Wnt信号通路在人类胚胎发育以及维持细胞干性等方面起着至关重要的作用。Wnt信号异常会导致发育相关疾病或者癌症。目前为止，已经在人类中鉴定到有19种Wnt蛋白，它们通过自分泌或者旁分泌途径在不同组织和器官中激活Wnt信号通路。未成熟的Wnt蛋白通过内质网膜上的O-酰基转移酶Porcupine （PORCN）进行脂修饰，然后由Wnt 转运蛋白Wntless（WLS）将成熟的Wnt蛋白转运到细胞外与其细胞表面受体Frizzled （FZD）和共受体LRP5/6结合，从而激活下游信号通路。尽管对于Wnt蛋白的合成，分泌以及激活下游信号通路已有大量的研究，但是仍然有很多问题亟待解决。李晓淳实验室于2022年7月在NATURE发表文章揭示了PORCN对于Wnt蛋白脂化的工作机制。

为了鉴定ER中参与Wnt蛋白合成的因子， 作者在HEK293细胞中共表达了Wnt7a-WLS-RECK复合物。电镜结构显示出一个未知内源性蛋白结合Wnt7a，质谱鉴定和AlphaFold结构预测指出该蛋白为钙网蛋白（calreticulin，CALR）。CALR的Lectin 结构域主要作用于Wnt7a 的第295位天冬酰胺糖基化修饰，此修饰位点在大部分Wnt中保守。当在Wnt7a或Wnt3a中突变掉该糖基化位点时，突变体丧失了与CALR的结合能力，同时分泌量减少，激活下游信号能力显著减弱。为了探究Wnt蛋白在被PORCN脂化时是否有CALR参与，作者共表达了PORCN和Wnt蛋白，CoIP实验显示，在Wnt蛋白存在的情况下，过表达的PORCN，内源WLS，内源CALR能够和Wnt蛋白形成四元复合物，加上对结构的分析，作者得出CALR通过稳定Wnt蛋白来帮助其从PORCN到WLS转运的结论。作者对其他18种Wnt蛋白进行氨基酸序列比对和CoIP实验，结果显示除了Wnt8a，Wnt8b，Wnt9a和Wnt9b，CALR参与其他15种Wnt的合成，揭示了CALR对于Wnt蛋白的折叠，转运和合成中具有重要作用。

CALR辅助Wnt蛋白从PORCN转运到WLS的模拟示意图

为了进一步探究Wnt蛋白是如何从WLS上释放的，作者又解析了单独的WLS结构。与Wnt7a-WLS复合物结构对比发现，复合物的WLS跨膜区间结合了一个磷脂分子，该结果与已经报道的Wnt8a-WLS结构（CELL 184:194）和Wnt3a-WLS结构（Nature Communications 12: 4541）类似。但是单独的WLS并没有结合磷脂分子，而且其跨膜区发生了显著的构像变化，使结合Wnt蛋白hairpin2和脂修饰的口袋闭合。另外，虽然磷脂分子没有直接参与和Wnt7a的互作，但是CoIP实验和分子动力学实验证明磷脂分子对于WLS结合Wnt7a非常重要，因此作者首次提出由磷脂分子介导的Wnt从WLS释放模型。有趣的是，通过分析单独的WLS结构，作者发现WLS跨膜区存在一个空腔，可以作为其抑制剂的结合位点，抑制Wnt的分泌，为靶向WLS的药物设计提供了重要依据。

此外，通过对Wnt7a-RECKCC4复合物结构的分析，作者发现作为Wnt7a的特异受体， RECK的CC4结构域结合在Wnt7a的N端结构域。参与RECK互作的氨基酸在其他17种Wnt蛋白里面是不保守的，突变二者相互作用的氨基酸会减弱Wnt7a介导的信号活性，从而揭示了RECK实现对Wnt7特异性的机理。

Wnt合成分泌以及Wnt7a信号通路示意图

总而言之，此项工作通过结构生物学，生物化学和细胞生物学的方法鉴定了第一个Wnt合成中的伴侣蛋白，提出了Wnt合成和分泌的新模型，并且阐释了Wnt7共受体的作用。此项工作为抗癌药物研发，中枢神经中血脑屏障修复提供了分子模型。

德克萨斯大学西南医学中心分子遗传系李晓淳博士为本文的通讯作者，实验室博士后齐晓峰 （现作为tenure-track Assistant Professor在西南医学中心分子生物学系成立实验室并开展独立研究）为本文的共同通讯作者兼共同第一作者，实验室博士后胡秦枥为本文的共同第一作者。

李晓淳实验室和齐晓峰实验室目前各招聘博后一名，应聘者需近一年内获得或者即将获得博士学位（生物化学，结构生物学或细胞生物学），至少发表过一篇第一作者论文。有兴趣者请发送CV至：

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xiaofeng.qi@utsouthwestern.edu

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.09.021