢复之后两组之间差异之间才变小。
图1e 表示在干旱前，干旱结束，恢复湿度早期，恢复湿度晚期的对真菌群落的NMDS排序分析。除了开始，无论哪个阶段，干旱处理组合对照组群落均显著不同。
图1f 表示干旱处理组和对照组在不同干旱处理节点真菌群落丰富度变化情况，表明了只有在干旱结束时改变真菌群落丰富度升高，其余阶段真菌群落丰富度均与对照无显著差异。
图1g 表明了干旱处理组和对照组在不同干旱处理节点真菌群落均匀度变化情况。表明了只有在干旱结束时改变真菌群落丰富度升高，其余阶段真菌群落丰富度均于对照无显著差异。
图1h 表明了干旱处理组合对照组真菌群落之间的相似性，表明在经历干旱后两组群落差异有所增加，但是小于细菌处理组和对照组差异。湿度恢复之后两组差异逐渐缩小。
2. 细菌和真菌网络
Bacterial and fungal networks
在考虑所有相关性时，细菌OTUs之间的相关性始终强于真菌OTUs之间的相关性(图3，ANOVA;F1,18,778,692=5577,P<0.0001)，这与我们的预期相符，即细菌网络中的潜在相互作用强于真菌网络。 我们还发现真菌网络具有比细菌网络更少的负相关关系(**图3**,two-sided χ2-test of proportions; χ2 > 500 、 P < 0.0001 for fungal–bacterial control network pairs)。当我们只考虑具有显著相关性(ρ> 0.6,P<0.01), 我们依然发现真菌网络具有比细菌网络更少的负相关关系(two-sided χ2-test of proportions; χ2 > 10 、 P < 0.001 for all fungal–bacterial control network pairs)。在干旱结束时，细菌网络负相关数量减少，在干旱结束恢复两个月后真菌群落负相关减少(two-sided χ2-test of proportions; χ2 = 9.6, P = 0.002 、 χ2 = 9.5,P = 0.002, respectively)。
然后，我们保留网络中显著相关关系并构建只包含正相关的共现性网络。与真菌网络相比，细菌共现性网络更大、连接更紧密、模块化程度更低。并且在共现性网络中细菌OTUs的比例大于真菌OTUs(图2b)。相比于真菌网络，细菌共现性网络中的节点具有更高的度(该点的连接数同网络中全部的连接数标准化)和介数(通过一个节点边的数量)(图4、5)。细菌网络较低的聚集系数表明了细菌共现性网络模块化程度较低(ANOVA; F1,8 = 3.9, P = 0.08, 补充表 2)。随着时间变化，细菌网络中的相关关系具有较高的一致性，这表明了细菌OTU之间始终相似的相关关系(补充图2)。此外，干旱增加了细菌网络中节点的连通性和中心性，而降低了真菌网络中的这些属性(图2e)。当我们分析包括真菌和细菌的合并网络时，网络被细菌的节点所支配，并且这个网络表现出来的性质类似于单独细菌网络的性质(补充图3和补充表2)。
我们发现在细菌网络中，无论是干旱敏感型还是耐旱型指示OTU之间的联系比非指示型OTU更加紧密（图2f），而在真菌网络中，干旱敏感型OTU比非指标OTU更加集中并且连接度更高。特别地，在细菌干旱网络中高度集中一些耐旱型指示OTU分别是DA101和Candidatus xiphinematobacter（Verrucomicrobia）和Rhodoplanes（Alphaproteobacteria）（补充数据1）。我们还发现在干旱网络，细菌网络OTUs的中心性(介中心性)和连接性（节点度）与它们的相对丰度呈正相关，但这一现象仅仅出现在干旱处理组网络中。(湿度恢复两个月后网络的中介性回归分析; R2 = 0.016, P = 0.0002, df = 884; 干旱早期和湿度恢复晚期标准化度的回归分析：R2 = 0.037,P = 0.0002, df = 367; R2 = 0.010, P = 0.002, df = 884)。与此相反的是真菌网络中心性和连接性同OTU的相对丰度具有很强的正相关关系却表现在对照处理中。在试验模拟干旱之前，利用对照组的真菌网络和干旱的细菌网络中的OTU丰度均可预测网络的连通性。(regression; R2 = 0.37 and P < 0.0001, df = 86 and R2= 0.22 、P < 0.0001, df = 111, respectively）。
对于大多数细菌网络，OTU相对丰度与其对干旱响应能力呈显著负相关。这表明，OTUs丰度越高对干旱的响应越强(干旱组合对照组回归分析; R2> 0.01 、 P < 0.001 ; 湿度恢复一周的回归分析：R2 = 0.024 、 P = 0.003）但是真菌网络中不存在这样的现象。
图2. 共丰度网络中OTU的相对丰度比例
Fig. 2 Relative abundance and proportion of total bacterial and fungal OTUs included in co-occurrence networks.
图2a 干旱处理组真菌OTU在干旱结束后显著上升。
图2b 表示干旱处理不同阶段细菌网络和真菌网络中包含的OTU数量的变化情况，表明了细菌网络OTU变化大于真菌网络。
图3. 细菌和真菌网络的频率分布
Fig. 3 Frequency distributions of correlations in fungal and bacterial networks.
图3a 这是干旱不同阶段的微生物网络对相关性进行统计后的频数分布图。黑色为真菌，灰色为细菌.
图3b 干旱和对照处理在不同阶段的网络中负相关取绝对值同正相关共同统计频数分布。
图4. 细菌的真菌共存网络受干旱胁迫时间上变化
Fig. 4 Bacterial and fungal co-occurrence networks over time as affected by drought.
图4a. 受干旱影响的细菌随时间变化的的共现性网络，受干旱影响，细菌网络变得非常稀疏，直到干旱恢复后期网络才逐渐变得复杂。
图4b. 受干旱影响的真菌随时间变化的的共现性网络。真菌网络无论是否受干旱影响，网络复杂程度变化不大。表明了受干旱影响真菌网络稳定性很好。
图5. 细菌和真菌的连接度和中心性
Fig. 5 Node connectedness and centrality of bacterial and fungal networks.
a/b,e/f 相比于真菌网络，在细菌网络中干旱增加了网络连通性和中心性，真菌的这些网络属性变化不大。
c/d,g/h 细菌网络中，无论是干旱敏感型还是耐旱型指示OTU的度比网络中其他节点的度更大。表明了干旱指示OTU与其丰度密切相关。
3. 植物和微生物群落特性之间的联系
Links between plant and microbial community properties
干旱对植被造成极大的改变（图6a–d）。与其他植物相比，生长速度较快的D.glomerata的生物量显著增加，这是造成对照植物群落与干旱植物群落差异的主要原因（图6e,f）。在干旱恢复晚期（也就是恢复湿度两个月后），进行评估D.glomerata生物量与细菌和真菌群落网络属性（度和中介性）和OTU之间的关系。发现在细菌网络中，D.glomerata生物量与OTUs的网络属性显著相关，且这一现象在细菌网络中更强（图7）。此外，当网络节点更加集中连接性更高的时候，这些节点与D.glomerata的相关性会增强，表明这些节点可能是潜在的关键微生物群体（图7）.我们还发现，细菌群落对干旱的恢复力(恢复力使用bray-curtis相似性表示)与植物群落的恢复力有关，但真菌群落却没有这样的现象（图 6g, h）。
通过构建结构方程模型(SEM)，我们进一步推断了植物群落变化影响真菌和细菌群落组成的潜在机制，以及参与反硝化和N2O还原等相关功能的情况(补充图4及补充注1)。我们发现，D.glomerata生物量的增加与细菌群落组成直接相关。其次，D.glomerata通过增加了地上部生物量并增强了蒸腾作用，致使了土壤水分含量降低，从而间接影响了真菌和细菌群落(图4)。nir和nosZ基因分别为硝化抑制和氧化亚氮还原的指示基因，其丰度不能通过植物群落组成的变化来预测。令人惊讶的是，我们观察到D.glomerata植株地上生物量的增加降低了土壤无机N的有效性，但土壤无机和有机可溶氮、可溶性有机碳含量与细菌和真菌的群落组成无关(回归分析： R2 = 0.09, P = 0.010)。
图6. 干旱对植物群落的效应，及植物群落与微生物群落间的关系
Fig. 6 Drought effects on plant community composition and the relationship between changes in plant community composition and microbial community composition.
a-d 不同阶段植物地上部重量统计。干旱对植被组成和总生物量均造成极大的改变。
e 恢复湿度两个个月后干旱处理组同对照组PCA分析表明两组差异明显，并且这个差异同植物类型的改变相关；
f 表明生长速度较快的D.glomerata的生物量显著增加，这是造成对照植物群落与干旱植物群落差异的原因。
g-h 表明相比于真菌群落，植被群落恢复后更多的影响土壤细菌群落组成。
图7. 干旱恢复晚期D. glomerata生物量同网络属性的相关关系
Fig.7. Relationship between network properties and correlation with D. glomerata biomass at the late recovery sampling time point.
在湿度恢复两个月后的网络属性以及与D.glomerata生物量的相关性。发现细菌网络D.glomerata同网络度和中介性之间有强烈的相关性。真菌相关性较弱。
图8. 干旱恢复晚期模拟植被群落特征，微生物群落特征，以及D. glomerata生物量的结构方程模型
Fig. 8 Structural equation model of relationships between D. glomerata biomass, plant community attributes and microbial properties, at the final, late
recovery sampling.
在群落恢复后期（也就是恢复湿度两个月后）建立了D.glomerata生物量、植物群落属性与微生物网络之间关系的结构方程模型。表明了D.glomerata生物量的增加与细菌群落组成直接相关。其次，D.glomerata通过增加了地上部生物量并增强了蒸腾作用，致使了土壤水分含量降低，从而间接影响了真菌和细菌群落。
4. 与生态系统功能的联系
Links with ecosystem functioning
我们构建一个SEM（结构方程模型）来评估干旱对土壤功能的直接和间接影响(补充图5和补充注2)，评估植物群落组成、微生物群落和CO2和N2O之间的关系。通过多个结构方程模型来寻找这些指标在干旱及其恢复后是如何变化的。我们发现干旱通过改变土壤水分强烈而直接地影响着干旱后期真菌和细菌的群落组成。而植物群落组成仅仅直接影响细菌的群落组成（图9）。真菌和细菌群落组成均与生态网络呼吸速率无关，但细菌群落组成与nir基因的丰度有关。在恢复湿度一周后，细菌群落组成与生态系统呼吸速率和N2O的产生直接相关，并且可以通过与nosZ基因丰度的关系与N2O产生间接相关。
与假设相符的是，在湿度恢复一周时，nir基因的丰度与N2O释放量正相关，而nosZ基因丰度与N2O排放量负相关。在结束干旱两个月后，群落的nir和nosZ基因丰度同氧化亚氮排放相关性(图9)消失。并且此时无论是否经历干旱，nir基因和nosZ基因丰度变化如何，所有生态过程均恢复到了对照水平(补充图6)。nosZ cladeI控制N2O还原，说明本实验通过完全的反硝化过程抑制N2O，而不是其他非反硝化的途径。我们没有发现细菌和古细菌的氨氧化基因丰度与N2O排放之间有任何关系(补充图8 干旱影响amoA g基因丰度）。
图9. 各个采样时期模拟植被群落特征，微生物群落特征，以及D. glomerata生物量的结构方程模型
Fig. 9 Structural equation model of relationships between plant community attributes, microbial properties and ecosystem functioning for each sampling.
植物群落属性、微生物特性和生态系统功能之间关系的结构方程模型。对于每一个显著关系，在箭头旁边给出标准化系数和P = values，箭头的权重与R绝对值成正比。与我们理解相一致的是二氧化碳排放主要和植物相关。在干旱恢复早期二氧化碳的排放同时还和细菌微生物群落活动相关，同时值得注意的还有细菌群落活动和nosZI等增加使得氧化亚氮的排放增加。
讨论
我们的研究结果表明了地下微生物网络对干旱具有即时和延迟响应，并强调了植物群落组成在控制这种响应方面的作用。我们发现土壤细菌和真菌群落组成的网络具有不同的网络属性，对干旱的反应也不同，干旱对细菌的影响要比真菌网络大得多。
我们还发现，干旱引起的植被组成变化与细菌微生物群落网络之间有着长期的联系，并强烈地控制着它们的恢复，但干旱对真菌网络和群落的影响要小得多。细菌共现网络的特点是在干扰下稳定性较差，如高连通性、中心性和较低的模块性，而真菌网络具有较高的稳定性。在细菌网络中，无论是对于干旱敏感还是耐旱型OTU，只要是响应干旱的指示OTU都是高度集中和相互关联的(图5)，这表明它们可能驱动了所观察到的干旱引起的细菌网络变化。Rhodoplanes 和 DA101作为细菌网络中的核心指示OTU在普通土壤中非常丰富，尽管对它们的生态作用知之甚少。然而，它们的耐旱性可能是它们在各种环境条件下保持优势的结果。
干旱引起植物群落组成的长期变化与细菌菌群及其网络密切相关。一直以来认为真菌群落对植被变化的反应比细菌群落更灵敏。我们的结果也证明了这一点，真菌是植物向地下输入C源的第一级消费者。然而，我们的发现指出了一种新的机制，地上部植被群落变化通过改变土壤含水量，影响土壤微生物群落的重组。干旱增加了快速生长型草本D.glomerata的丰度，导致地上总生物量的增加，从而使蒸腾作用增加，致使土壤中的水分含量减少。D.glomerata的增加可能是由于该草本对干旱的耐受性，以及在环境恢复湿度时能快速利用活化的氮素，导致其在其他三种草本中占据支配地位。SEM(图8)显示，甚至到干旱结束后2个月，植物群落引起的土壤水分变化对细菌和真菌群落组成都有影响，但只有细菌群落组成直接受到D.glomerata生物量的影响。这与我们的假设相符，在细菌网络中，D.glomerata的生物量与核心并且度较高的的OTU相连接，而在真菌网络中没有类似关系。此外，无论迅速降低湿度还是缓慢降低湿度对细菌群落的影响都大于真菌群落。因此，干旱可以通过调节快速生长型草本的优势地位，对土壤微生物群落造成长期的影响。这种情况可能是普遍的，因为在干旱之后经常出现大量快速生长型草本增加的现象，有助于维持草地的生产力。虽然这些植物介导对土壤微生物群落的遗产效应并没有长期改变土壤功能，但相关研究显示，它们对D.glomerata的生长起到了正的反馈作用，从而潜在地增强了其优势地位。因此，干旱引起的土壤微生物群落的变化有可能对植物群落组成产生影响，在这种影响为正反馈，促进D.glomerata增加，可能导致植物群落组成的长期改变。
土壤细菌群落不仅很大程度上受干旱影响，而且还受植被变化的直接和者间接的影响，与此同时细菌群落与CO2和N2O含量之间有更强的关系。和预期相同的是，细菌群落预测了nosZ基因丰度的变化。同时，N2O的排放量和反硝化基因(nir和nosZ clade I)丰度在恢复湿度后一周后急剧增加。
这些动态结合在结构方程模型中的对氧化亚氮较低的解释共同表明了：在恢复湿度后无机可用态氮增多，充足的氮导致反硝化菌的反硝化构成不够彻底，使得氧化亚氮排放增多。但是随着氧化亚氮排放，可用氮含量不足，又促进了反硝化菌完全硝化过程，导致氮气排放量增多。
这就解释了为什么反硝化基因丰度在最终取样时仍然很高，而N2O的产量却回到了对照水平（也就是说是因为变成氮气啦）。我们的观察结果与之前的研究结果相反，之前的研究表明，干旱降低反硝化基因或者对反硝化基因丰度没有影响。此外，我们发现干旱的间接影响可以增加反硝化和氨氧化基因的丰度，潜在地调用氮循环微生物群落对第二次干旱后增加的氮有效性作出响应。我们结果对理解土壤复杂的微生物群落如何应对极端气候等干扰具有重要意义。虽然预测的细菌和真菌相互作用的确切性质仍然未知，但我们的数据表明，干旱加剧了细菌共现性网络的波动。我们还揭示了干旱引起的植物群落组成的变化与细菌群落、细菌网络的变化以及干旱结束后很长时间内反硝化和氧化亚氮还原基因的相对丰富度之间的重要联系。这些发现表明，细菌群落可能不像以前认为的那样具备恢复力，干旱导致的植被变化可能会对土壤细菌群落产生长期的影响，这种影响会对植物群落组成、以及同地下微生物群落的抗干扰的能力产生潜在影响。
译者有问：
- 文中假设真菌群落负相关关系会多于细菌，显然结果与假设相反。作者对这方面的讨论较少。细菌OTU本来就比真菌多，所以细菌网络中包含更多的OTU，更多的正相关或者负相关关系。这个是否是普遍现象，而非与干旱有关。
材料方法
实验装置和土壤及温室气体分析
本实验使用草地土壤表层土，采集自在Hazelrigg实验站, Lancaster大学(54°1′N, 2°46′W, 94 m a.s.l) 英国，土壤性质：pH 6.2, C N 含量分别为 3.13 和 0.25 g kg−1。实验布置区域年平均降雨量为1092毫米，年均温为9.3摄氏度（数据来自1966年以来的监测数据）。
于2012年开展试验，将土壤混匀去除石子和碎根后装入42 L的盆中，共装72盆。每盆种植36棵植株。模拟植物群落包含四种植物类型，按照不同均匀度和优势物种设置九个不同的模拟植物群落。植物群落被培养了两个生长期，在第二个生长期2013年5月至7月，通过在花盆上放置透明的雨罩，设计了一个模拟百年干旱事件的极端干旱的实验。所有处理重复4次。利用当地气象资料(1967-2008)拟合了Gumbel I分布，使之符合当地生长期的年度极端干旱持续时间。
在试验干旱期间，6月、7月和8月的降雨量分别为75.6毫米、84.9毫米和131.1毫米(实验期间的日降雨量和气温数据见补充图12)。所有的处理在干旱的几周内，每2天补充700毫升额外的水(相当于0.5毫米的降雨量)。在植株地上部长起来后和将要模拟干旱之前将地上部修剪至4cm，以模拟放牧；在每个阶段（模拟干旱开始，干旱结束，恢复湿度一周，恢复湿度两个月）迅速对土壤采样和气体分析。土壤样品每个盆取五个点，混匀后保存在-80°。CO2使用便携式红外气体分析仪（EGM4，PP系统）测定。氧化亚氮使用密闭的空间按照时间抽气并使用气相色谱测定。植株地上部重量测定采用将植株剪至4cm，在70度烘干称重。每盆打土柱的直径为3厘米，长10厘米。每盆打三柱并存放到4°用于土壤溶解碳氮等测定。
测序数据的生物信息学和统计分析
细菌序列处理过程
- 序列拼接使用PEAR；
- 质控使用DASTX工具；长度截取至少300bp以上；
- 接头等序列使用BBtool工具去除；
- 嵌合体鉴定的去除使用vsearch。这里使用有参去除嵌合体，数据库使用的gg13.8；
- 使用VSEARCH_CLUSTER按照97%聚类，并去除单克隆。
- 使用RDP分类器进行序列注释，但注释数据库使用的是gg13.5，bootstrap值设置到0.8。
真菌序列处理过程
- 真菌序列处理使用 PIPITS，参数设置参照参考文献
- 其他过程和细菌类似
- 注释和嵌合体去除使用的UNITE数据库；
- 基于OTU表格的分析在R中进行
对细菌和真菌OTU表格数据的后续分析包括排序，差异分析等。
细菌和真菌网络分析
- 参与网络构建的OTU挑选至少在八个样品中存在的OTU；
- 全部网络分析均在R中完成，使用igraph包；代码可用 https://github.com/ryanjw/co-occurrence
- 构建Spearman相关网络，选择相关系数大于0.6以上的，P值选择小于0.01以下的；
- 网络模块分析使用代码：edge.betweenness.community function
- 计算聚集系数使用betweenness function
- 计算节点连通性使用degree function
总结，总之相比于随机网络，细菌真菌网络菌显著不同。网络可视化使用的igraph包。
数据代码可用
网络分析代码改编自 https://github.com/ryanjw/co-occurrence 大家可以阅读
这是两份扩增子测序数据：ERP109485(真菌扩增子) ERP109472 (16S扩增子)
关于网络分析部分的代码本人已经做了一个运行，这里主要学习作者关于网络合并的相关运算，也就是不同网络之间共有关系，特有关系的表征。同时本文的网络构建过程基于R语言，考虑到了物种之间的双零情况，设置群落中OTU少于1不进行运算。只有当两个OTU或者不同分类等级的物种数量大于1时，才进行相关关系的运算。这一点在之前我是通过将OTU表格按照样品分开后再次进行过滤得到。显然这里向我展示了另外一种做法。
代码如下：
library(vegan)
library(reshape)
setwd("./data")
### 使用order等级门类做网络分析
comm.data<-read.csv("total_order_info.csv");head(comm.data)
comm.data<-comm.data[,-1]
dim(comm.data)
##去除read数目小于1407的样品
comm.data.read<-subset(comm.data, reads >= 1407)
dim(comm.data.read)#发现就剩下140个样品了
#抽平，将序列数目全部抽为1407条
comm.data<-cbind(comm.data.read[,c(1:4)],rrarefy(comm.data.read[,-c(1:4)],1407))
##选择需要的处理
trts<-as.vector((unique((comm.data$rep))))
trts<-trts[-c(4,5)]
results<-matrix(nrow=0,ncol=7)
options(warnings=-1)
### 网络构建主函数
#网络构建要忽略双0的情况，这里将物种丰度count数目小于1的相关忽略，方式假阳性。
#结果保存为igraph识别的邻接矩阵形式
#将全部分组的网络保存在一份表格中
for(a in 1:length(trts)){
#pull the first element from the vector of treatments
trt.temp<-trts[a]
#subset the dataset for those treatments
temp<-subset(comm.data, rep==trt.temp)
#in this case the community data started at column 6, so the loop for co-occurrence has to start at that point
for(b in 5:(dim(temp)[2]-1)){
#every species will be compared to every other species, so there has to be another loop that iterates down the rest of the columns
for(c in (b+1):(dim(temp)[2])){
#summing the abundances of species of the columns that will be compared
species1.ab<-sum(temp[,b])
species2.ab<-sum(temp[,c])
#if the column is all 0's no co-occurrence will be performed
if(species1.ab >1 & species2.ab >1){
test<-cor.test(temp[,b],temp[,c],method="spearman",na.action=na.rm)
rho<-test$estimate
p.value<-test$p.value
}
if(species1.ab <=1 | species2.ab <= 1){
rho<-0
p.value<-1
}
new.row<-c(trts[a],names(temp)[b],names(temp)[c],rho,p.value,species1.ab,species2.ab)
results<-rbind(results,new.row)
}
}
print(a/length(trts))
}
head(results)
results<-data.frame(data.matrix(results))
names(results)<-c("trt","taxa1","taxa2","rho","p.value","ab1","ab2")Reference
Franciska T. de Vries, Rob I. Griffiths, Mark Bailey, Hayley Craig, Mariangela Girlanda, Hyun Soon Gweon, Sara Hallin, Aurore Kaisermann, Aidan M. Keith, Marina Kretzschmar, Philippe Lemanceau, Erica Lumini, Kelly E. Mason, Anna Oliver, Nick Ostle, James I. Prosser, Cecile Thion, Bruce Thomson & Richard D. Bardgett. Soil bacterial networks are less stable under drought than fungal networks. Nature Communications. 2018, 9: 3033. doi:10.1038/s41467-018-05516-7
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