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CRISPR基因编辑技术的显然性分析
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在《CRISPR 基因编辑技术及张锋的贡献 》一文中，我介绍了Charpentier、Doudna以及张锋的工作。2011年前，科学家们发现了 Cas9 蛋白与记载病毒识别码的定位RNA（crRNA ）。2011年 Charpentier 发现了酿脓链球菌 （Sp菌）内CRISPR-Cas9 系统的 tracrRNA （启动RNA），但未能完全确定其功能。紧接着，张锋开始研究用 Cas9 + crRNA + tracrRNA 进行真核细胞内的基因编辑研究，并在2012年1月申请 NIH 资助（后获得批准）；2012年6月，Doudna 与 Charpentier 发表CRISPR-Cas9 论文，成功在细胞体外的实验中实现用 crRNA + tracrRNA 以及两者的组合体 chimera RNA 进行基因编辑；2013年1月，张锋发表论文，成功用两种方法在真核细胞内进行基因编辑。
张的第一种方法是把 Sp菌的原核自然机制移植到真核细胞。这个方法完全基于 2011年 Charpentier 的论文的发现 （tracrRNA）（注一）。原核细胞的环境跟真核细胞不同，关键差别是真核细胞的遗传物质在细胞核内，外面有层膜包裹着，较大的蛋白质分子进不了细胞核。张锋通过实验，发现用两个 NLS 能使优化后的 Cas9 蛋白 ( human-codon optimized Sp Cas9 --- hSpCas9) 进入人类细胞核。pre-tracrRNA 也有长短不同的版本。张发现，长版本 (171nt) tracrRNA 在真核内基本不工作，那个短版本（89nt）则可行。张实验最终确定的系统在真核细胞编辑效率相当高。至此，张的成果完全不依赖于 Doudna 2012年6月发表的论文，而是按照张2012年1月12日的NIH项目申请。如下图
张的上述项目获得 NIH 2012年的两百多万美元的资助（NIH grant R01-DK097768-01）。根据丛乐的实验记录，张锋实验室在2012年 Doudna 论文发表之前就已经成功运用 CRISPR-Cas9 完成了真核细胞的基因编辑。对比上图（2012年1月的经费申请）与下图张2013年论文中实验成功的设计，注意后者Ｃas9 两端都装上了 NLS，但其余部分是基本相同的。
其实 crRNA 与 tracrRNA 的双 RNA 系统（也是自然系统）非常巧妙、灵活，同一个 tracrRNA 可以跟不同的 crRNA 结合启动 编辑功能。如果 Sp 菌曾被5种病毒入侵，那么其CRISPR 区域里会有5个不同的识别序列生成5种 crRNA，但只有一个 tracrRNA就够了。张锋上面的设计图就画了三个不同的基因编辑点--注意看三个菱形之间的线段，分别为黄、率、水红色，表示针对三个编辑点，但 tracrRNA 只有一个。张的论文中也确实实现了用一个 tracrRNA 多点同时编辑。
没有经验的程序员会重复同样的代码，熟练的知道代码要 re-factorization。 在计算机编程里，把不同功能的部分分开叫做 separation of concerns 。从这个角度看，把 crRNA 与 tracrRNA 连接起来组成一个 chimera 分子其实是一种不灵活的方式，除非有其他优势（如效率）是不应该采用的。张锋的论文也对 Doudna 论文中提出的 Chimera RNA （在Doudna 论文中又称 single guide RNA -- 单分子导引RNA）进行了测试。张发现使用 Doudna 论文中的较长的chimera A 效率远远低于双RNA系统， 较短的chimera B 则完全不工作 。
与张的论文同一天发表的还有哈佛大学的 George Church的论文。Church的论文参考 Doudna 论文，使用是单分子的 chimera RNA 成功编辑了人类细胞基因。与Doudna 论文中的 chimera A 相比，Church 使用的 chimera 大大加长了。
张锋论文的第一作者是BROARD研究院的丛乐。丛有两个导师，一个是张锋，另一个正是 George Church。张与Church 之间分享 CRISPR 研究信息是很自然的事情。
根据这个2014年1月介绍 Doudna 的专题报道，她在试图将 CRISPR 技术应用于人类细胞时遇到了很多困扰（many frustrations）。“但是她知道如果成功了，CRISPR将是一个重大发现”。她回忆道，有一天她接到了 Church 的电话：“CRISPR is turning out to be absolutely spectacular in [Harvard geneticist] George Church’s hands.” 【He had even gotten it to work in human cells. Thrilled, Doudna immediately contacted Church. They shared their results, and both published studies in January 2013 showing that CRISPR can cut, delete and replace genes in human cells. 】在 Doudna 2013 年发表在 eLife 的论文中，她感谢 Church 提供了未发表的数据。
有人可能说，张锋在 Cas9 上装两个 NLS 以及其他技术手段等等，这不是显然的吗？
哥伦布发现新大陆后，有人贬低他说这有什么，继续往前走走谁都行。哥伦布拿了个鸡蛋，问谁能把它在桌子上立起来，结果在场的人都做不到。这个故事我就不必重复了。大部分东西别人做出来之后，总可以说显然。
或许，前人的失败可以作为不那么显然的证据。
注一：Charpentier 2011年论文中还提到了一个称为 RNase III 的蛋白。张锋的组合实验发现这个蛋白对于基因编辑是不必要的。
https://m.sciencenet.cn/blog-684007-1003901.html
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