原文链接：Development and characterization of stable anaerobic thermophilic methanogenic microbiomes fermenting switchgrass at decreasing residence times | Biotechnology for Biofuels and Bioproducts (springer.com)

摘要

背景

木质纤维素的厌氧发酵发生在自然环境和管理环境中，是碳循环的重要组成部分，也是可持续生产燃料和化学品的一条可行途径。在这些情况下，混合微生物组对木质纤维素的增溶作用非常重要。

研究结果

在此，我们报告了在不同的停留时间和中高（55 °C）温度下保持稳定发酵柳枝稷富集培养物的开发。来自消化器接种物的厌氧微生物组在 55 °C下培养，并半连续地加入含有 30 g/L中期收割的柳枝稷的培养基，以达到 20、10、5 和 3.3 天的停留时间 (RT)。在所有的停留时间内，都能获得稳定的、不随时间变化的纤维素分解产甲烷培养物，且有机酸的积累极少。在 RT = 20、10、5 和 3.3 天时，碳水化合物溶解分数分别为 0.711、0.654、0.581 和 0.538，在所有 RT 条件下，葡聚糖溶解与木聚糖溶解成正比。r=k（C-C₀f_r）公式很好地描述了溶解速率，其中C代表未利用的碳水化合物的浓度，C₀是进入生物反应器的碳水化合物（纤维素和半纤维素）的浓度，f_r是推算出的在无限停留时间内进入的碳水化合物中不易分解的部分。反应时间（RT）为3.3天是报道的稳定嗜热、甲烷发酵木质纤维素原料中最短的RT之一。进行了16S rDNA分类和宏基因组分析，以表征RT对群落动态的影响，并推断在柳枝稷转化为沼气的过程中各种微生物分类的功能角色。厚壁菌门是优势门类，随着RT的降低，其相对丰度从54%增加到96%。具有木糖代谢基因标记的Clostridium clariflavum菌株是最丰富的木质纤维素溶解细菌。热古菌门（Defluviitoga tunisiensis）是RT为20天时柳枝稷消化器中最丰富的细菌，但在较低的RT下其丰度降低，多种绿弯菌门也同样降低。共生菌门和古菌门在考察的RT范围内大致保持稳定水平。

结论

我们开发了一个系统，在该系统中，利用颗粒生物质原料——中期生长的柳枝稷，在实验室（1升）规模下很容易获得稳定的甲烷发酵稳态。结合碳水化合物溶解程度和速率的表征，以及16S rDNA和宏基因组测序，提供了对性能、物种组成、糖苷水解酶和代谢功能在不同停留时间下的多维视图。这些结果为未来涉及定义培养物的研究和生物发展工作提供了参考和指导。

图1 时间序列测量的微生物组性能。

a 生物气体的产率（mL/天）与时间的关系。

b 挥发性脂肪酸（VFA）浓度（g/L）和pH值与时间的关系。

c 碳水化合物溶解分数与时间的关系。

R1是对照反应器，其停留时间（RT）一直保持在20天。R2和R3的停留时间逐渐减少（20天、10天、5天和3.3天），每个停留时间的周期由虚黑线表示。生物气体产量每个采样间隔（1/10 RT）记录一次，并假定在每个间隔内产量恒定，将其归一化为每日速率。pH数据每5分钟自动获取一次，并对每天进行3-4个数据点的子采样以显示在图中。碳水化合物溶解分数数据是根据每个样品中加载的总碳水化合物和总残留碳水化合物计算的。酸浓度和FCS结果表示为均值±标准偏差。

图2 木聚糖和葡聚糖的溶解比较。数据与图1中报告的相同样品相关。最佳拟合线性回归曲线显示为实线黑线。

图3 总碳水化合物溶解速率 r（g 溶解的碳水化合物/L/天）与未利用碳水化合物浓度 C（g 剩余碳水化合物/L）的关系。使用R2和R3的每个停留时间（RT）的稳态溶解数据的均值（见附加文件4：表S3）来计算 C 和 r。进行线性回归，并在图中显示拟合曲线为实黑线。

图4 柳枝稷消化器中细菌和古菌16S rDNA基因的相对丰度，以门水平（a）和低至属水平（b）的分类分辨率。发酵周期按天（D）和停留时间（R）划分。左列和右列分别为接种物（I）和基质（S）的配置文件。仅在b图例中指出平均相对丰度大于1%的分类单元。关于溶解和气体组成的稳定状态通常在更改进料速率≥3个停留时间后观察到，如其他地方所述。在此3个停留时间阈值之前和之后呈现了分类配置文件。对于R2和R3反应器，在每个RT的右侧的数据，该阈值之后制作的分类配置文件数量如下：RT = 20天为3个，RT = 10天为2个，RT = 5天为3个，RT = 3.3天为1个。

图5 柳枝稷消化器微生物群落的糖类酶(CAZymes)概况和关键代谢途径。列出的每个微生物在停留时间（RT）为20、10、5和3.3天时运行的三个反应器中取样的十五个宏基因组样本中至少发现了四个。使用CheckM进行分类，如果其平均核苷酸同源性大于95％的类型菌株基因组，则手动分配物种。微生物按3.3天RT的平均相对丰度进行排序。未确定的微生物的平均相对丰度（ND），其宏基因组容器不足40％完整或污染率超过20％。较深的绿色表示更高数量的CAZyme标记。用于评估代谢潜力的标记集来自MetaCyc.org和Worm等人。完整的标记集由绿色饼图表示，而不完整的标记集（完整度大于70％）由红色和蓝色饼图表示，其中红色表示缺失标记的百分比。