生物细胞中的单分子追踪

细胞参与生命活动的基础是细胞内外大量的生物大分子相互作用，发展能实时检测单个生物分子随时空变化的单分子探测和追踪技术，可以加深人们对这些交互过程的理解，研究生命过程的分子机制。

单个生物分子的探测与追踪技术大体包括三个方面：分子探针、探测技术（仪器）、图像或者数据处理方法（算法）。分子探针主要包括荧光探针（染料、蛋白、量子点等）、拉曼探针（拉曼散射子、纳米金属颗粒等），其中荧光探针已经发展非常成熟，具有各种波长和不同发光特性荧光探针。针对不同的分子探针也发展了不同的单分子探测技术，其中针对荧光探针的单分子探测技术包括荧光漂白恢复技术（FRAP :fluorescence recovery after photobleaching），荧光共振能量转移技术（FRET：(fluorescence resonance energy transfer)，荧光相关光谱技术（FCS：Fluorescence correlation spectroscopy）等。针对拉曼探针的单分子探测技术主要包括拉曼光谱和成像技术，相干拉曼散射技术，表面增强拉曼散射技术等。所有上述技术基本都是使用显微镜平台完成，特别是全内反射荧光显微镜（TIRFM）和激光共聚焦显微镜（LSCM）等。受到光学衍射极限的限制，上述光学显微镜的探测分辨率一般在波长量级，即300-500nm范围，这就要求探针的分散标记，统计意义上在探测体积内只具有一个可探测的单分子，这严重影响了单分子探测应用的进一步发展。可喜的是，从2006年以来，出现了各种超分辨成像技术，包括结构照明显微术（SIM），光活化蛋白定位显微术（PALM），随机重构光学显微术（STORM），受激辐射耗尽光学显微术（STED）等，这些显微术从不同原理上打破了光学衍射极限的限制，分别实现了100-10纳米的光学分辨率，已经接近或达到了单个生物大分子尺度，可以真正实现单个生物分子的探测。

单分子追踪的技术的第三个方面，单分子数据处理技术却遇到了很大的障碍。单分子数据处理技术基本包括单分子定位和单分子追踪两个方面，它所遇到的障碍主要是因为：（一）单分子成像的信噪比很低，已经接近当前探测器的探测极限，使得单分子定位精度降低；（二）单分子追踪图像中存在单分子的暂时消失、合并、分裂、交叉等现象，导致单分子追踪的错误；（三）有些单分子探针不能承受长时间的探测（如荧光染料漂白），使得追踪时间很短；（四）单分子不存在形状、纹理等识别特征，使得追踪困难；（五）资金和人员的投入不够，由于这种复杂的算法需要有较深的数学和计算机算法基础，同时又要对上述单分子探针和探测仪器有深入的了解，还要具有对研究对象（生物样品）的相关知识，具有多学科交叉的性质，显然这方面的科研人员极其缺乏。

近几年发展起来的单分子定位和追踪技术主要包括基于最小邻域的单分子追踪算法和基于多假设的单分子追踪方法（MHT：multi hypothesis tracking）。基于最小领域的单分子追踪算法的思想比较简单，就是在帧间单分子连接时，只连接与上一帧单分子点几何距离最短的单分子，以形成单分子的时间轨迹。该算法尽管简单但是运行的鲁棒性却很高，尽管他忽略了大量有价值的信息。基于多假设的单分子追踪方法考虑了大分子的统计运动规律，将符合某种统计运动规律的单分子点进行连接，同时也考虑了单分子的几何距离，因此是一种更高级的单分子追踪算法。由于细胞结构及内外环境的复杂性，细胞内单分子的运动规律也具有明显的差异和多样性，现有的基于多假设的单分子追踪方法主要考虑了单分子具有布朗运动规律的情况，对于非布朗运动的单分子将不能正确处理，而细胞内受限的单分子运动却具有更高的研究价值，更能反映细胞内单分子周边环境和单分子交互的丰富信息。

我给个链接http://www.microimage.com.cn/bbs/read-htm-tid-10925.html，里面有我自己写的追踪软件，欢迎指正。