极限聚合酶链反应（Extreme PCR）遇到高速熔化：离“立等可取”分子诊断更近一步

G.麦克·马克里吉奥戈斯1*

快速分子诊断的竞赛已经进行了几年。有充分的理由。在护理点诊断或监测疾病的能力对人口健康、慢性疾病缓解以及预防急性住院和再入院越来越重要。它还为临床医生提供了快速和可操作的诊断结果。（1）

尽管基于蛋白质生物标志物的检测无疑起到了并将继续发挥主要作用，但鉴于可以获得的极好的敏感性和特异性，基于DNA/RNA的诊断的兴起是不可质疑的。然而，速度并不是DNA诊断中最强的一点，因为在大多数方法中，涉及到DNA扩增步骤，这增加了一个已经耗时的样品制备步骤，这是有效的PCR和基因分型所必需的。因此，在手术过程中通过监测手术边缘突变来检测残留肿瘤的分子检测等应用还没有开始，因为在这种情况下，即使是15分钟的聚合酶链反应也可能很重。（2）

在过去的3年中，DNA扩增难题已经开始产生解决方案。2015年，犹他大学的Carl Wit-Twer和他的团队提出了一种极端的PCR，一种能在几秒钟内实现短目标DNA扩增的PCR适应方法。极限聚合酶链反应（extreme-pcr）为威特威尔实验室的主要聚合酶链反应（pcr）发展提供了长期的记录，包括快速循环聚合酶链反应（rapid cycle-pcr）、光圈测定仪（lightcycler instrument）和高分辨率熔化（hrm）2。（3）（4）（5）（6）

Extreme PCR与一个商业商标xpcr不同，通过在反应中加入10-20倍的引物和聚合酶，可以针对我们的基本PCR本能实现特定的扩增。这些量是没有严格的PCR教科书会推荐的，因为太多了聚合酶或引物在标准的PCR反应中常常导致非特异性扩增。然而，回顾性地，如果我们认为Re-agent浓度的增加是由超快的热循环速度平衡的，那么一切都是有意义的。随着引物和聚合酶浓度的增加，以实现更快的循环，特异性受到影响，但这与直接退火（引物二聚体或靶外）的时间减少是平衡的。因此，如果你在极端浓度下运行常规或快速循环的PCR，你会得到垃圾。如果你在极端速度下运行有规律的或快速的循环浓度，你就得不到（或非常低的效率）产品。如果你匹配多聚异构酶和引物浓度的增加（降低特异性），以更快的聚合酶链反应（增加特异性），你会得到金凤花。在这一发展之后，发表了更多的报告，通过在纳米颗粒或微流体平台上加热，在1-5分钟内实现聚合酶链反应，极端的聚合酶链反应仍能实现最短的扩增时间。（3）（3）（7）

在另一个违反直觉的发展中，WIT-TWER实验室显示，通过高速熔化（hsm，一种已建立的hrm的快速熔化版本）对一个pcr产品进行基因分型，当以8-16°C/s的DNA熔化速度进行时，短（<100 bp）扩增子的基因分型得到改善。该速度比标准HRM在0.01–1°C/s下逐渐加热的速度快1–2个数量级。虽然这种不可预期的观察还没有完全理解，但似乎部分原因在于限制了杂双复放大器通过重组恢复为同种复型的时间，这减少了标准HRM中的鉴别。这就解释了在HSM中观察到的更好的异源双相鉴别。（8）（8）

本期的内容包括最新加入的witwer系列PCR发展，填补了快速分子诊断难题的另一个关键部分：仪器。通过优化温度控制回路反馈，在微流控装置上实现快速温度控制，Extreme-PCR与HSM串联，产生乙肝病毒的扩增和基因分型，仅需52-87秒。尽管定量的PCR和温度精度方面仍需进一步验证微流控装置的性能。treme pcr-hsm，数据临床化学（9）艰难梭菌指出，作为一种端点方法，应用程序似乎已经很健壮了。

通过克服扩增、基因分型和仪器问题，最后一个发展完成了使基于PCR的分子诊断更接近护理点应用的剩余步骤之一。然而，如果将时间推迟几年，很少有专家预测1分钟以下的扩增和基因分型的第一个表现将来自于PCR。为什么在高温下，当使用简单的仪器和恒定的接近环境温度的恒温放大时，会发生热循环反应？事实上，使用基于核酸序列的扩增、环介导的等温扩增、重组多聚糖酶扩增、螺旋酶依赖性扩增、滚圈扩增和链位移AM-扩增的指数等温扩增可避免使用热循环器，同时也显示出耐受性。不太完美的DNA提取方法。但是，目前没有任何一种等温方法显示出稳健和可重复的扩增时间<5-10分钟，即使不计算基因分型步骤。这一进步再次提醒人们，颠覆性创新总是可以颠覆人们的期望。（10）

通过在PCR中引入退火和热循环时间作为主要变量，极限PCR与HSM和微流体相结合，为进一步的创新打开了可能。试图从对突变检测技术的影响来看这个水晶球，在较低变性温度下快速共扩增（fast cold-pcr）采用2步循环，就像极端的pcr一样，而在较低温度下大约80–87°C使用变性。降低的温度梯度要求可能使极快的冷-聚合酶链反应比极快的聚合酶链反应以更快的速度进行操作，同时也使低水平突变或最终产物测序的可能性达到突变富集和显著的HRM熔化峰。多重聚合酶链反应（multiplexed pcr）是另一个在极端聚合酶链反应（pcr）条件下可能得到提升的应用，因为大多数非特异性相互作用（引物到引物，或引物到错误模板）涉及不匹配的杂交，这比完全匹配的透射电镜板杂交需要更多的时间形成。考虑到在极端PCR中时间是一个严格控制的变量，多重极端PCR可能会出现较少的错误。结合多重混合型HRM基因分型或多重HRM扫描，这种减少可能使这种技术的先进形式。同样，等位基因特异性扩增也依赖于完全匹配与3'端不匹配杂交。因此，通过适当的优化，我们可以利用提供给聚合酶的有限时间来扩展完全匹配与不匹配的模板，从而增加等位基因。-（11）（12）（13）（14）（15）

特异性扩增基因型识别能力。另一方面，极端聚合酶链反应与taqman或分子信标基因分型相结合，将在聚合酶的路径上使用探针，可能减慢聚合酶的速度，延长扩增时间。相反，基于荧光比率的方法在不需要熔化步骤和不需要反应达到全周期的情况下产生Ge-Notypes，从而减少扩增和基因分型所需的总时间。荧光探针对反应速度的净影响有待探讨。像往常一样，有了这些抱负，魔鬼就在细节中。每种方法的可重复性和鲁棒性最终将决定其效用。

然而，随着扩增速度和基因分型速度的加快，在PCR之前不可避免的样品制备和DNA/RNA提取步骤仍然阻碍了这一进程。极端样品提取是下一个发展等待发生吗？多个EF-Fort确实正在朝着这个方向发展。看来，随着拼图的各个部分逐渐结合在一起，“立等可取”的分子诊断将早晚成为现实。（16）