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RNA 逆转录小提示 - MedChemExpress

已有 3150 次阅读 2022-6-10 09:34 |系统分类:科研笔记

Tips 1：防止 RNA 模板的降解

毫无疑问，RNA 质量对 cDNA 合成结果会产生重要影响。但 RNA 很脆弱，易于降解。为了保证 RNA 的完整性，我们需要小心又小心，比如在冰上操作，用 RNase-free 的枪头和离心管，减少操作时间等。在反应体系中加入 RNase 抑制剂也能有效防止 RNA 降解。

另外，建议在进行逆转录前，通过琼脂糖凝胶电泳检查 RNA 条带的质量。通常完整的真核 RNA 应包括 28S、18S 条带，且 28S 条带强度一般是 18S 的两倍左右。

图 1. 高质量 RNA

Tips 2：RNA 定量

除了掌握 RNA 的完整性之外，反转录之前还需要对 RNA 浓度进行测定。一般反转录试剂盒会对上样量有要求，建议 total RNA 上样量小于 5 μg。超过这个范围，会使反转录产物产生偏好性 (表达丰度高的基因优先被反转录) 而造成定量结果不准确。

Tips 3：去除基因组 DNA 污染

残留的基因组 DNA (gDNA) 会对荧光定量结果造成很大的干扰，为了使结果更加的真实、可重复，我们需要去除 gDNA 干扰。我们可以在引物设计时避免 gDNA 的扩增，比如将上下游引物分别设在不同的外显子上；或者在提取 RNA 后使用 DNase I 处理以除去 gDNA。最后，我们还有终极法宝——选择一款具有 gDNA 去除功能的逆转录试剂盒，一步到位去除 gDNA，省心省力 max。

Tips 4：选择合适的引物

Oligo dT 引物和随机引物都能进行逆转录。Oligo dT 引物只能与 mRNA 的 3’ 端 poly (A) 结合，没有 rRNA 和 tRNA 的干扰，特异性强。但其对 RNA 的完整度和二级结构的要求较高，而且不适用于原核生物。随机引物可以根据碱基情况结合到几乎所有的 RNA 上，包括 mRNA、tRNA 和 rRNA。但随机引物法逆转录产生的片段较小，很难得到全长转录本的 cDNA。

单独选择某一种引物，实验可能都不完美，具体需要根据实验目的来确定。当然我们还可以选择全都要！MCE RT mix 含有比例优化的 Oligo (dT) 和 Random Primers，使 cDNA 合成可从 RNA 转录本的各个区域起始，并具有相同的逆转录效率，最大程度保证 qPCR 结果的真实性和可重复性。

图 2. Oligo dT 引物和随机引物

Tips 5：逆转录酶热稳定性

逆转录酶在整个反转录体系中具有关键性影响。除了活性以外，逆转录酶的热稳定性同样很重要，在较高温度下进行逆转录，能够减少 RNA 的二级结构，增加逆转录的效率。野生型的 M-MLV 逆转录酶很“怕热”，高于 37℃ 时，稳定性大幅下降。

MCE 逆转录试剂盒全面升级

采用热稳定性大幅度提高的第三代逆转录酶，该酶可耐受高达 60℃ 的反应温度，适合具有复杂二级结构的 RNA 模板的逆转录。

1、逆转录温度 55℃，攻克复杂模板及高 GC 模板；
2、逆转录时间缩短至 15 min，高效逆转录；
3、合并 gDNA digester 与 gDNA digester buffer，使用更方便；
4、与模板的亲和力增强，少量模板及低拷贝基因的逆转录同样适用。

图 3. 高 GC 基因表达量测定。模板 293T 细胞，RNA 投入 300 ng，反应体系 20 μL 55℃ 反应不同时间

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