最近关于烟草的讨论比较多,看到这个文章,因为和自己的研究有点关系,就仔细认真阅读了一下,顺便摘要一下供大家欣赏。吸烟和肺癌的关系被广泛认可，对动脉硬化、高血压和糖尿病等的影响也有流行病学证据。关于吸烟和动脉瘤的关系也不断有流行病学的证据，但分子水平的证据目前尚不多。最近《Nature Medicine》发表来自山东大学泰山学者和美国学者联合的研究表明，尼古丁可以通过MAPK2a促进动脉瘤形成，给这一观点提供了分子水平上的证据。

腹主动脉瘤主要发生于60岁以上的老年人群，常伴有高血压病和心脏疾病，但年轻人也偶尔可见，男性多于女性。该病犹如体内的一颗定时炸弹，一旦破裂，死亡率高达50%-80%。

腹主动脉瘤是动脉瘤最常见的类型。在美国，腹主动脉瘤破裂是第13位死亡原因，腹主动脉瘤的具体原因目前仍不清楚。在目前已经确定的各类危险因子中，吸烟可增加腹主动脉瘤发生几率7.6倍，是唯一一种非常确认的和腹主动脉瘤形成、扩张和破裂相关的因素。但是，目前人们对吸烟引起腹主动脉瘤的具体分子机制仍不十分清楚。（该疾病的重要性，吸烟的危害性，存在的问题是不清楚机制）

 从病理学角度考虑，腹主动脉瘤的典型特征是由于弹性蛋白丢失、平滑肌细胞凋亡和胶原蛋白补偿性沉积引起的各层动脉壁扩张。活性氧被认为是联系炎症、基质降解和腹主动脉瘤病理生理学过程的共同因子。例如，动物实验结果表明，血管紧张素II可增加NADPH氧化酶产生活性氧，诱导MMP基因和蛋白表达，诱导炎症介导的腹主动脉瘤形成。尽管活性氧增加是腹主动脉瘤的重要因素，但活性氧诱导腹主动脉瘤的分子机制仍不十分清楚。

AMPK是一种丝/苏氨酸激酶，由α, β和γ三个亚单位组成，α亚单位有α1和α2两钟类型，属于催化亚单位；β和γ亚单位属于调节亚单位。AMPK可被细胞内AMP或ADP激活，被认为是细胞内能量感受器，对肌体能量代谢中发挥重要调节作用。最近有学者发现，缺氧或氧化剂，包括过氧化氢和亚硝酸阴离子，可以通过LKB1或非LKB1途径激活AMPK。因此，在血管平滑肌中氧化剂介导的AMPK激活在血管紧张素II注射和插线损伤中可抑制细胞增殖和再狭窄。但是，AMPK是否参与腹主动脉瘤的形成仍不清楚。本研究报道香烟主要成分尼古丁可激活血管平滑肌中AMPK，导致MMP2特异性表达和腹主动脉瘤形成。

研究结果：

      一、AMPK2a丢失后可阻断尼古丁诱导Ape基因敲除动物腹主动脉瘤形成。研究结果提示AMPK2a是尼古丁诱导Ape基因敲除动物腹主动脉瘤形成的关键分子。结果中发现AMPK1a不具有该效应，说明AMPK2a是特异性分子。

这个研究内容中作者使用了三种动物：Ape基因敲除、Ape基因AMPK1a基因联合敲除、Ape基因AMPK2a基因联合敲除，所有动物分尼古丁处理和对照两组。使用了大体动脉照片、腹主动脉瘤产生几率、最大动脉瘤直径、动脉体重比例、H&E, elastin and α-actin 典型染色。

二、AMPK2a丢失后可阻断尼古丁诱导Ape基因敲除动物腹主动脉瘤形成。采用上述同样的研究设计和指标，证明用血管紧张素II注射获得类似的结果。增加血压和代谢指标的检测。除血压有影响外，其他没有任何改变。

三、尼古丁和血管紧张素II可以使所有动物的发生氧化应激和炎症反应。氧化应激测定动脉组织中MDA和3-NT，炎症因子检测了血清中的炎症因子。这个结果提示，尽管尼古丁和血管紧张素II可以使动物发生氧化应激和炎症反应，但AMPK2a丢失动物不发生动脉瘤。暗示AMPK2a是氧化和炎症的执行分子。

四、骨髓来源细胞中AMPK2a基因不影响尼古丁或血管紧张素II诱导的动脉瘤形成。因巨噬细胞中AMPK1a为主，提示巨噬细胞在动脉瘤发生中不发挥作用。作者先将动物放射处理后分别移植AMPK1a或AMPK2a基因敲除动物的骨髓。结果发现，动物发生动脉瘤和骨髓来源的细胞是否有AMPK1a或AMPK2a无关，只和非骨髓细胞是否有AMPK2a有关。这个结果说明，骨髓来源的细胞中AMPK2a不影响尼古丁或血管紧张素II诱导的动脉瘤形成。这个结果提示，该基因发挥作用可能是在平滑肌细胞。（当然不能绝对）为进一步严整平滑肌细胞的重要性，作者检测了尼古丁或血管紧张素II诱导动物的MMP2水平，结果发现后者水平增加，使用MMP2 siRNA干扰将MMP2基因表达取消，则动物动脉平滑肌中MMP2的底物胶原酶IV含量下降，弹性蛋白酶降解被逆转。

五、细胞学研究证明，尼古丁可以剂量依赖性激或血管平滑肌细胞MMP2基因表达和酶活性，也可以促进AMPK2a磷酸化激活。当然有各类激活物、抑制剂、亚硝酸阴离子、血管紧张素II等的阳性对照，以及AMPK1a 和AMPK2a siRNA，结果证明AMPK2a是引起MMP2基因表达和酶活性的关键分子。这里采用逆转PCR（为什么没有用定量？）、western和酶活性电泳。

六、尼古丁诱导MMP2的效应依赖AP-2a转录活性。

因为AP-2a是MMP2的重要转录因子，上述结果发现尼古丁、血管紧张素II等促进血管平滑肌MMP2表达和活性，那么这种表达是否决定于MMP2上游转录因子就是必然的问题了。先采用AP-2a和AMPK2a siRNA（前面用过）看对MMP2表达和活性的影响，说明AP-2a和AMPK2a都是决定MMP2表达和活性的关键因素。然后用EMSA和荧光素酶报告基因方法证明尼古丁和血管紧张素II可以促进血管平滑肌细胞AP-2a的DNA结合活性。使用chromatin immune precipitation (ChIP) 分析证明AP-2a可以结合在MMP2基因的启动子上。（转录因子研究三板斧：阻断激活物、结合活性和结合部位）。

七、尼古丁和血管紧张素II可以促进AP-2a和AMPK2a相互结合。上述研究证明了AP-2a和AMPK2a在尼古丁和血管紧张素II诱导血管平滑肌中MMP2的表达和活性中的重要性。但AP-2a和AMPK2a两者之间的关系如何，仍是一个问题。由于AP-2a活性分布在细胞核，先用核成分进行western证明尼古丁和血管紧张素II可诱导AMPK2a也分布在细胞核，而且使用物质C可以逆转这种分布。采用免役共沉淀技术，证明尼古丁和血管紧张素II可以促进AP-2a和AMPK2a相互结合。用免疫荧光染色证据AP-2a和AMPK2a共同分布在细胞核内。（而AP-2a和AMPK1a无结合无共同分布）

八、AMPK可以磷酸化调节AP-2a。相互结合不等于相互调节，由于AMPK是磷酸化酶，是否可以磷酸化AP-2a？先证明尼古丁和血管紧张素II可以增加平滑肌细胞AP-2a磷酸化水平。而用 C物质抑制AMPK可以反转这个效应。再确定AMPK2a，以及AP-2a磷酸化的部位，确定磷酸化范围214–223。Ser219点突变后不能继续被磷酸化，确定磷酸化位点Ser219。然后确定功能，AP-2a点突变Ser219后，尼古丁和血管紧张素II就无法诱导MMP2，证明Ser219磷酸化是AP-2a决定转录活性的关键调节位点。

九、临床证据。采集临床患者的动脉瘤组织，证明组织中AMPK2a活性、AMPK2aThr172磷酸化水平和ACC Ser79磷酸化水平都显著增加。（怎么不测定AP-2a的活性？）

结论：尼古丁可以通过ROS–AMPK-α2–AP-2α–MMP2 pathway促进动脉瘤的形成，由于MPK-α的作用十分广泛，例如可以通过TGF-β等因子发挥作用。本研究无法概括所有的通路。

后评：本文声称过去没有研究证明吸烟和动脉瘤之间的关系，其实在2010年德国学者曾经有报道。Cigarette smoke enhances abdominal aortic aneurysm formation in angiotensin II-treated apolipoprotein E-deficient mice。Toxicol Lett. 2010 Dec 15;199(3):403-9. Epub 2010 Oct 19不过该文章没有采用注射尼古丁，而是让动物直接吸烟，虽然分子机制研究不深入，但也是针对血管紧张素，也测定了不同的MMP（包括2），而且更符合吸烟促进动脉瘤形成的结论。从相关性上，这个文章最应该作为参考文献，但作者没有引用，希望不是故意为之。

既然氧化应激是该疾病的核心机制，氢气可能对该疾病具有预防作用。本研究给相关研究提供了很好的研究模式，非常值得阅读学习。

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