如今在生物物理领域，"Single Molecule"是赫赫有名，今天忽然意识到好多东西我都只知道英文怎么叫而不知道其中文翻译，就查了一下，所幸还找到了一些中文资料。就稍微整理一下，以备不时之需吧。下面绝大部分内容来自Reference 1。

        单分子光谱，顾名思义，就是单个分子的光谱，实际上通常是对单个生物分子动态行为的光谱分析。那么为什么要进行生物单分子光谱的研究呢？因为在普通的光谱技术中，实验中探测到的是大量分子的综合平均效应，得到的是系综的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而单分子光谱研究可以排除系综的平均效应，有利于复杂环境中同种分子不同行为的分析，通过对体系中的单个分子进行研究从而得到单分子体系的动力学过程，例如可以实时了解生物大分子构象变化的信息；可以观察微环境对单分子体系的影响，从而得到与分子微环境相关的信息。

        目前主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子轨迹追踪等。下面主要简单介绍一下大名鼎鼎的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)，以及荧光标记物。

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)

        荧光共振能量转移是指当两种不同的荧光生色团离的较近，且其中一种生色团（供体, donor）的发射谱与另一种生色团（受体, acceptor）的激发谱有相当程度的重叠时，当供体被激发时，受体会因供体激发能的转移而被激发。其直观表现就是供体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随它们荧光寿命的相应缩短和延长。能量转移效率与两个生色团激发谱和发射谱的重叠程度、供体与受体跃迁偶极的相对取向、供受体间的距离有密切关系，其经典公式为E=R06/(R6+ R06), R0为能量传递达到50%的距离。选定供、受体对之后，可将R0看作恒量。能量转移的发生将改变供、受体的去偏振程度、荧光寿命、荧光强度等，测定这些参数值就可得出E。利用R0和实验测得的E就可测得供受体间的距离R。用此方法测量生色团距离的方法被称为光谱尺，可测量1.0-10.0nm之间的距离。 Single pair FRET是在一个生物大分子或两个相互作用的分子上标记两个不同的荧光基团。同样，当供体的发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时，发生共振能量转移。通过探测能量转移效率，就可确定两点间的距离。由于相对取向和光谱重叠积分等不确定因素，该方法不能准确确定绝对距离。但可通过监测供体-受体的相对距离变化，结合其时间变化推测生物大分子在生命活动中的构象变化。该技术不仅有非常好的静态定位能力，也能提供分子内或分子间两个荧光基团在距离和方向上的动态变化。由于每次只观察一对供、受体系统，因此能在毫秒时间尺度内观察这些变化，从而将具有不同能量转移效率的亚群分开。将这种方法扩展，可用于研究生物多聚体的组成动力学、DNA限制性内切酶酶切反应，以及DNA发夹结构的去折叠等。

        技术上单分子荧光探测必须满足两个基本要求，一是在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用；二是要确保单分子的信号大于背景的干扰信号。背景信号来自于Raman散射、Rayleigh散射、溶剂中杂质、盖玻片产生的荧光和探测器的暗电流。因此，进行单分子探测要求 (1) 激发容积要小，因为背景的吸收与激发体积成正比，尽量减小激发体积可降低背景干扰，（2）高效的收集光学系统，（3）灵敏的探测器，（4）采用针孔装置，或将溶剂中杂质预漂白以及用低荧光光学材料等方法清除背景荧光。常用的装置是近场光学扫描显微镜(near-field scanning optical microscope NSOM)，其最小激发体积小于10-2µm3。该方法在单分子荧光的探测中发挥了很重要的作用。可监测单个生物大分子的构造变化，例如旋转和纳米水平上的距离变化。其不足是扫描时需要通过复杂的控制系统来保持适当的样品与探针之间的距离，并且其近场激发对所研究的生物体系有微扰作用，给研究带来许多限制。 共聚焦激光扫描显微镜(Confocal scanning optical microscope CSOM)，也是常用装置之一。在其光学设计中，激光束经物镜聚集到样品上形成一个接近衍射极限的光斑，利用同一物镜收集样品反射回的光，经一个共焦小孔后被探测器接收，而非焦面的光则被小孔滤掉，从而保证了良好的光学收集效率和高信噪比。探测器是单分子荧光检测的关键部分，常用的探测器是超敏电感偶合相机(intensity charged coupled device, ICCD)和单光子计数模式的雪崩光二极管，将其与激光共聚焦荧光显微镜和有关电子系统相组合，可进行多种形式的单分子荧光特性研究。包括单分子荧光成像，荧光光谱，荧光寿命及FRET。

荧光标记物

        用于单分子荧光研究的理想荧光标记物应有下述特点：耐光，不易发生光致漂白；具有高消光系数和高量子产率；易被激发，荧光强度波动小；体积小，对标记的宿主分子影响小。对于spFRET研究用的一对荧光探针，还要求 ①供、受体的激发谱有较大不同，二者的发射谱也要足够分开。但供体发射谱与受体激发谱又要有一定重叠，尽量减少供体发射的荧光漏入受体发射范围，降低激光直接激发受体的作用；②供体和受体都有相当的量子发射，保证在有FRET发生时，供、受体都有明确的强度相对变化。Cy3和Cy5是常用的一对荧光探针，二者光谱分离大，量子产率相当，在无氧环境耐光。

        总之，单分子荧光探测技术是研究单分子最灵敏的方法之一。它可提供许多有别于分子聚集态的特殊信息，将为人们研究单个分子的特殊局域环境、分子的涨落、生物大分子的柔性及其运动等提供更加有价值的信息，对生物检测的发展起到更大的推动作用。

Reference：

1. www.bioon.com.cn/ewebeditor/uploadfile/2008-1/20080112195937779.pdf  单分子对荧光共振能量转移（spFRET） 生物物理学系 郑晓惠 学号 10281034

2. www.gsc.dicp.ac.cn/jxgl/2004qjseminarkj/wh1/w21.ppt  近场光学的单分子光谱 胡庚申 

3. www.sxu.edu.cn/yjjg/jggpsys/PPT/xlt/单分子%5B第1讲%5D.pdf 单分子的光学探测与应用单分子的光学探测与应用

转载本文请联系原作者获取授权，同时请注明本文来自张文凯科学网博客。
链接地址：https://m.sciencenet.cn/blog-62133-33050.html

上一篇：序
下一篇：Progress in single-molecule tracking spectroscopy