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过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒说明书 (货号:NM-W-0106 微量法 100T/96S)

已有 221 次阅读 2024-5-22 16:57 |系统分类:科研笔记

一、产品简介:

过氧化氢(H2O2)是重要的活性氧之一,不仅具有损伤生物大分子、产生细胞毒害的能力,而且还可以作为信号分子,在生物和非生物胁迫应激、细胞程序性死亡以及生长发育调控过程中起重要作用。它与钛盐反应生成过氧化物钛复合物黄色沉淀,可被浓硫酸溶解后,在波长415nm波长下有最大吸收峰。其颜色深浅与H2O2浓度成线性关系 

二、试剂盒的组分与配制:

试剂名称

规格

保存要求

备注

试剂一

粉剂×1

4℃保存

临用前加入 4mL 水,涡旋振荡充分溶解,若有沉淀,可静置 10min(或更长时间)或转移至 2mLEP 管中 5000rpm 室温离心 5min,取上清液用于检测。

试剂二

液体5mL×1

4℃保存

试剂三

液体23mL×1

4℃保存

标准品

液体×1

4℃保存

10mmol/mL标准品母液

三、需自备的仪器和用品:

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪可调式移液器、丙酮蒸馏水和冰

四、操作步骤

建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!

1、预实验样本制备

组织样本:称取约0.1g组织,加入1mL丙酮,进行冰浴匀浆,转移至EP管中,用丙酮定容至1mL8000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10的比例进行提取

细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞加入1mL预冷丙酮,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);用丙酮定容至1mL8000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~10001的比例进行提取

 液体样本:直接检测

2标准溶液的配制:10mmol/mL=10000μmol/mL)标准品母液丙酮稀释成1.21.00.80.60.40.2 μmol/mL的标准溶液备用。

编号

稀释前浓度(μmol/mL

稀释液体积(μL

标准液体积(μL

稀释后浓度

μmol/mL

Sx

10000

4990

10

20

S1

20

940

60

1.2

S2

20

950

50

1.0

S3

20

960

40

0.8

S4

1.2

500

500

0.6

S5

0.8

500

500

0.4

S6

0.4

500

500

0.2

3、预实验上机操作:

酶标仪预热30min以上,调节波长至415nm

操作表

试剂名称(μL

测定管

标准管

空白管

样本

250

-

-

标准溶液

-

250

-

丙酮

-

-

250

试剂一

25

25

25

试剂二

50

50

50

充分混匀,12000rpm25℃离心10min弃上清,留沉淀

试剂三

250

250

250

加入试剂三溶解沉淀后混匀,若有沉淀产生,12000rpm25℃离心2分钟即可。取200μL上清液转移至96孔板中,于415nm处读取吸光值A分别记为A测定、A标准、A空白计算ΔA测定A测定-A空白ΔA标准A标准-A空白。注:空白管只需测定1-2次。

4、正式实验:

 预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本丙酮适当稀释后再进行测定低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定并将改变后的DW代入公式计算;

 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;

正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。

五、结果计算:

1以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到xμmol/mL

2、按照样本质量计算:

H2O2含量(μmol/g质量)=(x×V1) ÷(W×V1÷V)×D=x÷W×D

3、按细胞数量计算:

H2O2含量(μmol/104 cell)=(x×V1) ÷(N×V1÷V)×D=x÷N×D

4、按液体体积计算:

H2O2含量(μmol/mL)=x×D=x×D

 

V加入提取液体积,1mL;           V1加入反应体系中样本体积,0.25mL

W样本质量,g;                    N:细胞数量,以万计;

D稀释倍数,未稀释即为1

 



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